Biotecnologie Mediche

Cinzia Di Pietro

0953782055 0953782055

dipietro@unict.it

Le malattie genetiche. Dalle malattie monogeniche ai fenotipi complessi.

Metodi di Analisi degli acidi nucleici estrazione di DNA – RNA sonde molecolari e ibridazione PCR, RT-PCR, Real Time PCRdisegno di primers per PCR utilizzando software disponibili online.

Metodi per l’identificazione di mutazioni genicheAnalisi specifica di mutazioni noteRicerca aspecifica di mutazioni

Metodi High Throughput per l’analisi del Genoma, del Trascrittoma, del Proteoma, dell’Interattoma.

Testi – Fonti bibliografiche

Strachan e ReadGenetica umana molecolareUtet

“La scoperta della doppia elica mezzoLa scoperta della doppia elica mezzoLa scoperta della doppia elica mezzoLa scoperta della doppia elica mezzo

secolo fa ha coinvolto la praticasecolo fa ha coinvolto la praticasecolo fa ha coinvolto la praticasecolo fa ha coinvolto la pratica

medica con lentezza, ma sono probabilimedica con lentezza, ma sono probabilimedica con lentezza, ma sono probabilimedica con lentezza, ma sono probabili

trasformazioni significative neitrasformazioni significative neitrasformazioni significative neitrasformazioni significative nei

prossimi 50 anni.prossimi 50 anni.prossimi 50 anni.prossimi 50 anni.

Bisogna cambiare la pratica medica e laBisogna cambiare la pratica medica e laBisogna cambiare la pratica medica e laBisogna cambiare la pratica medica e laBisogna cambiare la pratica medica e laBisogna cambiare la pratica medica e laBisogna cambiare la pratica medica e laBisogna cambiare la pratica medica e la

formazione dei medici per poterformazione dei medici per poterformazione dei medici per poterformazione dei medici per poter

realizzare i potenziali benefici”realizzare i potenziali benefici”realizzare i potenziali benefici”realizzare i potenziali benefici”

Bell, Nature 421: 414, 2003

Tratta da “lezioni di genetica” Prof. PF Pignatti

• GCGGCGGCGGGCGGGTACTGGCTTCTGGGGCCAGGGGCCAGGGGCGGTGGGCGCCGGGACCGCGGAGCTGAGGAGCGGGGCCCGGCCAGGGCTGGAGACTTTGCGCCCGGGGGCACCGGGGCTGCGCGCGGTCGCACACATCCACCGGCGCGGCTTCCCTCGGCGGCCCGGGCTCCGCTCATCCTGCGGCGGGCGGCGCCGCTCAGGGGCGGGAAGAGGAGGCGGTAGACGCGACCACAGAAGATGATGATGATGTCGGGCCAAACGCTCACGGATCGGATCGCCGCCGCTCAGTACAGCGTTACAGGCTCTGCTGTAGCAAGAGCGGTCTGCAAAGCCACTACTCATGAAGTAATGGGCCCCAAGAAAAAGCACCTGGACTATTTGATCCAGGCTACCAACGAGACCAATGTTAATATTCCTCAGATGGCCGACACTCTCTTTGAGCGGGCAACAAACAGTAGCTGGGTGGTTGTGTTTAAGGCTTTAGTGACAACACATCATCTCATGGTGCATGGAAATGAGAGATTTATTCAATATTTGGCTTCTAGAAATACACTATTCAATCTCAGCAATTTTTTGGACAAAAGTGGATCCCATGGTTATGATATGTCTACCTTCATAAGGCGCTATAGTAGATATTTGAATGAAAAGGCTTTTTCTTACAGACAGATGGCCTTTGATTTTGCCAGGGTGAAGAAAGGGGCCGATGGTGTAATGAGGACAATGGCTCCCGAAAAGCTGCTAAAGAGTATGCCAATACTACAGGGACAAATTGATGCACTGCTTGAATTTGATGTGCATCCAAATGAACTAACAAATGGTGTCATAAATGCAGCATTTATGCTTCTTTTCAAAGATCTTATCAAACTTTTTGCTTGCTACAATGATGGTGTTATTAACTTACTCGAAAAGTTTTTTGAAATGAAGAAAGGACAATGTAAAGATGCTCTAGAAATTTACAAACGATTTCTAACTAGAATGACACGAGTGTCTGAATTTCTCAAGGTTGCAGAGCAAGTTGGTATTGATAAAGGTGACATTCCTGACCTCACACAGGCTCCCAGCAGTCTTATGGAGACGCTTGAACAGCATCTAAATACATTAGAAGGAAAGAAACCTGGAAACAATGAAGGATCTGGTGCTCCCTCTCCATTAAGTAAGTCTTCTCCAGCCACAACTGTTACGTCTCCTAATTCTACACCAGCTAAAACTATTGACACATCCCCACCGGTTGATTTATTTGCAACTGCATCTGCGGCTGTCCCAGTCAGCACTTCTAAACCATCTAGTGATCTCCTGGACCTCCAGCCAGACTTTTCCTCTGGAGGGGCAGCAGCAGCCGCAGCACCAGCACCACCACCACCTGCTGGAGGAGCCACTGCATGGGGAGACCTTTTGGGAGAGGATTCTTTGGCTGCACTTTCCTCTGTTCCCTCTGAAGCACAGATTTCAGATCCATTTGCACCAGAACCTACCCCTCCTACTACAACTGCTGAAAT

