Genetica dei Procarioti - 4Genetica dei Procarioti - 4

Dipartimento di Scienze della VitaCdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)

Prof. Laura Marriricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail

A.A. 2014-15

Frequenza di mutazione

La frequenza con cui avvengono i diversi tipi di mutazioni è estremamente variabile. Errori nella replicazione del DNA ricorrono con una frequenza di 10-6 10-7 per coppia di basi per singolo ciclo di replicazione.

Aumenta in fase stazionaria: mutazione di una cellula ogni 300–400

Una coltura di E. coli in terreno complesso (LB) entra in fase di morte dopo tre giorni di incubazione. In questa fase, il 90-99% della popolazione muore

ossidazione di proteine e DNA, programma simile all’apoptosi eucariotica che determina la morte delle cellule al raggiungimento di una densità elevata

A partire dal 10° giorno delle colture in LB si osserva la comparsa, all’interno della popolazione batterica, del fenotipo GASP

Le cellule sopravvissute possono utilizzare le sostanze rilasciate da quelle morte, inclusi gli amminoacidi dalle proteine, i lipidi dalla membrana cellulare e il DNA

Dopo la fase di morte la vitalità delle cellule può essere mantenuta per mesi o addirittura per anni in una condizione definita fase stazionaria prolungata

I fenotipi GASP mostrano una fitness migliore rispetto al ceppo parentale e il bilancio tra le cellule in crescita e morte fornisce un equilibrio dinamico il cui risultato finale è la vitalità stabile della popolazione

rpoS

duplicazione di 46 bp all’estremità 3’ proteina in cui i quattro amminoacidi presenti a C-terminale sono sostituiti con 39 nuovi amminoacidi

indebolimento dell’espressione del regulon (in E. coli RpoS controlla l’espressione di oltre il 10% dei geni)

sbilanciamento della competizione tra i vari fattori sigma per il core della RNA polimerasi. Cellule con una ridotta espressione di rpoS favorirebbero, infatti, l’associazione dei fattori sigma RpoD (σ70 ) e RpoN (σ54) alla RNA polimerasi determinando una fitness migliore rispetto al ceppo wild-type

lrp

Lrp è un regolatore trascrizionale che può funzionare sia da attivatore che da repressore e controlla l’espressione di molti geni implicati nel metabolismo e nel trasporto degli amminoacidi

maggiore capacità di recuperare gli amminoacidi rilasciati dalle cellule morte, in particolare serina, treonina e alanina

Attivazione operone ybeJ-gltJKL

riarrangiamento genomico prodotto dalla sequenza di inserzione IS5.

Quattro geni di questo operone sono implicati nella regolazione del trasporto per l’aspartato e il glutammato, aumenta il potenziale di assorbimento degli amminoacidi per i mutanti

mutanti GASP: “truffatori evolutivi”, ignorano i segnali di inibizione della crescita e continuano a moltiplicarsi

Un modello delle basi fisiologiche del fenotipo

GASP

La competizione osservata all’interno di popolazioni batteriche è stata interpretata facendo riferimento alla “teoria dei giochi”

i “cooperatori” (WT-WT) coesistono, entrambi bloccano anticipatamente la crescita e sono premiati attraverso la redistribuzione delle risorse necessarie al mantenimento della popolazione per lungo tempo

i “cooperatori” (WT) che incontrano i “truffatori” (GASP) sono imbrogliati e le loro risorse vengono consumate prematuramente dai secondi

i “truffatori” che coesistono tra loro (GASP & GASP) sono puniti poichè continuano a crescere senza controllo mettendo a rischio la vitalità a lungo termine

in un habitat artificiale spazialmente strutturato (micro lastre in silicone) in cui la disponibilità dei nutrienti è omogenea, WT e GASP coesistono

operone criptico

sequenze di DNA fenotipicamente silenti normalmente non espresse durante il ciclo vitale dell’organismo

Sistemi criptici in Escherichia coli K12

bgl metabolismo arbutina e salicinacel metabolismo arbutina, salicina, cellobiosioarbT assunzione arbutinaasc metabolismo arbutina, salicina, cellobiosio

ARBUTIN

SALICIN PHLORIZIN

utilizzo beta-glucosidi aromatici

operone criptico Bgl

Operone bgl

---------**

bglG regione AT CAP -35 -10

PPbglbgl

t1

+132

CFCFCFCFCFCFCF

RNA polimerasi

CAP-cAMP

H-NS binds to the upstream regulatory element and the promoter

StpA paralogo di H-NS

The H-NS paralog StpA shares 58% amino acid identity with H-NS and the two proteins have many common properties.

StpA can complement the gene expression defect of the hns single mutant (Shi and Bennet, 1994)

Antagonistic control of the Escherichia coli bgl promoter by FIS and CAP in vitro

Caramel A, Schnetz K.Molecular MicrobiologyVolume 36, Issue 1, pages 85-92, 2002

293, 625 - 629 (22 October 1981)

Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12Ann E. Reynolds, Jeffrey Felton* & Andrew Wright

Spontaneous mutations which activate the cryptic bgl operon of Escherichia coli K12 are caused by insertion of DNA at a site, bglR, within the operon. Two insertion elements, IS1 and IS5, have been observed to effect this activation. Once the activating insertion has occurred the operon is inducible by glucosides in a cyclic AMP-dependent manner.

Sequence of the bgl promoter and upstream regulatory region.

Indicated are the −35, −10, and transcription start sites of the promoter; the CRP binding site (boxed); and the Fis binding sites (dotted lines), as well as the BglJ-RcsB (solid lines) binding sites.

