POLITECNICO DI MILANO

Scuola di Ingegneria Industriale e dell'Informazione

Corso di Laurea Magistrale in Ingegneria Biomedica

Progetto e realizzazione di un sensore di capacità

per misure in liquido ad elevata stabilità

Relatore: Prof. Marco Carminati

Correlatore: Prof. Giorgio Ferrari

Tesi di Laurea Magistrale di:

Cosimo Damiano Longo (matr. 836832)

Anno Accademico 2015/2016

A Ginevra,

inesauribile fonte di ispirazione.

Ringraziamenti

I miei più sinceri ringraziamenti vanno al Professor Marco Carminati, per avermi pro-

posto questo progetto ed avermi dato la possibilità di scoprire l'aascinate universo

della microfabbricazione.

Al Professor Giorgio Ferrari, che mi ha fornito preziosi consigli per arontare le

dicoltà incontrate durante questo lungo percorso e per avermi assistito, con premura

e costanza, nella fase di revisione dell'elaborato.

A Claudio Somaschini, allo sta e ai dottorandi del PoliFAB, per avermi fatto da

guida all'interno di un laboratorio dove la solidarietà e la collaborazione reciproca vale

più di tutto.

Ai docenti, ai dottorandi e ai tesisti del laboratorio I3N , che mi hanno fatto sentire

parte di una grande famiglia unita dalla passione per la scienza.

Alla mia famiglia, per avermi supportato in ogni mia scelta ed aver sempre creduto

in me.

Inne alla mia ragazza Ginevra, che con il suo amore sincero e la sua inestinguibile

gioia di vivere, mi ha fatto capire che non bisogna aver paura di volare.

Indice

1 Introduzione 5

1.1 Metodi di detezione elettrochimici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.2 Obiettivi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2 Soluzione proposta 22

2.1 Panoramica sul sensore progettato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.1.1 Stabilizzazione della temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2.1.2 Sensore capacitivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.1.3 Sonde per il riconoscimento molecolare . . . . . . . . . . . . . . 34

2.2 Progettazione dei dispositivi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.2.1 Progettazione dell'attuatore termoelettrico . . . . . . . . . . . . 39

2.2.2 Progettazione dei sensori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.2.3 Progettazione della microuidica . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3 Implementazione 56

3.1 Realizzazione dei dispositivi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.1.1 Fotolitograa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3.1.2 Deposizione dell'oro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

3.1.3 Lift-o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.1.4 Realizzazione della microuidica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

3.2 Lettura ed elaborazione dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

3.2.1 Elaborazione del segnale capacitivo . . . . . . . . . . . . . . . . 85

3.2.2 Elaborazione del segnale di temperatura . . . . . . . . . . . . . 88

I

4 Risultati sperimentali 93

4.1 Eetti dell'evaporazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

4.2 Eetti della variazione di temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

4.3 Detezione capacitiva di microsfere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

4.4 Detezione capacitiva di un Self-Assembled Monolayer . . . . . . . . . . 120

5 Conclusioni 125

5.1 Limiti attuali e sviluppi futuri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

5.1.1 Esempio di automatizzazione della ricerca di DNA . . . . . . . . 129

A Guida alla produzione del sensore in PoliFAB 132

A.1 Litograa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

A.1.1 Preparazione del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

A.1.2 Esposizione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136

A.1.3 Sviluppo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

A.1.4 Reow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

A.1.5 Valutazione del risultato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

A.1.6 SU8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

A.2 Sputtering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

A.2.1 Caricamento del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

A.2.2 Deposizione del metallo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

A.3 Lift-o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147

A.4 PDMS Molding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150

A.5 Plasma bonding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153

B Script MATLAB 2016b per automatizzare l'analisi 155

II

Elenco delle gure

1.1 Struttura DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.2 Fasi PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.3 Reazione REDOX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.4 Esempio voltammogramma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.5 Double Layer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.6 ISFET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.7 Sensore nanolo silicio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.8 Modello elettrico soluzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.9 Modello elettrico processo non faradico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.10 Misura impedenza coltura cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.11 Alterazione Double Layer molecole DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

1.12 Instabilità misura DNA con Double Layer . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.1 Costante dielettrica dell'acqua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2 Diagramma di funzionamento della soluzione proposta . . . . . . . . . 25

2.3 Schema struttura approssimata dispositivo . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.4 Posizione sensore termico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.5 Funzionamento Cella Peltier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.6 Schema funzionamento HTC3000 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.7 Modello detezione elettronica analita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.8 Struttura biosensore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.9 Creazione Self-Assembled Monolayer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.10 Design fotomaschera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.11 Design attuatore termico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

III

2.12 Modello capacità misurata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.13 Design Geometria 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

2.14 Design Geometria 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

2.15 Design Geometria 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

2.16 Rappresentazione schematica interfaccia oro-PDMS-substrato . . . . . . 54

2.17 Circuiti microuidici realizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.1 Foto sensore realizzato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

3.2 Datasheet SU-8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.3 Polarità fotoresist . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3.4 Angolo pareti fotoresist . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.5 Polarità fotoresist e lift-o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.6 Inversione polarità fotoresist . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.7 Spin coating AZ 5214E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

3.8 Foto difetti fotolitograa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.9 Foto maschera poliestere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

3.10 Foto bolle maschera poliestere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.11 Foto ottimizzazione litograa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

3.12 Foto substrato litografato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

3.13 Foto litograa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.14 Prolometria resist . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.15 Processo di sputtering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.16 Foto substrato dopo sputtering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.17 Foto substrato dopo lift-o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.18 Sintesi processo deposizione metallo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

3.19 Foto lift-o fallito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

3.20 Foto dopo lift-o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

3.21 Prolometria layer metallico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

3.22 Curve spin SU8-2000 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

3.23 Datasheet AZ 5214E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

3.24 Litograa Master Mold microuidico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

IV

3.25 Processo di Plasma Bonding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

3.26 Principio amplicatore Lock-In . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

3.27 Diagramma a blocchi Zurich Instrument HF2LI . . . . . . . . . . . . . 84

3.28 Speciche tecniche Zurich Instrument HF2LI . . . . . . . . . . . . . . . 84

3.29 Diagramma a blocchi Zurich Instrument HF2TA . . . . . . . . . . . . . 85

3.30 Diagramma a blocchi FEMTO DHPCA-100 . . . . . . . . . . . . . . . 86

3.31 Speciche tecniche FEMTO DHPCA-100 . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

3.32 Catena elaborazione segnale capacitivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

3.33 Spettro potenza rumore elettronico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

3.34 Catena elaborazione segnale resistivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

3.35 Circuito connessione controller termico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

4.1 Schema collegamento setup sperimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

4.2 Foto setup sperimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

4.3 Foto sensore test evaporazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

4.4 Esperimento evaporazione - Misura capacità camera reazione . . . . . . 98

4.5 Esperimento evaporazione - Misura sfasamento capacità camera reazione 99

4.6 Esperimento evaporazione - Misura capacità microcanale . . . . . . . . 100

4.7 Esperimento evaporazione - Misura sfasamento capacità microcanale . . 100

4.8 Esperimento temperatura 1 - Misura capacitiva . . . . . . . . . . . . . 103

4.9 Esperimento temperatura 1 - Misura temperatura . . . . . . . . . . . . 103

4.10 Esperimento temperatura 2 - Misura capacitiva . . . . . . . . . . . . . 105

4.11 Esperimento temperatura 2 - Misura temperatura . . . . . . . . . . . . 106

4.12 Esperimento temperatura 3 - Misura capacitiva . . . . . . . . . . . . . 108

4.13 Esperimento temperatura 3 - Misura temperatura . . . . . . . . . . . . 108

4.14 Esperimento temperatura 3 - Misura capacitiva e uttuazioni . . . . . . 110

4.15 Esperimento temperatura 3 - Misura temperatura e uttuazioni . . . . 110

4.16 Esperimento temperatura 4 - Misura capacitiva . . . . . . . . . . . . . 112

4.17 Esperimento temperatura 4 - Misura temperatura . . . . . . . . . . . . 112

4.18 Esperimento temperatura 4 - Misura capacitiva controller attivo . . . . 113

4.19 Esperimento temperatura 4 - Misura temperatura controller attivo . . . 113

V

4.20 Esperimento Microsfere - Misura capacitiva . . . . . . . . . . . . . . . . 117

4.21 Esperimento Microsfere - Misura sfasamento capacità . . . . . . . . . . 118

4.22 Esperimento Microsfere - Misura temperatura . . . . . . . . . . . . . . 118

4.23 Esperimento SAM - Misura capacitiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

4.24 Esperimento SAM - Misura sfasamento capacità . . . . . . . . . . . . . 122

4.25 Esperimento SAM - Misura temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

5.1 Legame DNA-PNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

A.1 Dispositivo prodotto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

A.2 Hotplate Sawatec. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

A.3 Spin coater . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

A.4 Mask aligner. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

A.5 Carrello porta-maschere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

A.6 Foto microscopia maschera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

