LA TRASCRIZIONELA TRASCRIZIONE

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La velocità della reazione è di ~40 nt/sec a 37°C (per la RNA pol batterica); molto più lenta di quella di replicazione del DNA (800 bp/sec)

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NomenclaturaNomenclatura�� la la coding strand (Sense strand) coding strand (Sense strand) del DNA ha la stessa sequenza del del DNA ha la stessa sequenza del

mRNAmRNA�� la la antisense strand (Template strand) antisense strand (Template strand) è quella che funge da è quella che funge da

template per la sintesi del mRNA.template per la sintesi del mRNA.�� RNA polymerases RNA polymerases sono enzimi che sintetizzano RNA usando DNA sono enzimi che sintetizzano RNA usando DNA

come template.come template.�� Un Un promoter promoter è una regione di DNA dove la RNA polimerasi si lega per è una regione di DNA dove la RNA polimerasi si lega per

iniziare la trascrizione.iniziare la trascrizione.�� Startpoint (Startsite) Startpoint (Startsite) si riferisce alla posizione sul DNA che si riferisce alla posizione sul DNA che

corrisponde alla prima base incorporata nel RNA corrisponde alla prima base incorporata nel RNA �� A A terminator terminator è una sequenza di DNA fa terminare la trascrizione alla è una sequenza di DNA fa terminare la trascrizione alla

RNA polymerase.RNA polymerase.�� A A transcription unit transcription unit è la distanza tra i siti di iniziazione e di è la distanza tra i siti di iniziazione e di

terminazione della RNA polymerase; può includere più di un gene.terminazione della RNA polymerase; può includere più di un gene.�� Upstream Upstream = a monte.= a monte.�� Downstream Downstream = a valle.= a valle.�� A A primary transcript primary transcript è il prodotto di RNA non modificato che è il prodotto di RNA non modificato che

corrisponde ad una unità di trascrizione. corrisponde ad una unità di trascrizione.

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TrascrizioneTrascrizione

�� La trascrizione produce un filamento di RNA La trascrizione produce un filamento di RNA complementare ad un filamento di DNAcomplementare ad un filamento di DNA

�� Esistono vari tipi di RNAEsistono vari tipi di RNA

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la sequenza “codificante” del DNA è uguale a quella del messaggero

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4Promotore batterico IUn promotore è definito dalla presenza di

una corta sequenza consenso in una localizzazione specifica.

La sequenza consenso del promotore consiste in una purina al punto di inizio, l’esamero TATAAT a –10, ed un altro esamero a–35.

I diversi promotori di solito differiscono dal consenso in una o più posizioni.

Un promotore è una sequenza particolare di DNA che è riconosciuta dalla RNA polimerasi. Ogni promotore deve includere questa sequenza e nel genoma batterico la sequenza minima che da un segnale adeguato è di 12 bp.

Consenso e spaziatura

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Promotore batterico IIUn putativo sito di riconoscimento del DNA può essere

definito come una sequenza ideale che rappresenta la basi più spesso trovate in ogni posizione. Una sequenza consenso è definita dall’allineamento di tutti gli esempi noti così da massimizzare la loro omologia.

� Ci sono quattro caratteristiche conservate in un promotore batterico:

� Il punto di inizio (startpoint)� La sequenza –10; � La sequenza–35; � La distanza tra le sequenze–10 e –35; � L’elemento UP (qualche volta)

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promotori riconosciuti dal fattore sigma-70 di E. coli

promotore: sequenza presente a monte di tutti i geni, riconosciuta dal fattore sigma dell’RNA polimerasi, necessaria per l’inizio della trascrizione.

La sequenza è conservata

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TTGACa TAtAaT

lettera maiuscola = basi più conservate (presenti in quella posizione rispetto al +1 in quasi tutti i casi

lettera minuscola = basi presenti in molti casi ma non sempre

mutazioni “down”: diminuisce l’efficienza del promotore

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Startpoint

� Lo startpoint è di solito (>90% delle volte) una purina. Spesso è la base centrale della sequenza CAT.

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La sequenza -10

� la regione di 6 bp è riconoscibile in quasi tutti i promotori. Il centro dell’esamero è generalmente circa 10 bp a monte dello startpoint, ma la distanza varia da -18 a -9. L’esamero è spesso chiamato la sequenza -10 sequence.

