Progetto Regione Emilia-Romagna fiStudio e modellazione ......Met Lys Ile Leu N-Leu Phe....

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Progetto Regione Emilia-Romagna Studio e modellazione degli aspetti enzimatici legati alla stagionatura del formaggio Parmigiano-Reggiano Azione 3: Aspetti enzimatici legati alla stagionatura del Parmigiano-Reggiano Fase 1: Determinazione delle caratteristiche microbiologiche e chimiche dei campioni scelti

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  • Progetto Regione Emilia-Romagna

    Studio e modellazione degli aspetti enzimatici legati alla stagionaturadel formaggio Parmigiano-Reggiano

    Azione 3: Aspetti enzimatici legati alla stagionatura del Parmigiano-Reggiano

    Fase 1: Determinazione delle caratteristiche microbiologiche e chimiche dei campioniscelti

  • EVOLUZIONE DELLA FRAZIONE AMMINOACIDICA EEVOLUZIONE DELLA FRAZIONE AMMINOACIDICA EOLIGOPEPTIDICANEL FORMAGGIO PARMIGIANO-REGGIANOOLIGOPEPTIDICANEL FORMAGGIO PARMIGIANO-REGGIANO

    NEI PRIMI MESI DI STAGIONATURANEI PRIMI MESI DI STAGIONATURA

    Dipartimento di Chimica Organica ed IndustrialeFacoltà di Agraria

    Università di Parma

    Rosangela MarchelliArnaldo Dossena

    Stefano SforzaGianni GalavernaValeria Cavatorta

    Fausto Stefani

  • LA PROTEOLISI NEL PARMIGIANO-REGGIANOLA PROTEOLISI NEL PARMIGIANO-REGGIANOEnzimi responsabili del processo proteolitico e loro origine

    CASEINA

    Chimosina

    PlasminaAmmino acidi

    Di- tripeptidiOligopeptidi

    FORMAGGIO

    LISI

    Proteasi intracellulari

    Sistemi di trasporto

    Proteasi associate alla parete cellulare

    Endoproteasi

    Amminoproteasi

    Tripeptidasi

    Dipeptidasi

    Lactobacillus

    LatteLatte

    CaglioCaglio

    ProteasiProteasiassociateassociatealla paretealla paretecellularecellulare

    SieroinnestoSieroinnesto

  • Il gruppo di ricerca si propone:● Lanalisi quantitativa del contenuto amminoacidico dei campioni

    ● Lanalisi della frazione peptidica a basso peso molecolare (

  • ANALISI DEGLI AMMINOACIDIANALISI DEGLI AMMINOACIDI

    5g formaggio +500µl D-L Nor-Leucina+50 ml H2O bidistillata

    Analisi HPLC-FLD

    Essiccazione

    omogeneizzazione

    derivatizzazione

    Filtrazione su carta

    Centrifugazione (4°C)

    Deproteneizzazione (7,5 ml TFA) 20 min

    Estrazione fase lipidica

    Filtrazione (0,45 µm)

    Neutralizzazione con NaOH 1 N

    Purificazione medianteScambio ionico

    Essiccazione

    Neutralizzazione con NaOH 1 N

    Essiccazione e ridissoluzione in

    1 ml di H2O bidistillata

  • mV

    0.00

    20.00

    40.00

    60.00

    80.00

    100.00

    120.00

    140.00

    Minutes12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00

    15.0

    90

    16.6

    40 17.5

    8418

    .402

    18.8

    14 19.5

    80

    23.6

    3424

    .246

    25.7

    21

    28.3

    31

    33.6

    66

    34.9

    8035

    .663

    37.8

    42

    39.0

    0839

    .836

    40.4

    9841

    .242

    41.7

    98Asp

    Ser Glu His

    Thr

    Arg

    Ala Pro

    Tyr

    ValGly Met

    Lys Ile Leu

    N-Leu

    Phe

  • AMMINOACIDI TOTALIAMMINOACIDI TOTALI

    Non emergono differenze significative nella quantità totale di amminoacidi traparte esterna e parte centrale della forma fino al 2° mese.Una certa disomogeneità compare dal 3° mese per poi accentuarsi al 6°, conprevalenza di amminoacidi nella parte esterna.