Human Genome Project

15 February 200115 February 200115 February 200115 February 2001

CTTTCCTCTGTTCCCTCTGAAGCACAGATTTCAGATCCATTTGCACCAGAACCTACCCCTCCTACTACAACTGCTGAAATTGCAACCACTACTGCTGCCACCGCCGCTGCCACCACCACTACCATTCATCTCTTGCCAGCTTAGTAGGCAATCTTGGAATTTCTGGTACCACAACAAAAAAGGGAGATCTTCAGTGGAATGCTGGAGAGAAAAAGTTGACTGGTGGAGCCAACTGGCAGCCTAAAGTAGCTCCAGCAACCTGGTCAGCAGGCGTTCCACCAAGTGCACCTTTGCAAGGAGCTGTACCTCCAACCAGTTCAGTTCCTCCTGTTGCCGGGGCCCCATCGGTTGGACAACCTGGAGCAGGATTTGGAATGCCTCCTGCTGGGACAGGCATGCCCATGATGCCTCAGCAGCCGGTCATGTTTGCACAGCCCATGATGAGGCCCCCCTTTGGAGCTGCCGCTGTACCTGGCACGCAGCTTTCTCCAAGCCCTACACCTGCCAGTCAGAGTCCCAAGAAACCTCCAGCAAAGGACCCATTAGCGGATCTTAACATCAAGGATTTCTTGTAAACAATTTAAGCTGCAATATTTGTGACTGAATAGGAAAATAAATGAGTTTGGAGACTTCAAATAATAATAATAAGATTGATGCTGAGTTTCAAAGGGAGCCACCAGTACCAAACCCAATACTTACTCATAACTTCTCTTCCAAAATGTGTAACACAGCCGTGAAAGTGAACATTAGGAATATGTACTACCTTAGCTGTTATCCCTACTCTTGAAATTGTAGTGTATTTGGATTATTTGTGTATTGTACGATGTAAACAATGAATGGATGTTACTGATGCCGTTAGTGCTTTTTTGGACTTCACCTGAGGACAGATGATGCAGCTGTTGTGTGGCGAGCTATTTGGAAAGACGTCTGTGTTTTTGAAGGTTTCAATGTACATATAACTTTTGAACAAACCCCAAACTCTTCCCATAAATTATCTTTTCTTCTGTATCTCTGTTACAAGCGTAGTGTGATAATACCAGATAATAAGGAAAACACTCATAAATATACAAAACTTTTTCAGTGTGGAGTACATTTTTCCAATCACAGGAACTTCAACTGTTGTGAGAAATGTTTATTTTTGTGGCACTGTATATGTTAAGAAATTTTATTTTAAAAAATATAAAGGTTAACGTCCATAATAAATACTTCTCTTTGAAGCTACCTTATCAAGAACGAAAAATCGTATGGGAAGAATCCCCTATTTATCACTGCTATATTAAAATATATATATTTTAATTATATTTGACAGGTTTTGCATCTAAATTGACCTATTTATTCATTCTTGATTAAATGCACTGAAAAGTAAAATTTAAAAGTGGTTGTATCTGAATTTACTGTGGGGATAACATACACTGTAATGGGGAAAAATTACCTAAAACCAATTTCAAAATGGCTTTCTTTGTATTTCAGTTTAAAAACCCAGTGCATGTACGCCCTCTGAGATGCAATAAACACCTTGAACAAAG

Studio delle malattie genetiche

Dal Fenotipo al Genotipo

Dal Genotipo al Fenotipo

Year Disease MIM n Location Gene Chromosome abnormality 1986 Duchenne muscular

dystrophy 310200 Xp21.3 DMD (a) del(X)(p21.3)

