Prof. Giorgio Sartor · •Molluschi –Cefalopodi Chiroteuthispicteti Cypridinahilgendorfiis

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Bioluminescenza

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Prof. Giorgio Sartor

gs © 2001-2014 ver 1.2 Bioluminescenza - 2 -

Luminescenza

• Emissione della luce in seguito al passaggio dallo stato eccitato allo stato fondamentale di un elettrone;

• Lo stato eccitato viene raggiunto a seguito di una somministrazione di energia.

2


Luminescenza


Luminescenza

corrente elettrica in gas ionizzato o semiconduttoreElettroluminescenza

materiale radioattivo incorporato nel fosforo

Radioluminescenza

reazione chimicaChemiluminescenza

reazione enzimaticaBioluminescenza

temperatura e radioattivitàTermoluminescenza

rottura di cristalliTriboluminescenza

onde sonore in liquidiSonoluminescenza

assorbimento di luceFotoluminescenza

CAUSATIPO

3


Le transizioni elettroniche

S0

S1

T1

Assorbimento

Fluorescenza

Fosforescenza

Intersystem crossing

Conversione interna

Ener

gia

Stato fondamentale

Stato di singoletto eccitato

Stato di tripletto


Chemiluminescenza• La luminescenza che viene emessa nel corso di una

reazione chimica ha a che fare in genere con un’ossidazione. L’ossidazione può avvenire a causa di acqua ossigenata e dell’ossigeno atmosferico come nel Luminolo

NH

NH

O

O

NH2

O

O

O

O

NH2

N

N

O

O

NH2

O

O

O

O

NH2

2O-O2

*

hν

4


Bioluminescenza• Il fenomeno della bioluminescenza è proprio di

alcuni organismi marini:

Microrganismi

Celenterati Teleostei


Bioluminescenza• … e terrestri:

InsettiAnellidi

Funghi

5


Bioluminescenza

• L’uso che gli organismi fanno della bioluminescenza sono molteplici:– Comunicazione– Difesa– Attacco– Predazione– Illuminazione – Mimetismo– …– Vantaggio riproduttivo


La luce in fondo al mare

6


Bioluminescenza

• L’emissione della luce da parte di un organismo può essere dovuta a:– bioluminescenza propria dell’organismo

(lucciole, batteri o protozoi ecc.);– la presenza di batteri simbionti;

• In ogni caso la luminescenza è prodotta da un meccanismo molecolare che coinvolge delle reazioni di ossidoriduzione.


Organismi marini

• Batteri e protozoi

• Celenterati

Pyrocystis fusiformis

Renilla koellikeri

Aequorea victoria

7


Organismi marini

• Molluschi–Cefalopodi

Chiroteuthis picteti

Cypridina hilgendorfiis

http://www.youtube.com/watch?v=_QUt-Rrs6Co

http://www.youtube.com/watch?v=SfNBLR72W7g&NR=1

• Crostacei–Ostracodi


Organismi marini

• Teleostei– Stomiatoidei– Mictofidi

Pachystomias microdon

Argyropelecus hemigymnus

8


Photoblepharon

• Possiede un sistema per aprire e chiudere l’organo fotoforo.


Batteri simbionti• Il batterio marino Vibrio fischeri in

natura esiste allo stato plantonico o come simbionte di pesci e seppie luminescenti

• Colonizza organi specializzati nell’animale ospite (Euprymna scolopes, Anomalops katoptron, Photoblepharon) che usa la luminescenza di V. fischericome esca per le prese o come camuffamento dalla luce lunare,

• La sorgente di luce sono i batteri che allo stato libero non emettono luce.

• Il meccanismo con il quale V. fischeriregola la propria bioluminescenza èlegato alla presenza di un segnale chimico di consenso.

9


N-acil-L-omoserina lattone (AHL)


Batteri simbionti• Il segnale di consenso è legato alla sintesi e

all’accumulo del segnale chimico di consenso (3-osso-C6-HSL, AHL).