    01000

    20003000

    400050006000

    70008000

    900010000

    0 50 100 150 200 250 300giorni di stagionatura

    a.a.

    tota

    li (m

    g/10

    0g s

    .s.) esterno forma

    centro forma

  • Asp3%

    Ser6%

    Glu15%

    Gly2%

    His6%

    Arg7%

    Thr3%Ala

    5%Pro9%

    Tyr3%

    Val6%

    Met2%

    Lys16%

    Ile4%

    Leu9%

    Phe4%

    Distribuzione percentuale degli amminoacidi a 1 mese di stagionaturaDistribuzione percentuale degli amminoacidi a 1 mese di stagionatura

    ESTERNO FORMA

    Asp3% Ser6%

    Glu18%

    Gly2%

    His5%

    Arg7%

    Thr3%Ala

    5%Pro10%

    Tyr3%

    Val6%

    Met2%

    Lys16%

    Ile3%

    Leu8%

    Phe3%

    CENTRO FORMA

    Nessuna differenza significativa nella distribuzione percentuale tra le due zone

  • ESTERNO FORMA CENTRO FORMA

    Asp3% Ser

    8%

    Glu19%

    Gly2%

    His5%

    Arg3%

    Thr5%

    Ala2%

    Pro10%

    Tyr1%

    Val7%

    Met2%

    Lys14%

    Ile6%

    Leu9%

    Phe4%

    Asp3% Ser7%

    Glu20%

    Gly2%

    His5%

    Arg3%

    Thr4%Ala

    2%Pro10%

    Tyr1%

    Val7%

    Met2%

    Lys15%

    Ile5%

    Leu10%

    Phe4%

    Distribuzione percentuale degli amminoacidi a 6 mese di stagionaturaDistribuzione percentuale degli amminoacidi a 6 mese di stagionatura

    Nessuna differenza significativa nella distribuzione percentuale tra le due zone

  • Distribuzione percentuale degli amminoacidi a diversi tempi diDistribuzione percentuale degli amminoacidi a diversi tempi distagionaturastagionatura

    Asp3%

    Ser6%

    Glu15%

    Gly2%

    His6%

    Arg7%

    Thr3%Ala

    5%Pro9%

    Tyr3%

    Val6%

    Met2%

    Lys16%

    Ile4%

    Leu9%

    Phe4%

    1 mese di stagionatura

    Asp3% Ser

    8%

    Glu19%

    Gly2%

    His5%

    Arg3%

    Thr5%

    Ala2%

    Pro10%

    Tyr1%

    Val7%

    Met2%

    Lys14%

    Ile6%

    Leu9%

    Phe4%

    6 mesi di stagionatura

    Dimnuisce la percentuale di arginina, alanina e tirosinaAumenta la percentuale di acido glutammico, serina, isoleucina

  • 0

    200

    400

    600

    800

    1000

    1200

    1400

    1600

    0 50 100 150 200 250 300giorni di stagionatura

    mg/

    100

    g s.

    s.

    ArgTyrGlu

    I dati indicano un cambiamento nella produzione di amminoacidi apartire dal 2°-4° mese di stagionaturaQuesto cambiamento comporta un arresto nella produzione di Arg eTyr (o una loro degradazione) ed un incremento nella produzione diGlu

  • Estrazione

    Ultrafiltrazione

    10 g di formaggio + 2,5 ml di Phe-Phe 1 mM +45 ml di HCl 0,1 N (deproteinizzazione)