� Il consenso è TATAAT, e può essere indicato nella forma T80A95T45A60A50T96 dove il pedice indica la percentuale dell’occorrenza della base più comune, che varia 45-96%. (dove non c’è evidente preferenza si usa una N). La basi più importanti sembrano essere le più conservate: la TA iniziale e la T finale.

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La sequenza -35� Un altro esamero conservato è centrato ~35

bp a monte dello startpoint. È chiamata la sequenza -35.

� Il consenso è TTGACA; � in forma più dettagliata T82T84G78A65C54A45

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Distanza –10 / -35

� La distanza che separa i siti–35 e –10 è tra 16-18 bp nel 90% dei promotori; ma può essere fino a 15 o 20 bp.

� La sequenza nella regione non è importante, ma la distanza è critica per tenere i due siti nella geometria corretta per il legame al promotore.

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Elemento UP � Alcuni promotori hanno una

sequenza ricca di A-T localizzata ancora più a monte. E’ denominata elemento UP. Interagisce con la subunità della RNA polimerasi. La si trova tipicamente nei promotori che sono molto espressi, quali quelli dei geni per rRNA.

� E’ riconosciuto dal dominio C-terminale della subunità alfa (�CTD)

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regolazione dell’espressione genica mediante l’intervento di fattori sigma alternativi

geni “heat-shock”: CCCCCC - 15/17 basi - CCCC

promotore riconosciuto dal fattore sigma32 attivato solo in caso di aumento della temperatura. I geni che hanno questo promotore vengono espressi (trascritti) SOLO IN PRESENZA DI QUESTO SPECIFICO FATTORE SIGMA

geni “spo” in B. subtilis sono silenti e vengono trascritti solo durante la sporulazione per la presenza di fattori sigma specificamente attivati in sporulazione

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4La RNA polimerasi batterica è fatta da subunità multiple

� L’oloenzyme (enzima completo) è un complesso di 5 subunità che comprende il “core enzyme” ( 2 e il factorche è competente per l’inizio della trascrizione batterica.

� RNA core polimerasi batteriche sono ~500 kD complessi multisubunità con la struttura generale �2 ������.

� Negli eubatteri un solo tipo di RNA polimerasi è responsabile della sintesi di tutti i RNA (mRNA, rRNA e tRNA)

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RNA polimerasi batterica

� Le subunità and insieme fanno il centro catalitico.

� La subunità è necessaria per assemblaggio del core enzyme.

� La subunità è interessata specificamente con il riconoscimento del promotore

�=blue

�’ = viola

� = giallo e verde

Mg

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4regolazione dell’espressione genica mediante l’intervento di fattori sigma alternativi

geni “heat-shock”: CCCCCC -15/17 basi - CCCC

promotore riconosciuto dal fattore sigma32 attivato solo in caso di aumento della temperatura. I geni che hanno questo promotore vengono espressi (trascritti) SOLO IN PRESENZA DI QUESTO SPECIFICO FATTORE SIGMA

geni “spo” in B. subtilis sono silenti e vengono trascritti solo durante la sporulazione per la presenza di fattori sigma specificamente attivati in sporulazione

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Fattori sigma� E. coli ha diversi

sigma factors, ognuno dei quali fa sì che la RNA polimerasi inizi a dei promotori definiti da specifiche sequenze–35 e –10.

� I promotori per ogni enzima hanno tutti la stessa dimensione e localizzazione relativa allo startpoint, ed hanno sequenze conservate solo intorno ai siti –35 e –10.

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Legame al DNAIl DNA binding domain del fattore sigma è

helix-turn-helix che riconosce il sito –35Il sito –10 è riconosciuto dalla subunità

alfa. Ha amino acidi aromatici che aiutano l’apertura del DNA

La forza di un promotore è collegata alla affinità di legame ed alla capacità di evadere dal promotore

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La RNA pol

� La distanza tra i siti

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4La trascrizione avviene con l’appaiamento di basi in una

“bolla" di DNA

RNA pol separa i due filamenti di DNA in una “bolla” transiente ed usa un filamento come template per la sintesi di una sequenza di RNA complementare.