• In V. fischeri, il segnale è sintetizzato dalla proteina LuxI e raccolto dalla proteina LuxR.

• Quando V. fischeri è a bassa densità il segnale chimico è basso.

• Quando la densità cresce (nei organi fotofori) il segnale si accumula ed interagisce con LuxR.

• Il complesso LuxR/AHL si lega alla regione del DNA chiamata “lux box” causando l’attivazione del gene per la sintesi delle proteine che provocano la bioluminescenza.

CH3 NH

O O

O

O

10


Batteri simbionti

• Inoltre, il complesso LuxR/AHL provoca la biosintesi di AHL (via LuxI) la cui sintesi viene quindi autoindotta

• Allo stato planctonico i batteri sono “spenti”mentre nei fotofori di Photoblepharon sono luminosi.

CH3

S

O O

CH3

N

O

N

N

OH

OH

N

NH2

S+

CH3

OO

NH2

CH3

NH

O O

O

O

N

O

N

N

OH

OH

N

NH2

S

CH3

SH *ACP

ACP +

LuxI

SAM

+ +

MTA

3P2H


Bioluminescenza

• Luminescenza prodotta da reazione catalizzate da enzimi.

• Fotoproteine.

11


Luciferasi• Le luciferasi appartengono ad una classe di enzimi redox che

hanno affinità diverse per le diverse luciferine:– EC 1.13.12.5

• Renilla-luciferina 2-monoossigenasi; Renilla-type luciferasi; Aequorina; Obelina; Luciferase (Renilla luciferina)

– EC 1.13.12.6• Cipridina-luciferina 2-monoossigenasi; Cipridina-type luciferasi;

Luciferasi (Cipridina luciferina); Cipridina luciferasi

– EC 1.13.12.7• Fotinus-luciferina 4-monoossigenasi (ATP-asi); Luciferasi delle lucciole;

Photinus pyralis luciferasi

– EC 1.13.12.8• Watasenia-luciferina 2-monoossigenasi; Watasenia-type luciferasi

– EC 1.13.12.13• Oploforus-luciferin 2-monoossigenasi; Oploforus luciferasi

– EC 1.14.99.21• Latia-luciferina monoossigenasi (demetilante); Luciferasi (Latia

luciferina)


2D1S

12


Gruppi prostetici di fotoproteine• Responsabili

dell'emissione di luce sono, generalmente, proteine che permettono l'ossidazione di un gruppo prostetico.

• I gruppi prostetici sono diversi tra i vari organismi, anche se vengono spesso chiamati con lo stesso nome di luciferina.

N

SS

N

OH

HCOOH

N

SS

N

OH

O

D(-) Luciferina

Ossiluciferina


Gruppi prostetici di fotoproteine• In mare

NN

NH

R'

RO

NH

NH

NHNH CH3

OH

CH3

OO

O

O

O O

CH3

CH2

CH3

NN

NH

O

CH3

NH

CH3

NH

NH2

NH

CH3 CH3

CH3

CH3

O O

H

Cipridina Luciferina

(Vargulina)

Celenterazine

-H-OH-SO4H

-

Luciferinadei dinoflagellati

-OH-SO4H

-

Luciferina

di Latia (Latiidae)

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NN

NH

R'

RO

NH

NH

NHNH CH3

OH

CH3

OO

O

O

O O

CH3

CH2

CH3

NN

NH

O

CH3

NH

CH3

NH

NH2

NH

CH3 CH3

CH3

CH3

O O

H

Cipridina Luciferina

(Vargulina)

Celenterazine

-H-OH-SO4H

-

Luciferinadei dinoflagellati

-OH-SO4H

-

Luciferina

di Latia (Latiidae)

Gruppi prostetici di fotoproteine• In mare


Celenterazine

NN

NH

R'

RO

-OH

-OSO3H

-OH

R’

Oplophorus gracilorostris

Watasenia scintellans

Renilla kolikeri

Origine

-OH

-OSO3H

-H

R

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Meccanismo


Bioluminescenza • In alcune

specie l’ossidazione èprovocata da una LUCIFERASI ATP dipendente con rilascio di AMP e ossiluciferina.