    Filtrazione su carta

    Estrazione della frazione lipidica

    Filtrazione a 0,45 µm

    Prelievo di un'aliquota di 3 ml di estratto

    Evaporazione totale del solvente

    Recupero del campione con 900 µl di soluzioneacquosa di ac. Formico 0,1 %

    Filtrazione a 10000 Da

    3 lavaggi di recupero

    Essiccazione completa del filtratosotto flusso di azoto

    Filtrato

    Filtrato

    ANALISI DEI PEPTIDIANALISI DEI PEPTIDI

  • ANALISI HPLC/MS DEI PEPTIDIANALISI HPLC/MS DEI PEPTIDISeparazione analitica Rivelazione

    � HPLC a fase inversa

    � Colonna C18

    � Eluente a gradiente H2O-CH3CN acidificati(ac. formico 0,1 %)

    Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00

    %

    0

    10015.04

    6.34

    5.304.42

    3.22

    6.65

    6.89

    10.81

    15.28

    15.68

    15.84

    27.42

    16.40

    24.46

    22.95

    42.99

    27.9037.64

    32.77

    30.77

    49.78

    47.94

    50.9062.00

    57.04 65.51

    74.3767.75

    TICTIC

    Phe-Phe

    Interfaccia ESI

    Zona dicollisione insorgente

    Spettrometro di massa asingolo quadrupolo con

    interfaccia ESI

  • Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00

    %

    0

    10015.04

    6.34

    5.304.42

    3.22

    6.65

    6.89

    10.81

    15.28

    15.68

    15.84

    27.42

    16.40

    24.46

    22.95

    42.99

    27.9037.64

    32.77

    30.77

    49.78

    47.94

    50.9062.00

    57.04 65.51

    74.3767.75

    IDENTIFICAZIONE DEI PEPTIDIIDENTIFICAZIONE DEI PEPTIDIElaborazione dei dati: semiquantificazione

    m/z300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

    %

    0

    100706.4

    642.3

    588.9

    542.2

    697.1

    784.7

    719.4

    882.7

    811.1

    1008.7

    888.8 945.0 1171.61133.5

    mass5900 6000 6100 6200 6300 6400 6500 6600 6700 6800 6900 7000 7100

    %

    0

    1007054.0

    m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

    %

    0

    100706.4

    642.3

    588.9

    100.1

    543.7323.1162.9527.3

    784.7

    882.7

    799.01008.6

    898.7

    945.01026.9 1176.51030.8 1259.4 1317.7

    TICTICSpettro di massaSpettro di massa

    Spettro di massaSpettro di massaricostruitoricostruito

    Picchi caratteristiciPicchi caratteristici

  • SEMIQUANTIFICAZIONE DEI PEPTIDISEMIQUANTIFICAZIONE DEI PEPTIDI

    Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00

    %

    0

    10054.71

    XICXICArea del piccoArea del picco

    Calcolo del rapporto tra l'areagenerata dal peptide e l'areadello standard interno

    Correzione del dato ottenuto in baseal contenuto di umidità

    Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00

    %

    0

    10054,55

    56471152

  • Peptide

    Frammentazione

    IDENTIFICAZIONE DELLA SEQUENZA ESATTA DEI PEPTIDIIDENTIFICAZIONE DELLA SEQUENZA ESATTA DEI PEPTIDITRAMITE CONFRONTO CON LE SEQUENZE CASEINICHE ETRAMITE CONFRONTO CON LE SEQUENZE CASEINICHE E

    FRAMMENTAZIONE IN SORGENTEFRAMMENTAZIONE IN SORGENTE

    m/z280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800

    %

    0

    100788.3

    657.2

    528.2

    399.2

    354.0329.2286.2 371.2 413.8

    529.3

    548.1640.3

    658.2

    684.8

    789.3

    B (n-1)

    B (n-2)

    B (n-3)B (n-4)

    L LEE

    � Individuazione, in base al pesomolecolare del peptide, dellepossibili sequenze caseiniche

    � Calcolo dei frammenti teorici

    � Confronto dei frammenti teoricicon quelli presenti nello spettro

    Attribuzione dellasequenza caseinica, tra le

    diverse possibili.

  • CARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE PEPTIDICACARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE PEPTIDICA

    TR PM Sequenza TR PM Sequenza TR PM Sequenza TR PM Sequenza25,3 416 β CN(1-3) 48,2 2042 β CN(103-119) 10,0 874 36,4 1991 αS1 CN(1-17)25,4 545 β CN(1-4) 51,6 1122 β CN(111-119) 24,4 536 αS1 CN(1-4) 37,8 755 αS1 CN(10-16)25,4 1404 β CN(71-83) 55,2 7182 β CN(99-160) 24,4 745 αS1S1 CN(1-6) 38,3 1877 αS1 CN(1-16)26,4 1001 β CN(97-105) 55,5 7054 β CN(99-159) 26,2 707 αS1 CN(30-35) 42,4 601 αS1 CN(16-20)37,1 1510 β CN(82-95) 57,5 1151 β CN(199-209) 26,4 1132 αS1 CN(154-162) 46,1 2836 αS1 CN(174-199)39,3 1703 β CN(16-28) +3P 61,8 1717 β CN(194-209) 27,4 1535 αS1 CN(1-13) 49,9 905 αS1 CN(17-23)39,4 787 β CN(1-6) 62,1 1589 β CN(195-209) 28,8 1664 αS1 CN(1-14) 49,9 791 αS1 CN(18-23)40,4 1999 β CN(14-28) +4P 62,4 1881 β CN(193-209) 30,8 414 αS1 CN(10-13) 50,0 3452 αS1 CN(157-188)40,6 1790 β CN(130-144) 74,3 4696 β CN(51-93) 30,9 734 αS1 CN(186-192) 50,2 805 αS1 CN(24-30)41,3 2098 β CN(13-28) 74,4 4454 β CN(53-93) 32,4 1495 αS1 CN(24-36) 51,4 2764 αS1 CN(1-23)41,6 3132 β CN(98-124) 74,5 4253 β CN(55-93) 32,7 542 αS1 CN(10-14) 55,3 1246 αS1 CN(14-23)42,2 2746 β CN(159-183) 74,8 4024 β CN(57-93) 34,1 1348 αS1 CN(25-36) 56,9 1237 αS1 CN(24-34)43,3 2212 β CN(174-192) TR PM Frammenti 34,9 1138 αS1 CN(113-122) 58,5 3860 αS1 CN(83-114)47,8 754 β CN(47-52) 6,2 1140 αS1 CN(1-9) 36,3 1198 αS1 CN(23-32) 58,6 4238 αS1 CN(80-114)

    αS1 CN(1-7)

    PM TR Sequenza260 29,7260 29,9294 31,9

    γ-glu-ileγ-glu-leuγ-glu-phe

  • EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICOEVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO

    Andamento complessivo deipeptidi

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    2 30 60 90 120 180 240

    0

    2

    4

    6

    8

    10

    12

    14

    16

    18

    20

    22

    24

    0 12 48

    0

    2

    4

    6

    8

    10

    12

    14

    16

    18

    20

    22

    24

  • 2 30 60 90 120 180 2400,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    ● con un massimo a tempo zero

    I tre gruppi di peptidi:

    Andamento complessivo deipeptidi

    0 12 48

    0,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    2 30 60 90 120 180 240

    0

    2

    4

    6

    8

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    0 12 48

    0

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    18

    20

    22

    24

    EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICOEVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO

  • 0 12 48

    0,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    2 30 60 90 120 180 240

    0

    2

    4

    6

    8

    10

    12

    14

    16

    18

    20

    22

    24

    Andamento complessivo deipeptidi

    0 12 48

    0

    2

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    6

    8

    10

    12

    14

    16

    18

    20

    22

    24

    I tre gruppi di peptidi:

    ● con un massimo a tempo zero● con andamento crescente

    2 30 60 90 120 180 240

    0,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    siEVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICOEVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO

  • 2 30 60 90 120 180 240

    0

    2

    4

    6

    8

    10

    12

    14

    16

    18

    20

    22

    24

    Andamento complessivo deipeptidi

    0 12 48

    0

    2

    4

    6

    8

    10

    12

    14

    16

    18

    20

    22

    24

    I tre gruppi di peptidi:

    ● con un massimo a tempo zero● con andamento crescente● con massimo

    2 30 60 90 120 180 240

    0,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    0 12 48

    0,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICOEVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO

  • 2 30 60 90 120 180 2400,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    0 12 480,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    αS1 CN f (1-23)

    αS1 CN f (24-34)

    ß CN f (193-209)

    ß CN f (99-159)

    ß CN f (99-160)

    ... Leu Arg Phe Phe Val Ala21 22 23 24 25 26

    ... Phe Leu Leu Tyr Gln Glu190 191 192 193 194 195

    ... Val Ser Lys Val Lys Glu95 96 97 98 99 100

    aS1

    ß

    ßCHIMOSINA

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:Peptidi con un massimo al tempo zeroPeptidi con un massimo al tempo zero

  • ENZIMI ENDOGENI DELLATTE

    2 30 60 90 120 180 2400,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    0 12 480,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    αS1 CN f (1-23)

    αS1 CN f (24-34)

    ß CN f (193-209)

    ß CN f (99-159)

    ß CN f (99-160)

    ... Leu Arg Phe Phe Val Ala21 22 23 24 25 26

    ... Phe Leu Leu Tyr Gln Glu190 191 192 193 194 195

    ... Val Ser Lys Val Lys Glu95 96 97 98 99 100

    aS1

    ß

    ßCHIMOSINA

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:Peptidi con un massimo al tempo zeroPeptidi con un massimo al tempo zero

  • 2 30 60 90 120 180 2400,00

    0,25

    0,50

    0,75

    1,00

    1,25

    1,50

    1,75

    2,00

    2,25

    2,50

    Max a 30Max a 60Max a 90Max a 120

    Giorni di stagionaturaOre di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    0 12 480,00

    0,25

    0,50

    0,75

    1,00

    1,25

    1,50

    1,75

    2,00

    2,25

    2,50

    EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:Peptidi con un massimo tra il primo ed il secondo mesePeptidi con un massimo tra il primo ed il secondo mese

  • Molti derivano dalla successiva degradazione di peptidi di origine chimosinica

    2 30 60 90 120 180 2400,00

    0,25

    0,50

    0,75

    1,00

    1,25

    1,50

    1,75

    2,00

    2,25

    2,50

    Max a 30Max a 60Max a 90Max a 120

    Giorni di stagionaturaOre di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    0 12 480,00

    0,25

    0,50

    0,75

    1,00

    1,25

    1,50

    1,75

    2,00

    2,25

    2,50

    FRLLNENLVEQPLGQHKIPHKPR

    2322212019181716151413121110987654321

    FRLLNENLVEQPLGQHKIPHKPR

    2322212019181716151413121110987654321

    1-23

    1-16

    1-17 18-23

    1-14

    1-13

    10-14

    10-16

    10-13

    1-9

    1-7

    1-4

    1-6

    14-23

    17-23

    16-20

    1-16

    1-17 18-23

    1-14

    1-13

    10-14

    10-16

    10-13

    1-9

    1-7

    1-4

    1-6

    14-23

    17-23

    16-20

    1-16

    1-17 18-23

    1-14

    1-13

    10-14

    10-16

    10-13

    1-9

    1-7

    1-4

    1-6

    14-23

    17-23

    16-20

    EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:Peptidi con un massimo tra il primo ed il secondo mesePeptidi con un massimo tra il primo ed il secondo mese

  • 2 30 60 90 120 180 2400,00

    0,25

    0,50

    0,75

    1,00

    1,25

    1,50

    1,75

    2,00

    2,25

    2,50

    Max a 30Max a 60Max a 90Max a 120

    Giorni di stagionaturaOre di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    0 12 480,00

    0,25

    0,50

    0,75

    1,00

    1,25

    1,50

    1,75

    2,00

    2,25

    2,50

    ESO- ed ENDO-PEPTIDASIBATTERICHE

    EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:Peptidi con un massimo tra il primo ed il secondo mesePeptidi con un massimo tra il primo ed il secondo mese