La bolla è lunga ~12-14 bp, e la lunghezza dell’ibrido RNA-DNA è di ~8-9 bp.

La velocità della reazione è di ~40 nt/sec a 37°C (per la RNA pol batterica); che è simile alla velocità di traduzione (15 amino acidi/sec), ma molto più lenta di quella di replicazione del DNA (800 bp/sec)

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4La reazione di trascrizione ha tre passaggi

� Iniziazione descrive il passaggio fino alla sintesi del primo legame del RNA. Include il legame della RNA polimerasi al promotore ed il “melting” di una corta regione di DNA in singolo filamento.

� Elongazione è il passaggio nella reazione di sintesi della macromolecola (per la replicazione, trascrizione, o traduzione) quando la catena nucleotidica o peptidica si allunga per l’aggiunta della subunità.

� Terminazione è il passaggio che termina la sintesi della macromolecola bloccando l’addizione delle subunità, e generalmente causando la dissoluzione dell’apparato di sintesi

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De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4Tensione superelica- DNA supercoiling

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4La terminazione nei batteriLa terminazione è sempre letta sulla

sequenza di DNA trascritta, non su DNA

Ci sono due tipi di terminatori:� Rho-indipendenti: una sequenza

invertita (palindromica) di 20 nt seguita da circa 8 nt A-T

� Rho-dipendenti: reclutano la proteina rho, una ATPasi ad anello che separa il RNA dallo stampo. Circa 40 nt ricchi di C.

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Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare Piccin Nuova Libraria S.p.A.

Terminatore forte o rho-indipendente:

-struttura secondaria stabile e forte per la presenza di molte G e C nello “stem” - sequenza di tante U al 3’ della struttura secondaria (che facilita la separazione dell’ibrido DNA/RNA)

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4Rho-indipendenti� La responsabilità della

terminazione sta nella sequenza già trascritta dalla RNA polimerasi

� I terminatori rho-indipendenti richiedono la formazione di una forcina nella struttura secondaria seguita da una sequenza di A (>8)

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Rho factor� Il fattore Rho è una proteina terminatore

che si lega al RNA nascente si muove fino a una sequenza che è ricca in C e povera di G che precede il sito di terminazione.

� È ~275 kD esamero di Rho subunità identiche, della famiglia delle elicasi ATP-dipendenti che funzionano passando l’acido nucleico nel foro dell’esamero.

� I terminatori Rho-dipendenti sono la metà

dei terminatori di E. coli.

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Terminatore debole o rho-dipendente

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Le RNA polimerasi eucariotiche sono composte da piu’di 10 subunità

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Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare Piccin Nuova Libraria S.p.A.

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TATA BOX

TBP

Saddle-likedomain

TATA BOX BINDING PROTEIN

DNABINDING

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TAF3

TAF10

TAF6 TAF11

TAF12

TAF4

TATA BOX

TBPTAF5

TAF10

TAF8

TAF5

TAF4

TAF12TAF13TAF9 TAF

3TAF11

TAF6TAF13 TAF9

TAF8

TAF7

TAF1: Acetyl transferase activity

Interaction with TFIIF

TAF5 stabilizes TAFs interaction, specially histone-like ones (TAF6,

TAF9)

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DNA BENDING

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TFIID

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TFIIDTFIIA

TFIIB

DAB

TFIIF

TFIIE

TFIIH

TFIIB INTERACTS WITH

SADDLE-LIKE DOMAIN OF TBP

AND WITH BENDED DNA ON

SIDES OF TATA BOX.

TBP/TFIIB COMPLEX

RECRUITS RNA POLII AND

OTHER GTF

HETEROTRIMER

(A, B, C SUBUNITS)

BINDS PROMOTER

REGION WITH TFIID

TFIIE MODULATES THE

HELICASE AND KINASE

ACTIVITIESOF TFIIH

BY STIMULATING CTD

DOMAIN RNA POLII

PHOSPHORYLATION

HETEROTETRAMER(RAP30)2 (RAP74) 2

(RAP30)2 BINDS RNA POL II AND TFIIB. RAP74 INTERACTS WITH

DNA. TFIIF STABILIZES THE INTERACTION OF RNA POLII WITH

PROMOTER AND STIMULATES ELONGATION RATE

TFIIH STIMULATES PROMOTER

MELTING AND IT HAS KINASE

ACTIVITY AGAINST RNA POL II

P

PHOSPHORYLATION OF RNA

POLII CTD STIMULATES

PROMOTER MELTING AND

TRANSCRIPTION START

TWO DOMAIN:

N-TERMINAL

Zn-RIBBON AND

CORE DOMAIN

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Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare Piccin Nuova Libraria S.p.A.