A.7 Foto ottimizzazione litograa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

A.8 Macchina deposizione lm sottile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

A.9 Camera reazione sputtering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

A.10 Camera creazione vuoto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

B.1 Architettura software Zurich Instrument . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

VI

Sommario

I recenti anni sono caratterizzati da un forte interesse per i Lab-On-a-Chip. Questi

dispositivi a basso costo possono diagnosticare un gran numero di patologie (come per

esempio malaria, tubercolosi, neoplasie o HIV) o eettuare test genetici senza l'utilizzo

di un laboratorio specializzato in tempi molto rapidi. Ciò li rende particolarmente

adatti per applicazioni Point-Of-Care e per test di screening nalizzati alla diagnosi

precoce, infatti il loro utilizzo permetterebbe di abbattere il costo umano ed economico

che tali patologie hanno a livello sociale.

L'uso dei Lab-On-a-Chip per diagnosticare un crescente numero di patologie ha reso

necessario il miglioramento delle strategie di detezione molecolari e cellulari. Un insieme

di tecniche particolarmente utile per semplicità ed economicità di implementazione

in tale settore applicativo è costituito dai metodi basati sulla misura di parametri

elettrici. Tra questi gurano le misure capacitive in liquido, che possono essere anche

utilizzate per individuare la presenza di biomolecole ed analiti in un campione biologico

sfruttando dei biorecettori e delle reazioni chimiche disponibili solo in soluzioni acquose.

Rispetto ad altri metodi (per esempio ottici, gravimetrici, meccanici, magnetici), tali

misure permettono di ridurre i costi dell'analisi grazie ad una maggiore semplicità di

produzione e ad una minore necessità di reagenti, ma sono generalmente aette da

problemi di stabilità, le cui dinamiche non sono ancora del tutto note.

L'obiettivo del progetto esposto nella seguente tesi è quello di identicare ed ana-

lizzare le possibili cause delle limitazioni di stabilità delle misure capacitive in liquido.

Esse sono state ricondotte all'evaporazione del liquido e alla presenza di uttuazioni

termiche e dunque, sulla base di tale ipotesi, è stato progettato un dispositivo composto

da due sensori capacitivi, da un circuito microuidico e da un sensore di temperatu-

ra. I tre sensori sono realizzati su un substrato di vetro in tecnologia planare con

1

un unico passo litograco garantendo un processo riproducibile e a basso costo. Il

sensore di temperatura è realizzato nelle immediate vicinanze dei sensori capacitivi

per permettere una stabilizzazione della temperatura nell'area di detezione, mentre il

canale microuidico, in cui è stata iniettata la soluzione, impedisce l'evaporazione. I

due sensori capacitivi permettono di implementare una misura dierenziale per ridurre

ulteriormente l'eetto delle uttuazioni indesiderate. Tale dispositivo è stato poi rea-

lizzato utilizzando la cleanroom del laboratorio di ateneo PoliFAB, inserito in un setup

sperimentale appositamente sviluppato e sottoposto a sperimentazione per valutare il

metodo di lettura capacitiva e di temperatura esposto all'interno dell'elaborato.

L'eetto dell'evaporazione è stato valutato confrontando l'andamento del segnale

capacitivo in presenza ed in assenza del circuito microuidico. L'eetto della tempe-

ratura è stato analizzato valutando le variazioni capacitive con diverse temperature, la

capacità del sistema ideato di fornire una lettura capacitiva stabile durante registrazioni

notturne, il miglioramento prestazionale introdotto dall'utilizzo di una lettura dieren-

ziale per compensare le uttuazioni termiche e la capacità del sistema di compensare

stimoli termici esterni in un possibile scenario di utilizzo. I risultati sperimentali han-

no confermato l'importanza del controllo della temperatura e di mantenere limitata

l'evaporazione durante l'esperimento. Il metodo proposto ha permesso di migliorare la

stabilità del sistema, abbassando la deviazione quadratica media normalizzata della mi-

sura capacitiva da 1253ppm a 8.1ppm, e quindi migliorando di 154 volte le prestazioni

ottenute.

Il sistema realizzato è stato utilizzato con successo per individuare la sedimentazione

di microsfere nel canale microuidico.

Benché il primo prototipo sia stato realizzato per semplicità con una spaziatura tra

le armature del sensore capacitivo di 25µm, non compatibile con applicazioni di detezio-

ne molecolare, il metodo proposto può essere applicato su geometrie sub-micrometriche,

più adatte a problemi di questo tipo.

2

Summary

In the last few years the interest in Lab-On-a-Chip devices has been increasing. These

low cost devices are able to diagnose a number of diseases, such as malaria, tubercu-

losis, neoplasias, HIV and to get fast genetic tests without using a specic laboratory.

It makes them suitable for Point-Of-Care applications and screening tests of early dia-

gnosis. In fact, their use would entail a reduction of the human and economic costs

that characterize these deseases and aect our society.

The use of Lab-On-a-Chip to diagnose an increasing number of deseases has required

an improvement of molecular and cellular detection strategies. A particularly useful

system in terms of simplicity and cost of implementation in this eld of application

is based on the measurement of electrical parameters. Among them, the capacitive

measurements of a liquid sample can be used to detect the presence of biomolecules and

analytes in a biological sample, exploiting the bioreceptors and the chemical reactions

that are only available in water-based solutions. Comparing them with other methods

(e.g. optical, gravimetric, mechanical, magnetic methods), these techniques entail a

cost reduction of the analysis by a major simplicity in terms of production and by a

lower usage of chemical reagents. Nevertheless, they are often aected by problems in

stability, whose dynamics have not been deeply inspected.

The aim of the project, which is reported in the following essay, is the analysis

of the possible factors that limits the stability of the capacitive measurements into

a liquid environment. The instability of the measurements has been associated with

the evaporation and the appearence of temperature uctuations. On the basis of this

working hypothesis, a device has been designed. It consists of two capacitive sensors,

a microuidic circuit and a temperature sensor. These sensors have been realized on

a glass substrate using a planar technology with only one photolithographic step, in

3

order to guarantee the reproducibility and the low cost of the fabbrication process. The

temperature sensor has been located near the capacitive sensors in order to stabilize

the temperature of the detection area. The solution under test is injected in the sensor

using a microuidic channel with the purpose of blocking evaporation. This device has

been created using the Cleanroom in the PoliFAB laboratory; it has been inserted in

a specically developed experimental setup, then it has been tested to evaluate the

method of capacitive and temperature measurement, as displayed in this essay.