  • ß CN f (16-28)3P

    ß CN f (14-28)4P

    ß CN f (174-192)

    αS1 CN f (83-114)

    0 12 480,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    2 30 60 90 120 180 2400,0

    2,5

    5,0

    7,5

    10,0

    12,5

    15,0

    17,5

    20,0

    22,5

    25,0

    ... Ile Ile ...26 27 28 29 30 31

    ... Val Pro ...167 168 169 170 171 172

    ... Ile ...77 78 79 80 81 82

    Asn Lys Lys Glu

    Gln Ser Lys Leu

    Glu Gln Lys His GlnaS1

    ß

    ß

    PLASMINA e AMMINOPEPTIDASI

    Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:Peptidi con andamento crescentePeptidi con andamento crescente

  • γ-glu-ileγ-glu-leuγ-glu-phe

    NH

    H2N

    COOH

    O COOH

    ?-Glu-Phe

    EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:Peptidi con andamento crescentePeptidi con andamento crescente

    Peptidi di neo-formazione (NON di derivazione proteolitica)probabilmente generati da unattività γ-glutamiltranspeptidasica

  • Non si notano sostanzialidifferenze tre le zone dicampionamento

    Fino a due mesi lesterno è piùpovero di peptidi derivati dallachimosina, ad indicare unattivitàproteolitica più intensa nella parteesterna della forma

    Fino a due mesi i peptidi formatidai batteri lattici si formano e sidegradano più rapidamenteallesterno

    Giorni di stagionaturaOre di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    Giorni di stagionaturaOre di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    Giorni di stagionaturaOre di stagionatura

    Som

    ma

    A/A

    si

    2 30 60 90 120 180 240

    0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00

    CentroEsterno

    0 12 48

    0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00

    0 30 60 90 120 180 2400,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00

    CentroEsterno

    2 30 60 90 120 180 240

    0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00

    CentroEsterno

    0 12 48

    0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00

    0 12 48

    0,000,501,001,502,002,503,00

    3,504,004,505,005,506,006,507,007,50

    8,00

    DISTRIBUZIONE DEL PATTERN PEPTIDICO NELLA FORMADISTRIBUZIONE DEL PATTERN PEPTIDICO NELLA FORMA

    Nella parte esterna della forma viè una maggior proliferazionebatterica, ma la disomogeneità daessa provocata scompare a partiredal secondo-terzo mese

  • PRIME CONCLUSIONI:PRIME CONCLUSIONI:LLEVOLUZIONE NEL TEMPO DELLA FRAZIONEEVOLUZIONE NEL TEMPO DELLA FRAZIONE

    AMMINOACIDICA E PEPTIDICAAMMINOACIDICA E PEPTIDICANel periodo che va dalla produzione al 10°mese di stagionatura i dati su amminoacidi e peptidiindicano due momenti ben distinti:

    Da 0 a 2°-4° mese: - tutti gli amminoacidi in crescita costante ed omogenea tra esterno ed interno- i peptidi presenti provengono essenzialmente dalla parte N-terminale dell’αS1 caseina e dalla parte C-terminale della β-caseina- Disomogeneità nel contenuto peptidico tra esterno ed interno- Prevalenza dell’azione enzimatica del caglio e dei batteri lattici

    Da 2-4° mese al 10° mese: - alcuni amminoacidi non aumentano più (Arg, Tyr, Ala), altri accelerano la loro crescita (Glu, Ser, Ile), con una certa disomogeneità tra esterno ed interno- I peptidi precedentemente presenti cominciano a scomparire e compaiono nuovi peptidi (parte centrale dell’αS1 caseina, fosfopeptidi dalla β-caseina, γ-glutamilpeptidi)- Omogeneità del contenuto peptidico tra esterno ed interno della forma- Prevalenza di nuove azioni enzimatiche (plasmina, amminopeptidasi, γ-glutamiltranspeptidasi)

    Dal 10° mese in poi: ………..