Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente

• Modulo di “Microbiologia applicata all’ambiente”.

• Requisiti: buone conoscenze di microbiologia e degli aspetti ambientali della microbiologia (Corso di Biotecnologie Ambientali 3° anno LT)

Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente

• Struttura del corso:

- Breve ripasso/riesame delle tematiche principali della microbiologia ambientale (2-3 lezioni)

- Studio delle tematiche di interesse nella ricerca in microbiologia ambientale tramite lettura ed analisi di lavori scientifici (reviews, articoli di ricerca) come discussione interattiva in un Journal Club

Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente

• Prova d’esame:• 12 punti: presentazione di una tematica a partire

da lavori di ricerca• 5 punti: frequenza/partecipazione al corso• 15 punti: prova finale

- Discussione “one-to-one” di una tematica presentata negli articoli discussi durante il corso.

Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente

• Argomenti principali che verranno toccati nel corso:- Processi e microrganismi coinvolti nella degradazione di sostanze inquinanti e tecniche di biorisanamento- Ecologia microbica: metodologie di monitoraggio delle comunità microbiche e loro applicazioni. - Metagenomica: identificazione di nuove specie non coltivabili in laboratorio; applicazioni pratiche.- Utilizzo di microrganismi biosensori.

Corso di Applicazioni Biotecnologiche per l’Ambiente

• “Entry test”

(ovvero: cosa credete di sapere e cosa realmente sapete.....)

Risultati entry test

I- BiosensoriGeni controllati da un promotore di interesse

Situazione fisiologica; ceppo wild type

Rep. gene

Promotore di interesse clonatoa monte di un gene reporter

BiosensoreGene reporter: codifica una proteina la cui attività può essere facilmente saggiata;La fusione promotore::gene reporter (es. xylE::lacZ) può essere costruita inattivando l’operone originale o clonando il promotore a monte di un gene reporter, generalmente su un plasmide

Es. codificanti per geni per la degradazione

Problematiche legate ai microrganismi biosensori

• Sensibilità (deve rispondere a concentrazioni nell’ordine dei ppm (= g/ml)

• Specificità: rispondere esclusivamente al prodotto di interesse (in alcuni casi) o al più elevato numero di molecole correlate possibile

• Stabilità genetica, riproducibilità, affidabilità.

Limitare o aumentare lo spettro di azione di un biosensore?

induttore

Uni

tà g

ene

repo

rter

(-g

alatt

osid

asi)

2-nitrotoluene 4-nitrotoluene

Miglioramento genetico di ceppi biosensori

Ecologia microbica

• I microrganismi sono fondamentali nei cicli geochimici degli elementi (C, N, S, etc.) permettendo di mantenere in omeostasi (equilibrio) le diverse forme chimiche di questi elementi

• Lo squilibrio tra popolazioni microbiche diverse porta ad una perturbazione all’interno dei cicli degli elementi (e viceversa).

Ciclo dell’Azoto

La presenza di cicli geochimici in equilibrio è una delle basi dell’ “ipotesi Gaia”

• La terra è un sistema autoregolante capace di mantenere le sue caratteristiche chimico-fisiche (temperatura media, percentuali dei gas, acidità...), in condizioni idonee alla presenza della vita grazie al comportamento degli organismi viventi stessi.

(Lovelock and Margulis, 1974)

Ecologia microbica e metagenomica

• Problema principale:

Nella microbiologia “classica”, l’isolamento e la crescita come “coltura pura” sono fondamentali per lo studio e la caratterizzazione di un microrganismo.

Nelle comunità microbiche naturali, alcune reazioni metaboliche vengono effettuate da più specie: la crescita in laboratorio porta alla perdita della diversità genetica e, quindi, delle capacità metaboliche di una data comunità.

Concetto di microrganismi VBNC: “Viable but not culturable”

Lo studio delle metagenomica consente l’identificazione (almeno parziale) di nuove specie batteriche a partire dalle loro sequenze di DNA, SENZA la necessità di isolare e crescere queste specie in laboratorio.

Il problema della coltivazione

Il problema della valutazione della complessità delle comunità microbiche

• Il concetto tassonomico di “specie” è difficilmente applicabile al mondo microbico

• La tassonomia molecolare si basa sulla similarità di sequenza tra geni che costituiscono un riferimento significativo per seguire l’evoluzione delle specie (“cronometri evolutivi” es. 16S rRNA, gene rpoB)

• La differenza tra OTU (Operational Taxonomic Units) è fissata al 3% di diversità nel gene marker

• La conoscenza ed identificazione delle diverse specie è importante per l’attribuzione di funzioni metaboliche e biochimiche ad una comunità microbica

Ma la specie non è tutto....