(b) t(X;21)(p21.3:p13) Retinoblastoma 180200 13q14 RB del(13)(q13.1q14.5) 1989 Cystic fibrosis 219700 7q31 CFTR None 1990 Neurofibromatosis 1 162200 17q11.2 NF1 Balanced translocations t(1;17)(p34.3:q11.2) t(17;22)(q11.2:q11.2) Wilms' tumor 194070 11p13 WT1 del(11)(p14p13) 1991 Aniridia 106210 11p13 PAX6 t(4;11)(q22;p13) del(11)(p13) Familial polyposis coli 175100 5q21 APC del(5)(q15q22) Fragile-X syndrome 309550 Xq27.3 FMR1 FRAXA fragile site Fragile-X syndrome 309550 Xq27.3 FMR1 FRAXA fragile site Myotonic dystrophy 160900 19q13.3 DMPK None 1993 Huntington's disease 143100 4p16 HD None Tuberous sclerosis 2 191092 16p13 TSC2 Microdeletions in candidate

region von Hippel-Lindau disease 193300 3p25 VHL Microdeletions in candidate

region 1994 Achondroplasia 100800 4p16 FGFR3 None Early-onset breast/ovarian

cancer 113705 17q21 BRCA1 None

Polycystic kidney disease 173900 16p13.3 PKD1 t(16;22) (p13.3;q11.21) 601313 1995 Spinal muscular atrophy 253300 5q13 SMN1 None 600354

The ENCODE Project:

ENCyclopedia Of DNA Elements

Researchers Expand Efforts to Explore Functional Landscape of the Human Genome

Full-Scale ENCODE Project Will Survey Entire Human Instruction Book

The ENCODE Project: ENCyclopedia Of DNA Elements

Bethesda, Md., Tues., Oct. 9, 2007 – The National Human Genome Research Institute (NHGRI), part of the National Institutes of Health (NIH), today announced grants totaling more than $80 million over the next four years to expand the ENCyclopedia Of DNA Elements (ENCODE) project, which in its pilot phase yielded provocative new insights into the organization and function of the human genome.

The principal investigators chosen to receive the ENCODE scale-up grants are:

•Bradley Bernstein, M.D., Ph.D.; Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, Mass.; $4.8 million

(four years); High-Throughput Sequencing of Chromatin Regulatory Elements. Utilizing the technique of

chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput DNA sequencing, this team will map

modifications of histones in various types of human cells. Histones are proteins that play a key role in

DNA packaging.

•Gregory Crawford, Ph.D.; Duke University Institute for Genome Sciences & Policy, Durham, N.C.; $6.5

million (four years); Comprehensive Identification of Active Functional Elements in Human Chromatin.

These researchers will seek to identify and characterize regions of open chromatin through DNase I

hypersensitivity assays, formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements and chromatin

immunoprecipitation for a few key DNA-binding factors. Chromatin is the complex of DNA and proteins

that makes up chromosomes.

•Thomas Gingeras, Ph.D.; Affymetrix Inc., Santa Clara, Calif.; $10.2 million (four years); Comprehensive

Characterization and Classification of the Human Transcriptome. This group will identify protein-coding

and non-protein-coding ribonucleic acid (RNA) transcripts using microarrays, high-throughput

sequencing, sequenced paired-end ditags and sequenced cap analysis of gene expression tags. RNA is

an information molecule vital to a number of biological functions, including protein production.

•Richard Myers, Ph.D.; Stanford University, Stanford, Calif.; $14.6 million (four years); Global

Annotation of Regulatory Elements in the Human Genome. This group has two goals: to identify

transcription factor binding sites by using chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput

sequencing, and to pilot the use of high-throughput sequencing to determine the methylation status of

CpG-rich regions of the human genome. Transcription factors are proteins and enzymes that initiate the

transcription of a gene's DNA sequence into RNA. Methylation refers to a specific chemical modification

of DNA, which can silence or reduce the activity of the affected region of DNA.

Malattie genetiche

Ad eredità mendelianaTalassemia, falcemia, fibrosi cistica

Studio delle malattie genetiche

Malattie genetiche

Fenotipi complessiNeoplasie, malattie degenerative

• Malattie genetiche

• Differente predisposizione a determinate

Variazioni del genoma causano o

contribuiscono all’insorgenza di malattia

• Differente predisposizione a determinate

patologie

• Differente risposta a specifiche terapie

• Differente risposta a stress ambientali, a virus,

a tossine

Differente predisposizione a determinate patologie

Differente risposta a specifiche terapie

Tratta da “lezioni di genetica” Prof. PF Pignatti

Differente risposta a specifiche terapie

Oltre alle classiche malattie genetiche,

la risposta a stress ambientali, a virus, a tossine

dipendono dal genoma individuale.