AMP

LH2

E

AMPL*

EEAMP

L

S

N

S

N

HH

H

COOH

OH

O

PO

P

O

OO

OO

S

N N

H

H

O

OH S

O2

hν

E

ATP + LH2

Mg++

PP

CO2

AMP + L

D(-)luciferina

Ossiluciferina+ O2 + ATP

+ CO2 + AMP + + hν (562 nm)

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Sistema luciferina-luciferasi

N

SS

N

OH

HCOOH N

SS

N

-O

H O

O

P

O

ONO

N

N

OHOHN

NH2

O

N

SS

N

-O

O

O

P

O

ONO

N

N

OHOHN

NH2

OO

O

N

SS

N

-O

O

OO

ATP PPi

O2

Mg2+

LuciferinaLuciferasi

(EC 1.13.12.7)

Luciferasi

Luciferina-Adenilato

Perossiluciferina-Adenilato

AMP

Perossido cilclico

LuciferasiLuciferasie-



N

SS

N

-O

O

O

O

N

SS

N

-O

OH

N

SS

N

-O

O

N

SS

N

O

O

O

O

N

SS

N

OH

O

CO2

Luciferasi

* *

Decarbossilazione

- .

Ossiluciferina

Stabilizzazione dello stato eccitato per risonanza

Luciferasi

libera

hν

16


Bioluminescenza • Il processo

ossidativo viene catalizzato da LUCIFERASI che hanno una LUCIFERINA come gruppo prostetico e che utilizzano come sorgenti di elettroni una deviazione della catena respiratoria



• In alcuni organismi può essere alimentato da elettroni provenienti dalla catena respiratoria batterica, una frazione di e- viene trasferita dal substrato all'ossigeno.

N

SS

N

OH

HCOOH N

SS

N

OH

O

D(-) Luciferina Ossiluciferina

O2ATP

AMP + PPi

e-

CO2

hν

FMNH2

FMNH

FMN

NADH

NAD+

17


Bioluminescenza • In alcune

specie l’ossidazione èprovocata da una LUCIFERASI ATP dipendente con rilascio di AMP e ossiluciferina.

AMP

Ossiluciferina

2D1S


Colori diversi…

• Il “colore” della luce che viene prodotta dalla luciferasi dipende dall’intorno chimico della luciferina.

• La struttura della luciferasi di Luciola cruciata (lucciola giapponese, 源氏蛍) è riportata a sinistra.

• Normalmente emette luce giallo-verde, la sostituzione di una Serina con una Asparagina in posizione 286 provoca l’emissione di luce rossa.

• Il cambio di colore sembra esser dovuto alla differente struttura III e alla diversa flessibilità intorno alla luciferina.

2D1S 2D1T

18


2D1S 2D1T

Colori diversi…


2D1S 2D1T

Colori diversi…

19


Colori diversi…

N

SS

N

OH

OH

N

SS

N

-O

O

O

O

N

SS

N

-O

OH

N

SS

N

-O

O

N

SS

N

O

O

O

O

N

SS

N

OH

O

CO2

Ossiluciferina

Luciferasi

Stabilizzazione dello stato eccitato per risonanza

Luciferasilibera

* *

Decarbossilazione

560nm hν

- .

Ossiluciferina

590nm hν


Celenterazina

• Un altro gruppo prostetico molto importante nel fenomeno della bioluminescenza di animali marini è la celenterazina che emette luce a seguito di un'ossidazione Ca2+

dipendente. • La reazione è catalizzata da un enzima

come la obelina (Obelia geniculata) o acqueorina (Aequorea aequorea e A. victoria)

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Bioluminescenza da celenterazina

• La bioluminescenza èdovuta ad una ossidazione Ca2+

dipendente della celenterazina.