The evaporation eect has been evaluated by monitoring the capacitive signal in

presence and in absence of the microuidic circuit. The temperature eect has been

quantied by measuring the capacitance at dierent temperatures. The system sta-

bility has been analyzed with overnight recordings. The improvement of the stability

oered by a local control of the temperature has been evaluated. In addition, the usa-

ge of a dierential measurement in order to compensate temperature uctuations has

been evaluated as well. The experimental results conrms the importance of tempe-

rature control and the importance of limiting the evaporation of the solution during

the experiment. In the course of a number of experiments, the initial assumptions

about the origin of instability have been veried. The proposed method has led to an

enhancement in stability up to 154 times, lowering the normalized root mean square

deviation from 1253ppm to 8.1ppm as far as a capacitive measurement is concerned.

The device has been successfully used to detect the sedientation of microspheres

into the microuidic channel.

Although the rst prototype has been realized with spacing between the electrodes

of 25µm, a dimension that is not compatible with molecular detection issues, this me-

thod can be fabbricated using submicrometric patterns, paving the way to an improving

of the capacitive sensors for molecular detection.

4

Capitolo 1

Introduzione

I recenti anni sono caratterizzati da un forte sviluppo delle nanotecnologie e della loro

applicazione in svariati ambiti. La ricerca su nuovi materiali e le nuove tecniche di

produzione di microdispositivi hanno permesso la nascita e lo sviluppo dei Lab-On-

a-Chip [34]: dei dispositivi in grado di integrare in uno spazio molto piccolo quanto

necessario per lo svolgimento di un gran numero di reazioni chimiche che normalmente

dovrebbero essere svolte in un laboratorio specializzato.

Grazie alle loro dimensioni ridotte, i tempi di diusione delle molecole sono mi-

nori, quindi la durata delle reazioni chimiche ed i volumi dei reagenti necessari sono

notevolmente inferiori rispetto ad approcci tradizionali, e ciò li rende particolarmen-

te interessanti per applicazioni Point-Of-Care, in contesti in cui non si dispone di un

laboratorio di analisi completo [44] [45]. In tale contesto l'utilizzo dei Lab-On-a-Chip

ridurrebbe i costi da sostenere per un singolo test in quanto non richiederebbe la pre-

senza di macchinari o personale specializzato e tutti i passaggi dell'analisi potrebbero

essere eettuati da un unico dispositivo con un intervento minimo da parte dell'utente.

Essi vengono applicati in numerosi ambiti, come per esempio il conteggio di cellule,

il sequenziamento del DNA, la rilevazione di analiti in un campione, ma anche la

valutazione della qualità dell'acqua, o come supporto per attività di ricerca.

Un ulteriore possibile ambito di applicazione dei Lab-On-a-Chip sono i test di scree-

ning per l'individuazione di alcune patologie [42]: nel caso in cui si desiderasse eet-

tuare il medesimo esame chimico su diversi campioni biologici sarebbe possibile ridurre

drasticamente i tempi e i costi sfruttando questa tecnologia.

5

Negli ultimi anni è stata valutata la loro applicabilità anche per test non invasivi in

campo oncologico: in molti casi un intervento nelle prime fasi della malattia può essere

determinante per il processo di guarigione, quindi la possibilità di realizzare dei test di

screening per diagnosi precoce contribuirebbe a contenere il costo umano ed economico

introdotto da tali patologie. Un esempio in tale direzione è fornito dall'articolo [22], in

cui si discute la possibilità di individuare precocemente una massa tumorale ricercando

specici frammenti di DNA presenti nel circolo sanguigno.

Un dispositivo di questo tipo è costituito da:

un biorecettore in grado di interagire specicatamente con l'analita di interesse;

un trasduttore che trasforma il fenomeno sico individuato in un fenomeno elet-

trico;

un sistema elettronico in grado di amplicare, elaborare e visualizzare le infor-

mazioni relative alle reazioni osservate.

Molto spesso si sfrutta l'anità di molecole complementari per avere dei legami

specici: la complementarietà del complesso antigene-anticorpo, del complesso enzima-

proteina o della doppia catena dei lamenti di DNA permette la creazione di un legame

specico tra un elemento noto - il biorecettore - ed un elemento di cui si intende

vericare la presenza nel campione analizzato.

La specicità del legame creato, e quindi della detezione, può essere migliorata

scegliendo opportunamente le sonde biologiche da utilizzare: le caratteristiche della

molecola devono essere valutate in relazione al sistema progettato. Nel caso delle

sonde geniche è possibile sfruttare anche dei cambiamenti conformazionali dell'acido

nucleico in diverse condizioni di ibridazione [47] [48].

In molte applicazioni si utilizzano sensori di questo tipo per individuare la presenza

di speciche sequenze di DNA in un campione ignoto. Questa molecola, rappresen-

tata in Figura 1.1, è un acido nucleico con struttura polimerica orientata in cui ogni

monomero è costituito da un gruppo fosfato, il deossiribosio ed una base azotata (ade-

nina, guanina, citosina o timina). Ogni catena è caratterizzata principalmente da una

sequenza di basi azotate e può legarsi in modo antiparallelo ad una sequenza comple-

mentare. La formazione di legami idrogeno tra due eliche di DNA complementari è

6

detto ibridazione. Grazie alla forte anità fra le coppie di basi azotate, ogni catena

singola si lega in modo specico al suo complementare. Le due catene possono essere

separate aumentando la temperatura dell'ambiente: questo processo, detto denatura-

zione, permette la rottura dei legami idrogeno formatisi tra le basi. É possibile dunque

sfruttare le proprietà di ibridazione per legare in modo specico le sole molecole di

DNA complementari alla sequenza ricercata.

Generalmente la quantità di materiale genetico estratto da campioni biologici non

è suciente per eettuare un'analisi. Solitamente il test di detezione è preceduto

da un'amplicazione molecolare attraverso un processo denominato PCR (Polymerase

Chain Reaction) [13], che permette di aumentare esponenzialmente il numero di mo-

lecole di un acido nucleico di cui sono note le sequenze iniziali e nali di nucleotidi.

Questo processo avviene grazie ad enzimi polimerasi, generalmente attivi nelle cellule

durante la divisione cellulare, in grado di ricostruire una catena di DNA partendo da

un frammento esistente, la catena ad essa complementare e dei nucleotidi da legare

al frammento di partenza. Tale reazione può essere riprodotta in modo controllato in

laboratorio preparando una soluzione contente gli elementi precedentemente descrit-

ti e controllando le fasi di denaturazione, ibridazione ed estensione imponendo dei

cambiamenti termici per mezzo di un termociclatore.

La reazione, sintetizzata in Figura 1.2, avviene in tre fasi distinte che si ripetono

ciclicamente:

La denaturazione, in cui le due eliche complementari di DNA si separano. Essa

avviene aumentando la temperatura della soluzione no a circa 95;

L'ibridazione, durante la quale i frammenti iniziali e nali della sequenza da

amplicare (primer) si legano alle catene di DNA, a circa 50;

L'estensione, in cui l'enzima polimerasi lega i nucleotidi no a formare una repli-

ca complementare della sezione della catena delimitata dai due primer, ad una

temperatura di circa 72.

Questo processo permette di amplicare notevolmente quantità di DNA molto

piccole, ma è caratterizzato da alcuni svantaggi:

7

Figura 1.1: Struttura della molecola di DNA. É una catena polimerica la cui unità base

è composta da un gruppo fosfato, il deossiribosio ed una base azotata. Queste ultime

formano con le proprie complementari dei legami idrogeno, formando una molecola

dalla struttura di una doppia elica. Immagine tratta da https://en.wikipedia.org/

wiki/DNA

Figura 1.2: Fasi della reazione di PCR. Nella fase di denaturazione le due eliche si

separano, durante l'ibridazione i primer si legano alle estremità della sequenza da am-

plicare, inne durante l'estensione l'enzima polimerasi lega i nucleotidi presenti no

a realizzare una catena di DNA complementare a quella di partenza. Immagine tratta

da: https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

8

Richiede l'utilizzo di primer che devono essere opportunamente sintetizzati;

Una lunghezza insuciente dei primer porterebbe ad amplicazioni non speci-

che, in quanto essi potrebbero non essere in grado di delimitare con certezza la

sequenza genetica a cui si è interessati. Questo pone un limite alla lunghezza

minima delle sequenze a cui questa tecnica è applicabile (generalmente pari a

qualche decina di basi),

I reagenti ed i macchinari necessari aumentano i costi dell'analisi, che possono

raggiungere le decine di migliaia di euro;

In caso di contaminazione del campione, le sequenze estranee verrebbero ampli-

cate esponenzialmente e potrebbero generare errori nelle analisi successive.

