LE BIOTECNOLOGIE E IL DNA RICOMBINANTE di Gabriele Virgilio classe 2 G a.s. 2012/13

CHE COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE

Le biotecnologie sono un insieme di tecniche sviluppate a partire dalle conoscenze scientifiche acquisite nel campo

della biologia e della genetica. Sono finalizzate alla produzione di nuove molecole a partire da sistemi biologici

esistenti in natura ed opportunamente selezionati o appositamente creati in laboratorio.

Struttura a doppia elicadel DNA

Struttura dell’RNA

FASI DI SVILUPPO DELLE BIOTECNOLOGIE

I fase: (preistoria – 1850) : Le tecnologie sono rozze senza comprensione dei principi scientifici.

Esempi: Bevande alcoliche; pane; formaggi; cibi fermentati (yogurt); concia delle pelli; purificazione dei liquami.

II fase: (1850 – 1940) : Le tecnologie svolte in condizioni di quasi sterilità prevedono la manipolazione dei mezzi di coltura per

incrementare le rese dei prodotti.

Esempi: Glicerolo; acido citrico; colture pure di lievito per l’alimentazione; preparazioni enzimatiche grezze; primi insetticidi

microbici.

III fase: (1840 – anni Settanta) : Le tecnologie prevedono

processi microbici più complessi. Si producono sostanze di interesse farmaceutico e i livelli di sterilità sono molto elevati.

Colture pure e sviluppo estensivo di nuovi ceppi.

Esempi: Antibiotici.

IV fase: (Fine anni Settanta – oggi) : Le tecnologie prevedono l’identificazione, l’isolamento, la modifica e lo sviluppo controllato

di specifici prodotti genici.

Esempi: Prodotti farmaceutici mediante trasferimento genico (l’ormone umano della crescita e l’insulina); diagnosi prenatale

delle malattie geniche.

SETTORI BIOTECNOLOGICI

Blue biotechnology (o biotecnologie marine) È il settore che si occupa di applicare le metodiche della biologia

molecolare agli organismi marini e di acqua dolce.

Grey biotechnology (o biotecnologie ambientali)

È il settore che si interessa di tutte le applicazioni correlate all'ambiente.

Green biotechnology (o biotecnologie agroalimentari) È il settore delle biotecnologie che si occupa dei processi agricoli.

Red biotechnology (o biotecnologie farmaceutiche) È il settore delle biotecnologie che si occupa dei processi biomedici e farmaceutici.

White biotechnology (o biotecnologie industriali) È il settore delle biotecnologie che si occupa dei

processi di interesse industriale.

Gold biotechnology (o bioinformatica)

La bioinformatica è una scienza multidisciplinare che integra conoscenze informatiche, chimiche, matematiche, mediche e biologiche

INGEGNERIA GENETICA O TECNICA DEL DNA RICOMBINANTEÈ una tecnologia che permette di tagliare, modificare e trasferire geni da una cellula all’altra (anche di specie diverse).

Il DNA ricombinante viene utilizzato per:

- ottenere frammenti specifici di DNA in grandi quantità - studiare la sequenza di determinati frammenti genici - identificare particolari sequenze in un cromosoma - studiare le modalità di espressione e regolazione genica - creare piante o animali transgenici - diagnosticare e curare malattie genetiche

Lo spostamento di geni da una cellula all’altra è un fatto che in natura avviene regolarmente.

Nei batteri tramite: - CONIUGAZIONE- TRASDUZIONE- TRASFORMAZIONE

I microrganismi più usati nell’ingegneria genetica sono BATTERI e VIRUS per

- semplicità di struttura - rapidità di crescita - facilità di purificazione dei prodotti

STRUMENTI DELL’INGEGNERIA GENETICA-Enzimi di RESTRIZIONE: alcuni ceppi di batteri (in particolare Escherichia coli) riescono a prevenire l’infezione da parte di alcuni fagi fra cui il FAGO LAMBDA perché sono capaci di a) distinguere il DNA infettante dal proprio

b) distruggerlo servendosi di un particolare enzima, detto ENZIMA DI RESTRIZIONE

Ogni enzima di restrizione riconosce una specifica sequenza costituita da alcune coppie di basi dette SITO O SEQUENZA DI RICONOSCIMENTO ; alcuni enzimi effettuano il taglio lasciando sporgere alcuni nucleotidi di un filamento rispetto all’altro.

  

                                                                                                                                   

                                                           

e taglia il DNA di entrambi i filamenti tra le basi G e A; i due filamenti si separano lasciando sporgere a ciascuna estremità una sequenza singola.

Per esempio l’enzima EcoRI riconosce la sequenza :

   GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

Siti di restrizione

ENZIMI DI RESTRIZIONE ¹

ENZIMI DI RESTRIZIONE ²Gli enzimi di restrizione possono effettuare due tipi di tagli:netticome l’enzima Hpa1sfalsaticome gli enzimi EcoR1 e Hind3, che tagliano in maniera asimmetrica, creando “estremità appiccicose”

-Enzima DNA LIGASI: in natura (Escherichia Coli) funge da riparatore del DNA; viene utilizzato per legare le estremità di due molecole di DNA; in precedenza tagliate dall’enzima di restrizione.