• All’interno di una medesima specie esiste una enorme diversità genetica e metabolica, legata a presenza di elementi di DNA mobile (plasmidi, integroni, etc.) o a semplici mutazioni puntiformi

Es: isolati di Escherichia coli in grado di produrre particolari strutture extracellulari

Le tecniche molecolari

ANALISI FILOGENETICA E TASSONOMICA DELLA COMUNITA’ MICROBICA

ESTRAZIONE DNA DAL CAMPIONE AMBIENTALE

AMPLIFICAZIONE PER PCR DI UN FRAMMENTO DEL GENE

16s rRNA

ANALISI DIRETTA DELLA DIVERSITA’ DEL CAMPIONE

(es. DGGE, T-RFLP)

Identificazione molecolare dei componenti di una comunità microbica

Primer usati per la PCR:16S RNA (per Bacteria)rRNAs (universale)Per microrganismi eucarioti:18S RNAITS (internal transcribed spacer)

DNA ambientale o da coltura

Prodotti di PCR da analisi di campioni ambientali analizzati su gel d’agarosio non denaturante

I frammenti vengono separati in condizioni denaturanti(generalmente gradiente di urea)

Specifiche bande possono essere estratte e sequenziate

La DGGE è un importante tool sperimentale

Tempo (sett.): 0 4 0 4

Aggiunta benzoato + -

Monitoraggio di microrganismi in grado di degradare composti aromatici in un modello sperimentale di crescita in suoli contaminati e non.

Analisi T-RFLP (terminal restriction length

polymorphism)

ANALISI FILOGENETICA E TASSONOMICA DELLA COMUNITA’ MICROBICA

Creazione di una libreria di frammenti del gene 16S rRNA

ESTRAZIONE DNA DAL CAMPIONE AMBIENTALE

AMPLIFICAZIONE PER PCR DI UN FRAMMENTO DEL

GENE 16s rRNA

• lunghezza frammento fino a 1500 pb

• numero di cloni ottenuti: intorno ai 300-400

ANALISI DIRETTA DELLA DIVERSITA’ DEL CAMPIONE

(es. DGGE, T-RFLP)

Tre problemi nella definizione dell’ecologia microbica di un determinato (micro)ambiente

• Definizione di specie nell’ambito microbico (OTU)

• Capacità di “vedere” i microrganismi, ivi inclusi i microrganismi VBNC

• Determinare da un punto di vista statistico il numero di specie (OTUs) che ci permette una definizione sufficientemente completa di un ambiente

(Schloss and Handelsmann, Ann. Rev. Micro. 2007)

Stima della biodiversità (curve di rarefazione)

Raccolta dati

(screening dei cloni ottenuti)STIMA BIODIVERSITA’

% di differenza nella sequenza del gene marker (es. 16S RNA

Perché la definizione precisa della biodiversità è così importante?

• Conoscenza “teoretica” delle specie microbiche

• Correlare presenza di specie ad attività biologica di interesse (biorisanamento, produzione di molecole di interesse)

• Confrontare ambienti simili, ma di diversa provenienza, in termini di composizione microbica, per prevederne le caratteristiche

• Problema metodologico: significatività statistica del campione in esame

Un problema simile: uso delle parole in libri di un determinato autore (the book model)

On the

Origin of Species

The Descent of Man

The Voyage of the Beagle

The Adventures

of Huckleberry

Finn

The Adventures

of Tom Sawyer

The Portrait of a Lady

Goodnight Moon

n1The (10,196)

The (22,164)

The (16,924) And (6228) The (3681) The (8449) Goodnight

(20)

n2 Of (7396) Of (12,304) Of (9429) The (4771) And (3000) To (7469) And (17)

n3 And (4387) In (7547) And (5765) I (3210) A (1795) Of (6592) A (10)

n4 In (3920) And (7342) A (5325) To (2914) To (1705) A (5485) The (6)

n5 To (3567) To (5743) In (4288) A (2911) Of (1446) She (4772) Little (4)

n6 A (2473) A (4412) To (4091) It (2279) He (1181) And (4504) Of (3)

n7 That (2059) That (3529) Is (2413) Was (2063) Was (1166) Her (4480) Moon (3)

n8 Have (1760) Is (3237) It (1998) He (1667) It (1116) I (4076) 20 words used twice

n9 Be (1655) As (3134) That (1940) Of (1641) In (937) That (3735)

n10 As (1579) Are (2522) On (1868) In (1428) That (890) You (3735)

ST 7426 14,557 12,726 7263 8111 12,427 55

NT 150,951 272,296 205,424 110,271 70,030 230,485 151

St: numero totale di singole parole utilizzateNt: numero totale di parole nel libro

Annual Reviews

Annual Reviews

Confronto di comunità microbiche nei suoli dell’Alaska (a-b) e del Minnesota (c-d)

Annual Reviews

Handelsman, J.. 2004. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68(4):669-685

FIG. 1. Phylogenetic tree of Bacteria showing established phyla (italicized Latin names) and candidate phyla described previously (70, 74, 114) with the November 2003 ARB

database (http://arb-home.de) (90) with 16,964 sequences that are >1,000 bp

Nitrospira: nuovo genere di batteri nitrificanti (ossidazione di nitrito a nitrato)