Per queste ragioni sarebbe preferibile avere strumenti di misura talmente precisi da

non richiedere l'applicazione della PCR prima dell'analisi. La ricerca di nuove tecniche

in grado di individuare concentrazioni di DNA o di altri analiti in concentrazioni molto

basse è stata uno dei maggiori temi di interesse degli ultimi anni.

In alcune di esse il legame di complementarietà con il biosensore può essere in-

dividuato utilizzando dei marker uorescenti ed occorrerà un trasduttore di intensità

luminosa per individuare e quanticare l'evento. Questa soluzione richiede l'utilizzo

di marcatori specici per l'analita ricercato, il che comporta maggiori costi per ogni

singola analisi, inoltre per ottenere un'elevata sensibilità è richiesta una strumentazione

ottica costa ed ingombrante, quindi di dicile applicazione in ambito Point-Of-Care.

La detezione elettrochimica comprende un'ampia famiglia di tecniche basata sui se-

gnali elettrici [4]. Generalmente tali approcci permettono di semplicare notevolmente

la componente chimica e di ottenere sistemi integrati realizzabili tramite comuni tec-

niche fotolitograche, il che permette di ridurre i costi di produzione facendone un'al-

ternativa particolarmente interessante. Una breve panoramica sulle principali strategie

utilizzate è illustrata nel Paragrafo 1.1.

La detezione elettrochimica semplica la produzione dei sensori e l'automazione

del processo di analisi, ma introduce una dicoltà aggiuntiva: i biorecettori devono

essere ssati sugli elettrodi in modo da rendere individuabili le reazioni chimiche con

9

l'analita con elevata selettività. Questo processo può risultare laborioso nel caso in

cui occorra anche aggiungere ulteriori layer di legame o di passivazione sul sensore

e ciò aumenterebbe i tempi di produzione ed i costi. Un'interessante alternativa è

oerta dalla tecnica del Self-Assembled Monolayer [27], che permette di creare dei

layer uniformi di molecole tramite la chimica click. Comunemente si utilizzano dei tioli

per coprire superci in oro o dei silani in caso di superci con ossidi non metallici.

10

1.1 Metodi di detezione elettrochimici

Come descritto nel Libro [4], i metodi elettrochimici sfruttano processi sici faradici e

non faradici che avvengono all'interfaccia con l'elettrodo: nei primi si ha uno scambio

di cariche all'interfaccia, mentre nei secondi si ha solo una ridistribuzione delle cariche

presenti.

Le reazioni che presentano delle ossidoriduzioni all'interfaccia (REDOX ) appar-

tengono alla prima categoria, in quanto implicano uno scambio di n elettroni tra di-

versi elementi chimici. Questo processo può essere immaginato come lo svolgimento

contemporaneo di due semi-reazioni schematizzate in Figura 1.3:

Una reazione di riduzione, in cui ad una specie ossidante vengono aggiunti degli

elettroni, formando una specie ridotta secondo la relazione Ossidante + ne− →

Ridotta;

Una reazione di ossidazione, in cui una specie riducente cede elettroni, formando

una specie ossidata secondo la relazione Riducente→ Ossidata+ ne−;

Questa reazione può avvenire spontaneamente o essere imposta applicando un po-

tenziale all'interfaccia: quando esso è sucientemente alto si ha un'energia sucien-

te per eettuare uno scambio di elettroni, ciò signica che è possibile controllare la

reazione regolando il potenziale applicato all'interfaccia.

Variando il potenziale dell'elettrodo dal valore di ossidazione a quello di riduzione è

possibile registrare un segnale di corrente dipendente dal numero di processi REDOX

avvenuti all'interfaccia. Il risultato dell'analisi è detto voltammogramma, un esempio

è riportato in Figura 1.4. Se la chimica di detezione è opportunamente progettata è

possibile far si che l'analita ricercato introduca una dierente cinetica di reazione e,

quindi, che alteri il voltammogramma [46].

Questo metodo è fortemente legato alla chimica del problema esaminato. Esso

permette di discriminare dierenti comportamenti nella cinetica di reazione di ossi-

doriduzione, ma nel caso di scarse concentrazioni il segnale registrato può non essere

suciente. L'analita potrebbe non compiere facilmente una reazione REDOX all'in-

terfaccia: questo imporrebbe l'utilizzo di complesse funzionalizzazioni o di catene di

11

Figura 1.3: Fasi della reazione REDOX. In alto è illustrato il meccanismo di riduzione,

mentre in basso è rappresentata un'ossidazione. Immagine tratta da [4].

Figura 1.4: Esempio di voltammogramma. Si impone un potenziale con andamento

triangolare e si registra la corrente in un graco VI. I due picchi rappresentano la massi-

ma attività di ossidazione e riduzione: all'aumentare del potenziale tendono ad aevo-

lirsi a causa delle limitazioni dovute ai fenomeni di trasporto degli elementi coinvolti nel-

la reazione. Nel caso in cui vi sia un cambiamento nella composizione dell'interfaccia si

osserverebbero delle variazioni nell'ampiezza dei picchi o nel potenziale a cui avvengono.

Immagine tratta da https://it.wikipedia.org/wiki/Ciclovoltammetria

12

reazioni chimiche che portino ad uno scambio di elettroni all'interfaccia, aumentando

i costi dovuti ai reagenti chimici e la complessità di sviluppo e di realizzazione del

sistema.

Altre famiglie di tecniche individuano i processi non faradici che avvengono all'in-

terfaccia elettrodo-soluzione, detta Double-Layer e schematizzata in Figura 1.5. Que-

ste metodologie individuano una dierenza nella distribuzione delle cariche elettriche

associabili alla presenza dell'analita ricercato. Gli ioni così disposti in prossimità del-

l'elettrodo possono essere modellizzati come una capacità con perdite energetiche detta

Constant Phase Element.

Lo studio dei fenomeni di interfaccia non faradici può essere utilizzato in una gran

varietà di tecniche di analisi della soluzione. Gli sviluppi in campo della micro e na-

nofabbricazione hanno permesso la creazione degli ISFET, dei nuovi tipi di transistor

rappresentati in Figura 1.6 il cui comportamento varia a seconda delle caratteristiche

della soluzione. Si tratta di transistor FET il cui gate è costituito dalla soluzione da

analizzare: la corrente che attraversa il transistor cresce con l'aumentare della concen-

trazione ionica nella soluzione. Un esempio di applicazione di tale tecnica è illustrato

nell'articolo [3], in cui viene valutata l'ibridazione di molecole di DNA con delle sonde

geniche ssate su un layer isolante in corrispondenza del gate.

Questo sistema permette di realizzare in modo semplice un dispositivo di analisi

integrato, ma anche in questo caso spesso è necessario aumentare la complessità della

chimica di reazione per ottenere il risultato desiderato.

L'utilizzo di nanoli in silicio rappresenta un'altra interessante alternativa resa pos-

sibile dal progresso nel campo della nanofabbricazione. In questo caso si funzionalizza

un nanolo in silicio con dei biorecettori e si misura la sua resistenza prima e dopo il

contatto con la soluzione da analizzare. Se un analita si legasse alle sonde, causereb-

be un cambiamento locale delle proprietà elettriche del materiale, che provocherebbe

un'alterazione del valore di resistenza associato al sensore [49] [12]. Il meccanismo di

detezione è rappresentato in Figura 1.7.