-Enzima TRASCRITTASI INVERSA: (presente nei RETROVIRUS) è utilizzato per formare molecole di DNA da una molecola di RNA. È possibile, partendo dall’m-RNA di una qualsiasi proteina, sintetizzare la molecola complementare di DNA (il gene) corrispondente.

m-RNA filamento 2° filamento (c-DNA) trascrittasi complementare DNA- complementare di DNA inversa di DNA polimerasi

Terapia genica: le tecniche di ingegneria genetica possono essere molto efficaci per curare alcune malattie dovute all’alterazione di un singolo gene, mediante la sostituzione di un gene malato con un gene sano. In questo campo ci sono ancora molti aspetti etici e tecnici irrisolti

Diagnosi delle malattie: sono oggi disponibili test per la diagnosi prenatale di molte malattie ereditarie che utilizzano enzimi di restrizione e sonde di acidi nucleici per rilevare la presenza di geni alterati. Due importanti test diagnostici prenatali riguardano l’anemia falciforme e la corea di Huntington

INGEGNERIA GENETICA IN MEDICINA

TECNICA DEL DNA RICOMBINANTEIl procedimento comprende cinque fasi successive:

- ISOLAMENTO DEL GENE che codifica per la proteina che si vuole ottenere in grande quantità

- costruzione di una molecola di DNA RICOMBINANTE: il DNA da isolare ed un plasmide batterico vengono tagliati dallo stesso enzima di restrizione; queste due molecole tendono a formare legami a idrogeno alle loro estremità che vengono unite mediante l’enzima DNA ligasi; si ottiene così una molecola di DNA ricombinante

- INTRODUZIONE DEL DNA RICOMBINANTE NELLA CELLULA OSPITE: il plasmide, pur contenendo anche DNA estraneo, si riproduce più volte duplicando così anche il DNA associato

- CLONAZIONE DEL DNA I batteri così modificati si riproducono. Le cellule sono tutte geneticamente identiche; questo insieme è detto CLONE. Poiché anche il DNA ricombinante presenta nella cellula originaria si è riprodotto, si dice che il gene È STATO CLONATO

- RECUPERO PROTEINA mediante purificazione

ALCUNI PRODOTTI OTTENUTI PER LA CURA DELLA SALUTE

- ormone della crescita- insulina umana- TPA (attivatore tissutale del plasminogeno)- calcitonina- fattore VIII della coagulazione per il trattamento dell’emofilia- vaccini contro malattie virali (per esempio epatite B- enzima renmina per la produzione di formaggi- interferoni (proteine attive contro i virus)

APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE: L’INSULINA

L'insulina è un ormone proteico dalle proprietà anaboliche, prodotto dalle cellule beta del pancreas; è formata da due catene unite da due ponti solfuro: catena A di 21 aminoacidi e catena B di 30 aminoacidi. La sua funzione più nota è quella di regolatore dei livelli di glucosio ematico riducendo la glicemia mediante l'attivazione di diversi processi metabolici e cellulari.

Gli interferoni (IFN) sono una famiglia di proteine prodotte sia da cellule del sistema immunitario (globuli bianchi) sia da cellule tissutali in risposta alla presenza di agenti esterni come virus, batteri, parassiti ma anche di cellule tumorali. Gli interferoni appartengono alla vasta classe di glicoproteine

INTERFERONI

L'interferone-γ umano L'interferone-β umano

Esistono due tipi di interferoni, che comprendono tre classi principali:alfa (α) e beta (β) (Tipo I) gamma (γ) (Tipo II).

L’immunologia moderna si è sviluppata attorno alle scoperte di Jenner e Pasteur sulle vaccinazione contro il Vaiolo. Jenner inoculava nei pazienti sani il virus del vaiolo bovino, questo scatenava una risposta immunitaria che produceva anticorpi protettivi contro il vaiolo umano senza scatenare la malattia. Questo tipo di vaccinazione però causava la malattia in soggetti sani nel 3% dei casi, una cifra troppo elevata per gli standard moderni. Nell’ultimo secolo sono state fatte numerose ricerche che hanno portato alla costruzione di vaccini sicuri e efficaci.