Promoters (P) are indicated by pointed flags.

LeuO, a transcriptional regulator, likewise binds to the bgl upstream regulatory region and relieves repression of bgl independently of BglJ-RcsB.

BglJ and RcsB (both TR of the LuxR-type family)

interact and form heterodimers that

presumably bind upstream of the bgl promoter

Operone bgl

---------**

Ruolo biologico ed evolutivo dei geni criptici

• Secondo il modello di Hall et al. (1987), un gene di una popolazione microbica può trovarsi in tre stati:

1. Allele funzionale;2. allele criptico;3. allele non-funzionale.

L’allele wild type è favorevole in certi ambienti, mentre in ambienti alternativi, con risorse limitate, l’allele criptico è vantaggioso.

La distribuzione di alleli criptici/funzionali per il metabolismo di β-glucosidi varia all’interno delle Enterobacteriacae in relazione alla nicchia ecologica occupata

Klebsiella spp.Gruppo I fermentano β-glucosidi aromatici e cellobiosio

Escherichia coli, Shigella sonneiGruppo II

non possono fermentare β-glucosidi, ma possono mutare acquisendo indipendentemente un fenotipo Arb+, Sal+ o Cel+

Il mantenimento di alcuni sistemi criptici rappresenta un sistema di regolazione a lungo termine per funzioni raramente utilizzate

In ambienti multi-risorsa, un allele criptico attivato è svantaggioso, ma selettivamente favorevole in particolari condizioni di stress (es. digiuno, risposta immunitaria dell’ospite)

Nome/Gene Funzione

σ70 (rpoD) Geni necessari durante la crescita esponenziale

σ54 (rpoN) Geni espressi in condizioni di carenza di azoto

σ38 (rpoS) Geni espressi durante la fase stazionaria e in condizioni di stress generale

σ32 (rpoH) Geni espressi durante heat-shock (chaperoni per ristabilire il folding corretto delle proteine citoplasmatiche)

σ28 (rpoF) Geni codificanti per proteine coinvolte nell’assemblaggio del flagello

σ24 (rpoE)Geni espressi in condizioni di stress termico per ripristinare l’integrità di membrana e assicurare il folding corretto delle proteine di membrana

σ19 (fecI) Geni espressi in relazione al trasporto del citrato ferrico

Consensus E. coli 32 (rpoH)

Some sigma factors are always expressed but inactive without a coactivator

Some are only expressed when the genes they regulate are required

Some are expressed but degraded

Some are expressed but inactive due to anti-sigma factors

Nome Funzione

σ70 (RpoD) principale fattore durante la crescita in condizioni normali

σ54 (RpoN) assimilazione dell’azoto

σ38 (RpoS) principale fattore durante la fase stazionaria; affamamento

σ32 (RpoH) risposta a heat-shock

σ28 (RpoF) sintesi del flagello

σ24 (RpoE) EC

σ19 (FecI) trasporto del ferro

Anti-sigma Factors

Anti-sigma factors tightly (yet reversibly) bind sigma factorsand prevent their activity.

Anti-

FlgM

durante le fasi iniziali della biogenesi flagellare σ28 è mantenuto inattivo dalla stretta associazione con FlgM

l’uncino ed il corpo basale sono assemblati FlgM viene secreto attraverso il sistema di trasporto flagellare (T3S)

folded form

The coupling of flagellar gene regulation to flagellum assembly.

Chevance F F V et al. J. Bacteriol. 2006;188:297-304

Some sigma factors are always expressed but inactive without a coactivator

Some are only expressed when the genes they regulate are required

Some are expressed but degraded

Some are expressed but inactive due to anti-sigma factors

Nome Funzione

σ70 (RpoD) principale fattore durante la crescita in condizioni normali

σ54 (RpoN) assimilazione dell’azoto

σ38 (RpoS) principale fattore durante la fase stazionaria; affamamento

σ32 (RpoH) risposta a heat-shock

σ28 (RpoF) sintesi del flagello

σ24 (RpoE) EC

σ19 (FecI) trasporto del ferro

ll sito di legame al ribosoma (RBS) dell'mRNA rpoS è appaiato alla regione 5‘ non tradotta dell'mRNA.

Alcuni sRNA legandosì al 5' dell'mRNA impediscono la formazione della struttura secondaria e permettono la traduzione di RpoS (σs).

Most RpoS expression is determined at the translational levelAt least three different small RNAs, DsrA, RprA and OxyS, regulate RpoS translation

the abundance and, therefore, the activity of each is in turn regulated by different environmental cues.

The stress response sigma factor RpoS has ~500 genes under its control

Default situation: «off», the 5’ folds back to block the chromosome entry

Hfq consists of six identical subunits arranged in a ring shape structure

Hfq is an RNA-binding protein encoded in approximately half of the (in 2002) sequenced bacterial genomes and is one of the most abundant proteins in E. coli.

The sRNA binds to the Hfq protein and then finds its target mRNA

The typical action of an Hfq-associated sRNA.

regolazione mediante fattori sigma alternativi

sRNA (small RNA), possono svolgere la loro azione regolativa appaiandosi a regioni specifiche di un RNA bersaglio perfettamente o parzialmente complementare (sRNA antisenso)

Gli RNA antisenso sono molecole piccole (da poche decine a poche centinaia di nucleotidi), diffusibili

OmpF

pori grandi

OmpC

pori piccoli

in alternativa

livelli di osmolarità

livelli di osmolarità

OmpCMicF

EnvZ/OmpR System of E. coli

Senses changes in extracellular osmolarity