Questa tecnica permette di integrare diversi sensori nello stesso dispositivo, ma la

loro realizzazione implica alcune dicoltà aggiuntive: il processo di funzionalizzazione,

che molto spesso richiede acidi o basi forti per attivare le superci, può danneggiare i

13

Figura 1.5: Distribuzione del potenziale nel Double Layer. Gli ioni presenti in soluzione

vengono attratti dall'elettrodo da forze elettrostatiche, formando l'Inner Helmholtz

Plane e l'Outer Helmholtz Plane, che delimitano il Double Layer. In questi strati la

concentrazione degli ioni tende man mano a diminuire a causa dell'eetto di schermo

oerto dagli ioni più vicini all'elettrodo. Immagine tratta da https://en.wikipedia.

org/wiki/Double_layer_(surface_science)

14

Figura 1.6: Schema di funzionamento di un ISFET. É un transistor FET il cui gate

è costituito dalla soluzione da analizzare. La corrente che scorre ai capi del source e

del drain dipende dal numero di ioni in soluzione. Immagine tratta da https://en.

wikipedia.org/wiki/ISFET

Figura 1.7: Schema di funzionamento di un sensore basato su nanoli di silicio. Fun-

zionalizzazione di un nanolo di silicio e principio di detezione di molecole di DNA.

Immagine tratta da [12].

15

nanoli a causa delle loro dimensioni contenute.

Immaginando di avere un sistema con due armature piane parallele separate dalla

soluzione da analizzare, sarebbe possibile creare un modello della situazione in cui la

soluzione ore un contributo capacitivo ed uno resistivo all'impedenza totale, secon-

do quanto illustrato in Figura 1.8. Utilizzando una stimolazione a bassa frequenza è

possibile valutare quanto avviene all'interfaccia elettrodo-soluzione, in corrispondenza

del Double-Layer. Aumentando la frequenza di stimolazione si osserverebbe l'eetto

resistivo della soluzione, calcolabile come R = ρLS, in cui ρ rappresenta la resistività

della soluzione e dipende fortemente dalla sua composizione chimica, L rappresenta la

distanza tra gli elettrodi e S la loro supercie. Utilizzando una frequenza di stimola-

zione sucientemente alta è possibile valutare il contributo capacitivo della soluzione:

in tale situazione il periodo della stimolazione è troppo basso per permettere dei feno-

meni di trasporto ionico e la soluzione si comporta come un dielettrico, permettendo

di misurare un contributo capacitivo calcolabile come C = εSL, in cui ε è la costante

dielettrica della soluzione. Il modello elettrico rappresentato in Figura 1.9 rappresenta

sinteticamente quanto precedentemente illustrato.

Figura 1.8: Modello elettrico di un sistema di armature piane parallele separate da

una soluzione. La soluzione può essere descritta da una componente resistiva e da

una capacitiva. All'interfaccia tra l'elettrodo e la soluzione è presente il Double Layer.

Immagine tratta dal materiale del corso di Biochip del prof. Marco Carminati.

Alcuni metodi valutano l'impedenza della soluzione per individuare la presenza del-

l'analita di interesse o l'evoluzione del sistema studiato. Ad esempio nell'articolo [18],

viene utilizzata la misura impedenziometrica per ottenere informazioni sulla prolifera-

zione cellulare utilizzando delle celle per la coltura cellulare sovrapposte ad elettrodi

16

interdigitati simili a quelle mostrate in Figura 1.10.

Figura 1.9: Modello elettrico di un processo non faradico. A bassa frequenza è possibile

osservare l'eetto del Double Layer, a frequenze maggiori il contributo dominante è dato

dalla resistenza della soluzione, mentre ad alta frequenza si osserva l'eetto capacitivo

della soluzione. Immagine tratta dal materiale del corso di Biochip del prof. Marco

Carminati.

Figura 1.10: Sistema per la misura di impedenza in una coltura cellulare. Delle celle

per coltura cellulare sono ssate su coppie di elettrodi interdigitati che permettono

la misura di impedenza all'interno dell'ambiente di coltura. Il dispositivo in gura è

prodotto da Applied BioPhysics Inc.

17

Diverse tecniche, come quella precedentemente illustrata, studiano la variazione

dell'impedenza del sistema elettrochimico utilizzando stimolazioni sinusoidali a die-

renti frequenze. In alcuni casi si valuta l'intero spettro di impedenza (Electrochemical

Impedance Spectroscopy), ma solitamente si sceglie di osservare il comportamento del

sistema ad una particolare frequenza, in modo da studiare le variazioni dei singoli

elementi del modello rappresentato in Figura 1.9.

Una alternativa particolarmente interessante è costituita dallo studio della capaci-

tà di Double Layer. Questa componente del modello è particolarmente sensibile alle

variazioni che avvengono all'interfaccia e potrebbe orire un'altissima sensitività di de-

tezione. Quando l'analita si trova in prossimità del substrato si ha una ridistribuzione

delle cariche nell'Inner Helmholtz Plane e nell'Outer Helmholtz Plane che altera il valo-

re di capacità associabile al Double Layer. Si immagini, ad esempio, che delle molecole

di DNA si leghino ad una sonda genica ssata sull'elettrodo: in tal caso si avrebbero

nuove cariche negative introdotte dai gruppi fosfato dell'acido nucleico a livello dell'in-

terfaccia elettrodo-soluzione, che provocherebbero anche una ridistribuzione degli ioni

presenti in soluzione, come illustrato in Figura 1.11. Tali variazioni creerebbero un'al-

terazione locale della distribuzione delle cariche sull'elettrodo che potrebbero essere

individuate applicando una stimolazione sinusoidale ad una frequenza sucientemente

bassa, secondo il modello esposto in Figura 1.9.

Figura 1.11: Alterazione del Double Layer dovuta a molecole di DNA. La presenza delle

molecole di DNA introduce nuove cariche negative in prossimità del sensore dovute ai

gruppi fosfato dell'acido nucleico e causa una ridistribuzione degli ioni in soluzione.

Immagine tratta da [7].

18

Questo approccio utilizza elettrodi facilmente realizzabili ed integrabili in dispositivi

elettronici in grado di automatizzare l'analisi del campione, inoltre può essere utilizzato

per individuare un gran numero di analiti dierenti.

É stato sperimentalmente osservato che la sensibilità della capacità di Double Layer

possa essere un ostacolo alla misura a causa dell'instabilità che essa comporta. La Fi-

gura 1.12 riporta dei dati sperimentali tratti dal libro [7], in cui è possibile osservare

che le prestazioni della misura vengono limitate dall'alto valore di deviazione stan-

dard dovuto all'instabilità del Double Layer. Altri tentativi in questa direzione hanno

evidenziato lo stesso problema [39] [40].

Figura 1.12: Instabilità nella misura di DNA mediante la valutazione delle proprietà

del Double Layer. L'ampia deviazione standard della misura dovuta all'instabilità del

Double Layer rende dicoltosa l'individuazione della presenza di molecole di DNA in

prossimità dell'elettrodo. Immagine tratta da [7].

Tali fenomeni, causati delle disuniformità di distribuzione di ioni che possono crearsi

nel tempo all'interfaccia, possono essere attenuati creando un layer di molecole sull'e-

lettrodo in modo da ridurre i punti di contatto che esso ha con gli ioni in soluzione.

Nell'articolo [8], in seguito alla creazione di un Self-Assembled Monolayer sull'elettrodo,

viene riscontrata una maggiore stabilità e riproducibilità del sistema.

La possibilità di stabilizzare il valore misurato dipende fortemente dalle caratteri-

stiche del layer aggiunto: come evidenziato dall'articolo [9], delle disuniformità abbas-

sano l'ecacia del metodo in quanto orono maggiori punti di contatto con la soluzione

19

la qualità della stabilizzazione dipende anche dal design delle molecole utilizzate per

coprire il metallo.