Variazioni della sequenza del genoma quindi

causano o contribuiscono

all’insorgenza di malattie.

Classificazione

????????????

Dogma centrale della Biologia

PROTEINEDNA RNA

Regolazione dell’espressione genica

Fenotipo dell’individuo

Fenotipo della cellula

I differenti tipi cellulari di un

organismo multicellulare nonostante

abbiano lo stesso genoma

differiscono nettamente sia nella

struttura che nella funzione

Il fenotipo cellulare è determinato

fondamentalmente dalle differenti proteinefondamentalmente dalle differenti proteine

presenti in quel determinato

tipo cellulare

Proteine costitutiveIndispensabili per la sopravvivenza

La loro concentrazione deve rimanere costante

Fenotipo della cellula

Proteine adattativeCambiamenti delle condizioni ambientali

Produrre risposte metaboliche a specifici segnali

Proteine del differenziamento

Assunsione ed espressione permanente di nuove funzioni specifiche

Geni housekeeping– Sempre ugualmente espressi in tutti i tipi cellulari

Geni la cui espressione è regolata- Varia Geni la cui espressione è regolata- Varia nei differenti tipi cellulari o in diversi momenti del ciclo cellulare

Il fenotipo cellulare è determinato

fondamentalmente dalle differenti

proteine presenti in quel determinato

tipo cellulare

e quindi

dall’espressione differenziale del genoma

COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE?

• Si dicono Biotecnologie l’utilizzazione integrata di biochimica, biologia cellulare e ingegneria genetica per realizzare ingegneria genetica per realizzare applicazioni tecnologiche a partire dalle proprietà di microorganismi, di colture cellulari ed altri agenti biologici (Federazione Europea Biotecnologie).

�La Genentech infatti riesce a far produrre aE.coli delle proteine umane ricombinanti: lasomatostatina (1977) e, l'anno successivo, ilfarmaco biotecnologico più famoso, ovverol'insulina, che verrà commercializzata a partire dal1981 segnando un cambiamento epocale perl'industria del farmaco, aprendo cosìl'industria del farmaco, aprendo cosìall'industrializzazione del settore biotecnologico,precedentemente confinato nei laboratori diricerca, ma soprattutto rivoluzionando il processodi drug discovery e lo sviluppo di nuove terapienon invasive.

– L’insulina e l’ormone della crescita umani sono stati i primi prodotti farmaceutici ottenuti con l’uso della tecnologia del DNA ricombinante.

– Prima del 1982, le principali fonti di insulina erano i tessuti di suini e bovini prelevati nelle macellerie.

• Vaccini

– Grazie alla tecnologia del DNA i ricercatori sono in grado si sintetizzare anche nuovi vaccini (epatite B, influenza…).

– Un vaccinoè una variante o un derivato innocuo di un agente patogeno (di solito un batterio o un virus) ed è utilizzato per prevenire una malattia infettiva.

• Ricerca Biologica, Diagnosi e cura delle malattie

– In campo medico la tecnologia del DNA ricombinante è sempre più usata per comprendere i processi biochimici e cellulari della vita. Queste nuove conoscenze permettono di diagnosticare e curare le malattie.

QUALI SONO LE APPLICAZIONI DELLE BIOTECNOLOGIE IN MEDICINALe biotecnologie applicate in medicina servono ad esempio per: •fabbricare medicine quali l'insulina che serve per curare le persone affette da diabete, l'ormone della crescita o somatotropina che serve per curare alcune forme di nanismo, e l'eritropoietina che serve nei casi di anemia•produrre gli interferoni che servono per combattere virus, per far regredire tumori•produrre gli antibiotici su scala industriale per difenderci dai batteri•produrre vaccini per esempio per difenderci dal virus dell'epatite B o dalla •produrre vaccini per esempio per difenderci dal virus dell'epatite B o dalla Bordetella pertussis, batterio responsabile della pertosse•individuare malattie infettive o genetiche in periodo prenatale e curare alcune malattie genetiche attraverso la terapia genica.

QUALI SONO I RISCHI DELLE BIOTECNOLOGIE

Sono annoverati fra i possibili rischi delle biotecnologie:

allergie negli adulti e nei bambini

mais geneticamente modificato provoca resistenza nei confronti di sostanze analoghealla penicillina

resistenza ai pesticidi delle piante coltivateresistenza ai pesticidi delle piante coltivate

contaminazione di altri organismi o apparizione di nuovi virus, ibridazioni incontrollatein natura

perdita di diversità di specie e di habitat

aumento dell'inquinamento genetico

cambiamenti delle condizioni socioeconomiche dovute all'uso delle tecnologie delDNA ricombinante