• La reazione ècatalizzata da enzimi come la obelina (da Obelia geniculata) o acqueorina (da Aequorea aequorea e A. victoria).


Celenterazina

NN

NH

OH

O

R

APO

NN

N

OH

O

R

OO CH3APO

NH

O

N

N

OH

R

APO

O2

CO2

hν486 nm

3Ca2+

21


Celenterazina

Stati conformazionali

I. Apo-proteina, II. fotoproteina con legata 2-

idroperossicelenterazina in assenza di Ca2+,

III. Fotoproteina scarica con legato il prodotto: celenteramide) e Ca2+

legato, IV. Fotoproteina scarica senza

Ca2+, V. Apo-proteina con Ca2+.

Apo-Fotoproteina I Fotoproteina II

Celenterazina, O2

Ca2+-Fotoproteina IIICa2+-Apo-Fotoproteina V

Fotoproteina IV

Celenteramide

Celenteramide

Ca2+ Ca2+

Ca2+

CO2

hυ

DA: All three Ca2+-binding loops of photoproteins bind calcium ions: The crystal structures of calcium-loaded apo-aequorin and apo-obelinLU DENG, EUGENE S. VYSOTSKI, SVETLANA V. MARKOVA, ZHI-JIE LIU, JOHN LEE, JOHN ROSE, AND BI-CHENG WANGProtein Science (2005), 14:663–675



Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7 Å resolution determined directly from its sulfur substructureZHI-JIE LIU, E.S. VYSOTSKI, CHUN-JUNG CHEN, J.P. ROSE, JOHN LEE, and BI-CHENG WANGProtein Science (2000), 9:2085–2093.

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Structure of the Ca21-regulated photoprotein obelin at 1.7 Å resolution determined directly from its sulfur substructureZHI-JIE LIU, E.S. VYSOTSKI, CHUN-JUNG CHEN, J.P. ROSE, JOHN LEE, and BI-CHENG WANGProtein Science (2000), 9:2085–2093.



Obelina Acqueorina

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Interchange of aequorin and obelin bioluminescence color is determined by substitution of one active site residue of each photoproteinG.A. Stepanyuk, S. Golz, S.V. Markova, L.A. Frank, J. Lee, E.S. VysotskiFEBS Letters 579 (2005) 1008–1014


Colori diversi…

• Per Renilla kolikeri, Aequorea aequorea e A. victoria ed altri organismi, vi è una ulteriore complicazione al fenomeno della bioluminescenza.

• Possiedono, oltre ad un proprio sistema luciferina/luciferasi che genera luce blu, anche una proteina fluorescente che permettere loro di emettere luce nel verde: la

Green Fluorescent Protein (GFP)

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GFP• La medusa A.

victoria presenta una curiosa luminescenza verde dovuta ad una proteina con un peculiare gruppo prostetico.

• Tale gruppo prostetico NON emette luce per fenomeni ossidativi ma “cambia” il colore della bioluminescenza.


GFP• La Green

Fluorescent Protein ha una struttura “beta can” fatta di 11 β-strands

• Contiene al suo interno una cavitàidrofobica con una catena di tre AA (Ser-Tyr-Gly) modificati per formare un fluoroforocaratteristico

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GFP

• Il fluoroforo vero e proprio è formato dall’anello fenolico della Tyr66 connesso con un ponte metilenicoall’imidazolo formato dalla Ser 65 e Gly67

NH OCH3

CH3

ON

N

O

NH

ONHOH

NH2

OOH

O NH2

O


GFP• Il fluoroforo deriva da una modificazione postraduzionale

della proteina.