La creazione di un Self-Assembled Monolayer con le caratteristiche richieste com-

plica la realizzazione del sensore ed abbassa la sensitività alle alterazioni del Double

Layer, dal momento che il legame con l'analita avverrebbe ad una distanza maggiore

dall'elettrodo.

Una possibile alternativa nell'utilizzo delle misure capacitive in liquido è rappresen-

tato da letture a frequenze maggiori, in modo da osservare il contributo capacitivo della

soluzione presente tra le armature della capacità, in accordo col modello rappresentato

in Figura 1.9. In questo contesto si potrebbe evitare l'instabilità del Double Layer e si

potrebbe osservare un contributo capacitivo dipendente dalla soluzione e dalle molecole

in essa presenti.

Gli strumenti di misura elettronici attualmente disponibili consentono di raggiun-

gere un'accuratezza di misura dell'ordine di pochi ppm [6], ma tali prestazioni non

possono essere pienamente sfruttate a causa delle uttuazioni e dei drift che la misura

capacitiva in liquido generalmente presenta. Per massimizzare l'ecacia della misura

sarebbe necessario stabilizzare il valore di capacità del sistema no agli attuali valori

di accuratezza di misura possibili.

20

1.2 Obiettivi

L'obiettivo del progetto è esplorare le problematiche relative alla lettura capacitiva in

liquido ed intervenire su di esse al ne di migliorare la stabilità della misura.

Si desidera realizzare un sistema:

essibile e facilmente adattabile all'individuazione di analiti dierenti;

facilmente integrabile in un dispositivo costituito da una componente elettronica

di base ed un biosensore disposable;

semplice, economico ed utilizzabile come base per applicazioni Point Of Care e

test di screening.

che minimizzi l'uso di reagenti chimici e che renda possibile la misura in contesti

termici e pressori ambientali;

che permetta di ottenere un esito binario univocamente interpretabile sull'assenza

o la presenza dell'analita di interesse, senza richiedere operatori qualicati per

eettuare o interpretare il test;

Durante lo svolgimento del progetto si desidera indagare sulle principali cause di

instabilità della misura capacitiva in liquido e proporre delle tecniche per limitarne gli

eetti.

21

Capitolo 2

Soluzione proposta

In questo capitolo verrà proposta una tecnica per la stabilizzazione della detezione

molecolare capacitiva in liquido.

In seguitò verrà illustrato il design del sensore progettato per vericare sperimen-

talmente la tecnica proposta.

2.1 Panoramica sul sensore progettato

Partendo dalle passate esperienze di lettura capacitiva in liquido esposte nel Paragrafo

1.1, si è cercato di indagare sulle possibili ragioni dei fenomeni osservati. Si è osservato

che i fenomeni che aiggono la stabilità della misura sono dei drift e delle uttuazioni.

La durata di tali fenomeni permette di avanzare delle ipotesi sulle cause che potreb-

bero esserne responsabili: le uttuazioni osservate nell'arco di alcune ore danno l'idea

di un fenomeno lento e reversibile, mentre i drift sembrano indicare una alterazione

permanente del liquido osservato.

Si è ipotizzato che le uttuazioni del valore siano causate da variazioni termiche

nell'ambiente. Com'è possibile osservare in Figura 2.1, le proprietà dielettriche dell'ac-

qua cambiano notevolmente al variare della temperatura. Dal momento che in molti

casi le soluzioni osservate hanno base acquosa è possibile immaginare che le uttuazioni

termiche provochino delle alterazioni della costante dielettrica relativa che si traducono

in uttuazioni del valore capacitivo.

22

I drift suggeriscono un cambiamento irreversibile delle proprietà della soluzione,

che potrebbe essere causato dall'evaporazione del liquido: essa causerebbe un aumento

della concentrazione ionica e quindi della conducibilità della soluzione, che a causa

dell'errore di fase introdotto dal sistema di misura utilizzato si traduce in un lento ma

continuo aumento del valore misurato.

Si consideri un sistema di armature piane parallele dalle dimensioni di 100µm ×

100µm distanti 100µm e separate da acqua bidistillata. Ipotizzando che si sia interessati

ad individuare delle molecole di DNA con dimensioni 1.25nm× 1.25nm e lunghe 5nm

legate all'elettrodo. Applicando il modello descritto nel Paragrafo 2.1.2, secondo quanto

illustrato nel Paragrafo 2.2.2, si otterrebbe una variazione capacitiva pari a 4.7 ·10−27F

per ogni molecola legata.

Un aumento della temperatura di 0.1°C provocherebbe una diminuzione della co-

stante dielettrica relativa dell'acqua pari a 0.03516, che causerebbe una diminuzione

della capacità di 3.113 ·10−17F , ossia l'eetto che si avrebbe con il legame di 6.597 ·109

molecole, che corrispondono ad una concentrazione di 10.95pM .

La strumentazione elettronica attualmente disponibile può raggiungere un'accura-

tezza dell'ordine di 30ppm [6]. Per sfruttare pienamente le possibilità oerte da tali

tecnologie di misura sarebbe necessario stabilizzare la temperatura con una precisione

pari a 0.1°C 30ppm450ppm

= 6.6m°C

Per ottenere una lettura capacitiva più stabile è altresì indispensabile, limitare

l'evaporazione della soluzione minimizzando la supercie di contatto tra il liquido e

l'aria, rispetto a quanto avviene con dispositivi simili a quello rappresentato in Figura

1.10. Questo risultato può essere ottenuto contenendo la soluzione da analizzare in un

microcanale opportunamente ssato al substrato su cui sono presenti gli elettrodi.

In Figura 2.2 è riportato il diagramma di funzionamento della soluzione elaborata.

Il sensore realizzato, dotato di un canale microuidico, è contenuto in una scatola

metallica per limitare i disturbi elettrici ed è collegato al sistema microuidico tramite

un condotto di inlet ed uno di outlet. Un amplicatore Lock-In a due canali è utilizzato

per la misura delle capacità e per la misura locale della temperatura del microcanale.

Quest'ultima informazione è fornita in ingresso ad un controller termico, che controlla

la temperatura mediante un dispositivo termoelettrico.

23

Figura 2.1: Costante dielettrica dell'acqua al variare della temperatura. Immagine

tratta dall'Articolo [28].

24

Figura 2.2: Diagramma di funzionamento della soluzione proposta. La syringe pump

spinge il campione nel canale microuidico. Gli elettrodi depositati sul substrato ven-

gono utilizzati per estrarre l'informazione capacitiva e termica. Quest'ultima viene

utilizzata per stabilizzare la temperatura tramite un controller termico che agisce su

una cella di Peltier.

Figura 2.3: Schema della struttura approssimata del dispositivo. I diversi elementi

costitutivi sono rappresentati con colori diversi. Sul substrato (grigio) viene litografato

un attuatore termoelettrico (verde), al di sopra del quale viene litografato un sensore

termico (rosso) e dei sensori capacitivi (blu). La soluzione da analizzare è connata in

un canale microuidico (ciano).

25

Per le misure è stato utilizzato un amplicatore Lock-in per ridurre l'inuenza

del rumore elettrico degli amplicatori e le interferenze elettromagnetiche presenti

nell'ambiente ed ottenere così un elevato rapporto segnale-rumore.

Il sensore è costituito da un substrato in vetro su cui vengono litografati degli

elettrodi in oro: l'uso di questo metallo permette di impedire la formazione di ossidi

durante l'analisi e di limitare le reazioni che avvengono sulla supercie. Il canale

microuidico viene realizzato tramite PDMS molding ed è legato permanentemente al

substrato in corrispondenza degli elettrodi litografati.

Idealmente il dispositivo sarà composto da una sequenza di layer sovrapposti come

rappresentato in Figura 2.3. La scelta di realizzare un sensore su una struttura planare

è stata fatta nell'ottica di semplicarne la fabbricazione.