VACCINI

I VETTORI DI CLONAZIONEE CLONAZIONE GENICA- i plasmidi sono stati i primi vettori di clonazione- ultimamente nella maggior parte delle ricerche si

impiegano anche VIRUS, utilizzati comunemente quando si lavora su DNA eucariotico

Nel 1973, con il primo esperimento di clonazione di un segmento genico inserito nel batterio Escherichia coli, Stanley Cohen e Herbert Boye dimostrarono che è possibile produrre copie multiple di un determinato gene

I materiali necessari per il processo di clonazione sono:

-un frammento di DNA, che può essere ricavato anche da un mRNA (in questo caso viene detto cDNA)

-specifici enzimi di restrizione che servono a “tagliare” il DNA-particolari enzimi in grado di unire le estremità di nucleotidi (DNA-ligasi)-i plasmidi, vettori in grado di inserirsi nelle cellule ospiti -cellule batteriche modificate in modo da rendere la loro

membrana permeabile al plasmide

LE BASI PER LA CLONAZIONE

I plasmidi sono:-molecole circolari di DNA che contengono alcuni geni (da uno a decine)-presenti naturalmente nelle cellule batteriche, alle quali conferiscono caratteristiche peculiari-utilizzati in natura dai batteri per favorire il trasferimento di informazioni da una cellula all’altra-in grado di trasportare un frammento genetico da un organismo all’altro (vettori)

PLASMIDI E…

Se trattiamo un frammento di DNA e un plasmide (anello di DNA) con lo stesso enzima di restrizione, il frammento può integrarsi nel

plasmide, dato che le loro estremità sono complementari

…INSERZIONE DI UN GENE IN UN PLASMIDE

L’enzima DNA-ligasiunisce e richiude le estremità di DNA

La clonazione nei mammiferi consiste nel trasferimento del nucleo di una cellula somatica, prelevato da un organismo, in una cellula uovo non fecondata privata del materiale genetico proveniente da un altro organismo

La pecora Dolly è stato il primo organismo nato da un esperimento di clonazione nei mammiferi

ANIMALI GENETICAMENTE MODIFICATI

PCR: reazione a catena della polimerasiLa PCR è una tecnica che permette di ottenere grandi quantità di un determinato segmento genico grazie a cicli successivi di duplicazione. Il campione di DNA può provenire da:-un frammento di tessuto (es. biopsia)-un capello (dalle cellule della base)-una goccia di sangue essiccata

LA TECNICA PCR (polymerase chain reaction) O REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

-L’ibridazione è una tecnica utilizzata per localizzare un segmento di DNA in un cromosoma e si basa sull’utilizzo di una sonda marcata di DNA complementare alla sequenza nucleotidica cercata -La sonda può essere marcata con radioisotopi o con un colorante

fluorescente; se la sonda incontra molecole di DNA

complementari, si appaia a esse, evidenziandole

IBRIDAZIONE E SONDE NUCLEOTIDICHE

-Frammentando il DNA con enzimi di restrizione si ottengono segmenti che possono essere separati (tramite elettroforesi), clonati, sequenziati e conservati in banche dati informatizzate-Nel 2000, grazie alla collaborazione fra scienziati di varie discipline scientifiche (soprattutto biologia e informatica), si è concluso il Progetto Genoma Umano che ha permesso di mappare l’intero genoma dell’uomo

PROGETTO GENOMA UMANO

Gli OGM (Organismo geneticamente modificato)Un organismo geneticamente modificato (OGM) è un essere vivente che possiede un patrimonio genetico modificato tramite tecniche di ingegneria genetica, che consentono l'aggiunta, l'eliminazione o la modifica di elementi genici.

OGM E PIANTE TRANSGENICHE

GloFish, pesci d’acquario resi fluorescenti tramite transgenesi. Sono i primi animali geneticamente modificati.

Le piante transgeniche sono piante il cui DNA è stato modificato con tecniche di ingegneria genetica allo scopo di approntare miglioramenti o modifiche di una o più caratteristiche. Le piante transgeniche, spesso indicate con il termine più generale di OGM (Organismi Geneticamente Modificati), rappresentano una delle più rilevanti innovazioni apparse nell'ultimo decennio.

Le piante GM (geneticamente modificate) presentano uno o più geni modificati, con lo scopo di conferire loro particolari caratteristiche o farle diventare resistenti a determinate malattie

Le fragoleGM risultanopiù resistential freddo

I pomodoriGM risultanopiù resistentiai virus

In Italia le leggi vigenti non consentono di coltivare gli OGM su larga scala

APPLICAZIONI AGROALIMENTARI

Gli organismi transgenici possiedono nel proprio genoma uno o più geni appartenenti a individui di un’altra specieSi possono ottenere isolando il gene che si vuole trasferire e inserendolo, mediante microscopici aghi, in cellule uovo fecondate; queste verranno poi impiantate in un organismo che genererà individui in grado di esprimere quel carattere

ORGANISMI TRANSGENICI

Questo (Sulfolobus acidicaldarious)appartiene a una delle specie più spesso usate nella biorimediazione,in quanto permette il passaggio in soluzione di elementi metallici

Si possono utilizzare microrganismi modificati geneticamente per degradare sostanze tossiche di rifiuto, come metalli, idrocarburi, pesticidi, diserbantiIn laboratorio sono stati ottenuti batteri contenenti plasmidi artificiali in grado di ossidare idrocarburi più velocemente dei batteri naturali

APPLICAZIONI AMBIENTALI

Mod

ifica

gen

etic

a de

lle p

iant

e

Mod

ifica

gen

etic

a de

gli a

nim

ali

DIBA

TTIT

OOGM:

pro e contro