NNH

O

NH

O

NH

OH

*

OH H

*

O

NN

O

*

*OH

NN

O

NH

O

NH

OH

*

OH

*

NN

O

NH

O

NH

OH

*

OH

*

Ser65

Tyr66 Gly67

Ciclizzazione

Ossidazione

26


Fotofisica della GFP

• La capacità della GFP di emettere luce verde deriva dalla proprietà della tirosina di avere diversi pKa di dissociazione dell’OH fenolico allo stato fondamentale e allo stato eccitato:

OH

*

O

*

OH

*

O

*

+ H+

+ H+

Statofondamentale

Statoeccitato

hν

* *

pKa = 10

pK*a = 5


Fotofisica della GFP• Inoltre, nella GFP la forma deprotonata della Tyr66 è

stabilizzata da interazioni con altri residui:– Legame idrogeno tra OH fenolico e His 148 e Thr203, – Legame idrogeno tra ossigeno carbonilico e Gln94 e Arg96– Legame idrogeno tra OH di Ser65 con Glu222

*

OCH3

N

NH

*

O O

*

*

NH

O

H

NN

O

*O

NH

NH2+

NH

*

H

NH O

H

*H

Gln94

Arg96

Glu222His148

Thr203

FORMA PROTONATA

27



*

O O

*

CH3

OH

O *

NH NH

NH2+

NH

*

NN

O

OO

*

NH

*

OHN

N

*

H

*

O O

N

N

*

*

CH3

OH

O *

NH NH

NH2+

NH

*

NN

O

OO

*

NH

*

O

H

H

*

O O

N

N

*

*

CH3

OH

O *

NH NH

NH2+

NH

*

NN

O

OO

*

NH

*

O

H

H

Tyr66

Arg96

Gln94

Glu222

His148

Thr203

Tyr66

Arg96

Gln94

Glu222

His148

Thr203Tyr66

Arg96

Gln94

Glu222

His148

Thr203

H+H+

-



*

O O

*

CH3

OH

O *

NH NH

NH2+

NH

*

NN

O

OO

*

NH

*

OHN

N

*

H

*

O O

N

N

*

*

CH3

OH

O *

NH NH

NH2+

NH

*

NN

O

OO

*

NH

*

O

H

H

*

O O

N

N

*

*

CH3

OH

O *

NH NH

NH2+

NH

*

NN

O

OO

*

NH

*

O

H

H

-

Tyr66

Arg96

Gln94

Glu222

His148

Thr203

Tyr66

Arg96

Gln94

Glu222

His148

Thr203Tyr66

Arg96

Gln94

Glu222

His148

Thr203

H+H+

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Fotofisica della GFP• Inoltre, nella GFP la forma deprotonata della Tyr66 è

stabilizzata da interazioni con altri residui:– Legame idrogeno tra OH fenolico e His 148 e Thr203, – Legame idrogeno tra ossigeno carbonilico e Gln94 e Arg96– Legame idrogeno tra OH di Ser65 con Glu222

Glu222

His148

Thr203

Gln94

Arg96



His148Glu222

Gln94

Thr203

Arg96

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Fotofisica della GFP• La capacità di stabilizzare la forma TyrO- rende il

fluoroforo della GFP eccitabile a 470 nm (blu) dove emette il sistema luciferina luciferasi della A. victoria con emissione verde (509-540nm).

NN

O

*

*-O

NN

O

*

*HO

NN

O

*

*OH

NN

O

*

*-O

* *

H+

H+

+ H+

+ H+

395 nm 470 nm 509 nm

H+

H+


30


GFP: applicazioni (!-?)


“Il mare appariva come illuminato da sotto la superficie dell’acqua. La luminescenza disegnava sul mare un grande ovale al cui centro sembrava bruciare un falò che andava gradatamente attenuandosi verso le estremità. –Può essere un agglomerato di piccoli animali marini fosforescenti.- osservò un ufficiale…”

(Giulio Verne – 20000 leghe sotto i mari)

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