In base all'applicazione di interesse, la supercie degli elettrodi può essere funzio-

nalizzata per rendere il sensore selettivo all'analita ricercato. Per esempio è possibile

ssare sull'elettrodo delle sonde geniche contenenti una sequenza di nucleotidi com-

plementare a quella di interesse e sfruttare l'ibridazione per bloccare in prossimità

dell'elettrodo le sole molecole che si desidera rilevare.

Si è scelto di utilizzare dell'acqua bidistillata durante le prove sperimentali, in quan-

to, grazie alla sua semplicità ed il suo scarso contenuto ionico, riduce la possibilità di

insorgenza di eetti secondari che potrebbero complicare l'interpretazione dei risultati.

26

2.1.1 Stabilizzazione della temperatura

Per stabilizzare ecacemente la temperatura in prossimità del sensore capacitivo è in-

dispensabile misurarne le variazioni nelle sue immediate vicinanze. Nel caso in cui l'in-

formazione termica catturata fosse troppo lontana dal punto di interesse, si avrebbero

dei ritardi a causa dei tempi di diusione del calore nel liquido, quindi delle uttua-

zioni termiche ad ampiezze maggiori dovute ad una maggiore dicoltà di controllo, e

pertanto delle uttuazioni nel segnale capacitivo maggiori.

Una possibile soluzione, potrebbe essere la misurazione della temperatura a livel-

lo del canale microuidico, ponendo quindi la sonda quanto più vicino possibile al

substrato, come rappresentato in Figura 2.4a.

Questa soluzione, tuttavia, ore una scarsa ripetibilità, in quanto il posizionamento

del sensore dovrebbe avvenire manualmente e da esso dipende l'esito della stabilizzazio-

ne termica. Anche lievi variazioni di distanza dall'elemento termoelettrico potrebbero

causare grandi dierenze nel ritardo di detezione, e quindi di compensazione, delle

uttuazioni di temperatura.

Ponendo il sensore termico sul medesimo substrato utilizzato per eettuare la mi-

sura capacitiva, come in Figura 2.4c, è possibile ottenere un migliore risultato. Dal

momento che le proprietà elettriche dei metalli si modicano al variare della tempera-

tura, è possibile ricavare un'informazione termica monitorando il mutamento dei segnali

elettrici nel tempo. Questo risultato può essere ottenuto litografando sul substrato una

serpentina posizionata nelle immediate vicinanze del sensore capacitivo. Poiché la re-

sistività dell'acqua bidistillata è di gran lunga superiore a quella dei metalli, le sue

proprietà elettriche non dipendono dalla soluzione analizzata. Dal momento che l'oro

risponde con variazioni apprezzabili della resistività al variare della temperatura, è pos-

sibile utilizzare lo stesso metallo di cui si è usufruito per la produzione degli elettrodi

capacitivi. Questo permette di semplicare il processo di produzione e di minimizzare

la distanza del sensore termico dall'area da stabilizzare.

Ipotizzando di utilizzare un sensore di temperatura costituito da una serpentina in

oro con resistenza a 20 pari a R20 = 500Ω, una variazione di 0.1 causerebbe un

27

(a) NTC incastrato in un

incavo del PDMS. É neces-

sario forare il PDMS in un

punto vicino al canale ed

ore scarsa ripetibilità.

(b) NTC posizionato al di

fuori del canale. Non oc-

corre modicare il cana-

le, ma aumenta la distan-

za dal canale ed ore scarsa

ripetibilità.

(c) Sensore termico litogra-

fato sul substrato. Minimiz-

za il ritardo di detezione e

massimizzare la ripetibilità.

Figura 2.4: Possibili posizioni del sensore termico.

Figura 2.5: Schema di funzionamento di una cella di Peltier. Si tratta di un dispositivo

termoelettrico a stato solido, in grado di creare una dierenza di temperatura tra le

due lamelle con direzione ed intensità dipendenti dalla corrente applicata ai terminali.

La cella di Peltier è costituita da semiconduttori con drogaggio di tipo N e di tipo P

collegati in sequenza in modo alterno e possono essere utilizzate come pompa di calore

controllata elettronicamente.

28

aumento pari a 0.17Ω, secondo la relazione 2.1, con α = 0.0034°C−1 [37].

R(T ) = R20 [1 + α(T − 20)] (2.1)

Se il sensore venisse realizzato con semiconduttori invece che con l'oro, si otter-

rebbe una maggiore sensitività, ma le fasi della produzione verrebbero notevolmente

complicate, aumentando i tempi e i costi di produzione. Utilizzando le metodologie di

misura descritte nel Paragrafo 3.2 è possibile migliorare la sensitività no ad individuare

variazioni di circa 3m°C, come verrà illustrato nei prossimi paragra.

L'informazione sulla temperatura può essere ottenuta utilizzando un amplicatore

Lock-in per leggere un segnale resistivo dal sensore. La scelta di questo metodo di

lettura garantisce alta precisione e accuratezza, consentendo di ottenere una buona

sensitività su variazioni termiche piccole. I valori ottenuti possono essere utilizzati

per pilotare un controller termico in grado di compensare gli eetti di uttuazioni e

disturbi esterni agendo su una cella di Peltier, descritta in Figura 2.5, posizionata sotto

al substrato litografato.

Nonostante la vicinanza, la presenza del vetro introdurrà un ritardo nella propa-

gazione del calore. Pertanto, per gestire la situazione è indispensabile ricorrere ad un

controller dotato di una compensazione proporzionale ed integrale dell'errore. In que-

sta categoria di controllori (detti PI) il segnale di uscita dipende dall'errore e dalla sua

integrazione secondo la relazione 2.2, in cui u(t) rappresenta il segnale di correzione,

e(τ) è l'errore termico misurato, KP indica il coeciente con cui viene pesato l'errore

attuale e KI è il coeciente con cui viene pesato l'errore negli istanti passati.

u(t) = KP e(t) +KI

∫ t

0

e(τ)dτ (2.2)

Un elemento con queste caratteristiche è stato utilizzato nel progetto di dottorato

[35]. Esso costruisce un'interfaccia per il controller HTC 3000 di Wavelength Electro-

nics [43], il cui schema di funzionamento è riportato in Figura 2.6. Esso permette di

settare le costanti di correzione KP e KI collegando rispettivamente una resistenza e

una capacità appositamente dimensionate.

É possibile adattare questo elemento ai ni del presente progetto utilizzando come

segnale di riferimento il valore resistivo letto, in seguito ad opportune elaborazioni,

29

Figura 2.6: Schema di funzionamento del controller HTC3000. A sinistra sono presenti

le interfacce per i segnali di monitoring e l'ingresso del setpoint. In alto sono presenti i

piedini per la selezione delle costanti di correzione proporzionale ed integrale. A destra

sono presenti le interfacce di collegamento con il TEC e con il sensore termico.

30

invece del termistore per cui era stato inizialmente progettato. Questo espediente

permette di interfacciarsi in modo semplice al controller e di sfruttarne le potenzialità

in modo rapido e semplice.

L'uso di un controller PI richiede la sua calibrazione in base alle caratteristiche

del sistema da controllare, per evitare l'insorgenza di oscillazioni permanenti o di una

divergenza nel valore di correzione termica. I parametriKP eKI indicati nell'Equazione

2.2 devono essere scelti in base alla risposta del sistema ad uno stimolo termico e al

ritardo dell'applicazione degli eetti delle correzioni eettuate.

É possibile utilizzare il metodo di Ziegler e Nichols in anello chiuso [51]. Esso

permette di scegliere i due parametri valutando la risposta del sistema ad uno stimolo

prestabilito. Per applicarlo è necessario:

disattivare lo stadio integrale;

aumentare il guadagno proporzionale no ad indurre delle oscillazioni permanenti

nel sistema. Questo permette di individuare il limite di stabilità del sistema;

si misura il guadagno ed il periodo delle oscillazioni ottenute.