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De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4The carboxy-terminal domain (CTD) of the polymerase comprises repeats of a seven-amino-acid motif and undergoes reversible modification by phosphorylation. In particular, phosphorylation of a serine amino acid at position 2 in each repeat increases as the polymerase moves along the mRNA.

b, Kim et al. have found that the Rtt103 proteinbinds a CTD peptide carrying the serine 2 phosphorylation, and also associates with the exonuclease Rat1 (Xrn2 in humans) and its cofactor Rai1.

Thus, Rat1 may be recruited to the nascent mRNA via Rtt103 bound to the polymerase CTD, and by an independent system that involves Rai1.

Following cleavage of the poly(A) site, Rat1 binds and eats away at the free end of the RNA, halting transcription when it catches the polymerase (c).

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The newly synthesized human -globin mRNA will be cut at two positions: at the normal site of poly(A) addition and within the co-transcriptional cleavage (CoTC) site, showed to be self-cleaving.

This allows the entry of Xrn2 (the human Rat1 counterpart), which again eats away at the mRNA until it catches up with the RNA polymerase.

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Aggiunta di guanina al 1° nt trascritto dopo la trascrizione di 20-30 nt.; legame 5’-5’ trifosfato

Struttura del cappuccio

Metil transferasi aggunge CH3 al 7’ di G; anche i primi 2 nt sono metilati

CappuccioFunzioni: protezione al 5’; esportazione; traduzione

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I cleavage factors (CF) e i cleavage and polyadenilation factors (CPF) consentono alla poli(A) polimerasi (PAP) di riconoscere il sito di taglio.

La PAP aggiunge solo una decina di A.

Questa corta coda viene riconosciuta dalla polyA binding protein (PABII) che la allunga fino ad arrivare a 200 A.

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Splicing

Rimozione di un introne attraverso due reazioni sequenziali di

trasferimento di fosfato, note come transesterificazioni.

Queste uniscono due esoni rimuovendo l’introne come un

“cappio”

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Procarioti

trascrizione e traduzione avvengono

contemporaneamente nel citoplasma

Eucarioti

Trasporto dell’mRNA dal nucleo al citoplasma

NES

NLS

Complesso di carico: Proteina cargo, Ran+GTP, Esportina1,

Ran+GTP

Ran+GDP

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Structure of eukaryotic mRNA

7mGpppCap

5’5’ untranslated region

AUGinitiation

translated region

(A)~200

poly(A) tail

3’ untranslated region

UGAtermination

3’AAUAAApolyadenylation signal

• all mRNAs have a 5’ cap and all mRNAs (with the exceptionof the histone mRNAs) contain a poly(A) tail

• the 5’ cap and 3’ poly(A) tail prevent mRNA degradation• loss of the cap and poly(A) tail results in mRNA degradation

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Gli snRNA creano assieme alla coilina uno scaffold proteico (corpi di Cajal).

Questi RNA vengono da introni di mRNA (non codificanti per proteine; e.g., UHG).

Si legano nel nucleolo alla fibrillarina.

Hanno regioni complementari agli rRNA 18s e 28s.

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La modificazione dell’uracile in pseudouracile è ad opera della Ψ-sintasi

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4Modificazioni post-trascrizionali tRNA

3’CCA trascrittoin E.C.

Nei tRNA precursori vengono eliminati gli spaziatori, delle sequenze al 5’ e 3’, ed in alcune specie, un introne (splicingcanonico).

Modificazione delle basi: ipoxantina, pseudouracile

Aggiunta al 3’ della sequenza CCA, comune a tutti i tRNA, grazie all’azione dell’enzima tRNA nucleotidil transferasi

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