Secondo tale metodo è possibile calcolare i parametri del controller tramite le

relazioni 2.3.KP = 0.45KP

TI = T1.2

(2.3)

Il valore TI rappresenta la costante di tempo dello zero della funzione di trasferi-

mento termica ed è pari a TI = KP

KI. In questa relazione KP è il valore di KP a partire

dal quale il sistema risponde alla correzione con delle oscillazioni con caratteristiche

stazionarie, supponendo KI pari a zero, e T è il periodo di tali oscillazioni. Da esso

è possibile calcolare il valore di capacità di integrazione del controller sfruttando le

indicazioni del datasheet [43].

Secondo quanto illustrato nel datasheet del componente è possibile avere una sta-

bilizzazione con un errore di stabilità lineare minore ad 1m°C, pertanto è possibile

assumere che il controllore non costituisca un elemento limitante per quanto concerne

la stabilità termica.

31

2.1.2 Sensore capacitivo

Durante lo sviluppo del prototipo si è scelto di eettuare delle letture in acqua bidi-

stillata, in modo da utilizzare ridurre possibili eetti secondari dovuti ad un maggior

contenuto ionico. Questa scelta ha permesso di utilizzare frequenze di lettura minori

per ottenere una misura capacitiva della soluzione. La scarsa presenza di ioni liberi

rende questo mezzo poco conduttivo e permette l'espressione di un carattere capacitivo

a frequenze di stimolazione molto minori rispetto a soluzioni con alto contenuto ionico

come il PBS (Phosphate Buered Solution). Se in quest'ultimo si riscontra un com-

portamento capacitivo solo a partire da fC = 12πρε

= 350MHz, in acqua deionizzata è

possibile ottenere lo stesso risultato già a partire da circa fC = 1.3kHz.

Grazie a questo espediente è possibile utilizzare strumentazione di lettura più

semplice ed economica, inoltre ciò riduce le problematiche legata all'adattamento di

impedenza in fase di misura.

Il principio su cui si basa l'individuazione degli analiti è la variazione delle proprietà

elettriche delle molecole presenti nelle immediate vicinanze dell'elettrodo: nel caso

in cui una molecola fosse presente sulla supercie dell'elettrodo, essa prenderebbe il

posto delle molecole d'acqua che prima erano presenti. Nel caso in cui i due elementi

avessero una costante dielettrica relativa dierente si potrebbero misurare dei valori di

capacità diversi. Ad esempio, nel caso di detezione di molecole di DNA, si avrebbe una

notevole dierenza nella costante dielettrica relativa dell'acqua - pari a circa εr = 80 -

e dell'analita - pari a circa εr = 8 [11].

Se le molecole target venissero immobilizzate sull'elettrodo sarebbe possibile misu-

rare una dierenza capacitiva associabile alla loro presenza. L'entità della variazione

registrata dipende dalle dimensioni e dalle proprietà dielettriche dell'analita. Immagi-

nando di osservare un elemento dell'elettrodo con supercie pari alla sezione dell'ana-

lita, si potrebbe descrivere il suo contributo capacitivo come in Figura 2.7a; nel caso

in cui sia presente una molecola si otterrebbe, invece, la situazione descritta in Figura

2.7b, che causerebbe una diminuzione del contributo capacitivo.

L'insorgenza di una diminuzione del segnale capacitivo e l'entità della variazione,

secondo questo modello, fornirebbero delle informazioni quantitative sulla presenza

dell'analita sulla supercie dell'elettrodo.

32

(a) Modello dell'elettrodo senza analita.

Viene individuata la sola capacità relativa

alla soluzione.

(b) Modello dell'elettrodo con analita.

Al contributo capacitivo della soluzione

si aggiunge una componente relativa alle

molecole presenti sull'elettrodo.

Figura 2.7: Modello per la detezione elettronica dell'analita.

Per rendere possibile la detezione è necessario che le molecole a cui si è interessati

si accumulino sugli elettrodi. É possibile adottare un meccanismo selettivo di cattura

legando agli elettrodi alcuni biorecettori ani alla molecola ricercata e sfruttare il

legame creato tra i due elementi per far si che quest'ultima resti in prossimità del

metallo per il tempo necessario alla misura capacitiva.

Una delle limitazioni di questo metodo è costituita dai tempi di diusione delle mo-

lecole di DNA. Secondo la legge di Fick il tempo di diusione aumenta con il quadrato

delle dimensioni del volume di analisi, pertanto è necessario ridurlo per contenere le

tempistiche. L'uso di un canale microuidico permette di diminuire ecacemente il

volume di analisi e di minimizzare i tempi di diusione. Nel caso in cui si ricercasse la

presenza di analiti con basse concentrazioni, sarebbe opportuno trattare il campione

da analizzare in modo da aumentare la concentrazione dell'analita. Se la molecola di

interesse fosse carica, come per esempio gli acidi nucleici, sarebbe possibile velocizzare

il raggiungimento dell'area di analisi applicando agli elettrodi capacitivi un bias, in

modo da instaurare delle forze di attrazione elettrostatiche.

33

2.1.3 Sonde per il riconoscimento molecolare

Le scelta delle sonde biologiche da ssare sulla supercie dell'elettrodo è fondamen-

tale per ottenere la specicità desiderata. Esse dovranno legarsi selettivamente con

l'analita che si desidera individuare in modo da vincolarlo chimicamente in prossimità

dell'elettrodo.

La scelta della molecola deve essere fatta tenendo conto della compatibilità con

l'ambiente di detezione e con la chimica di adesione che verrà utilizzata per il legame

con l'elettrodo.

Nel caso specico il biorecettore desiderato dovrà:

legarsi alla molecola da individuare ed orire una buona specicità di legame;

essere facilmente vincolabile all'elettrodo;

essere compatibile con l'ambiente elettrochimico di detezione.

Questo elemento completa la struttura del biosensore rappresentata in Figura 2.8.

La funzionalizzazione dell'elettrodo può essere eettuata sfruttando la tecnica del

Self-Assembled Monolayer [27], che, come illustrato in Figura 2.9, permette di ottenere

dei layer di molecole uniformi sfruttando la chimica click: utilizzando dei biorecettori

precedentemente funzionalizzati con un tiolo o con un silano è possibile creare dei

legami molto forti rispettivamente con metalli nobili - come Oro, Argento o Platino -

o con ossidi non metallici, come l'ossido di silicio.

34

Figura 2.8: Struttura di un generico biosensore. In alto sono presenti i biorecettori che

formeranno un legame con l'analita ricercato. Essi sono legati al trasduttore tramite

un'interfaccia di immobilizzazione. A seconda dell'elemento che si desidera individuare

è necessario scegliere un biorecettore appropriato. Immagine tratta da http://www.

mdpi.com/1424-8220/11/5/4943/htm.

Figura 2.9: Fasi della creazione di un Self-Assembled Monolayer. I gruppi terminali

creano dei forti legami con la supercie da coprire. Le molecole si dispongono au-

tonomamente in modo da creare un layer uniforme sulla supercie. Il processo può

essere regolato variando la concentrazione delle molecole o il tempo di contatto con la

supercie.

35

2.2 Progettazione dei dispositivi

Lo studio del problema arontato nel Paragrafo 2.1 ha guidato la progettazione del

dispositivo di analisi: esso sarà costituito da un substrato planare su cui sarà posi-

zionato un sensore termico accanto dei sensori capacitivi, un attuatore termoelettrico

per il controllo elettronico della temperatura posizionato sotto di essi ed un canale

microuidico che contenga il campione da analizzare.

Le dimensioni nali del dispositivo sono standardizzate in modo da semplicare

l'installazione dello stesso nella scatola metallica menzionata nel Paragrafo 2.1. I pad

di contatto sono distanziati di 1.25mm per rendere più agevole il collegamento elettrico

agli strumenti di misura tramite vernice conduttiva in argento, inoltre si è scelto di

realizzare un'area sensibile ampia non meno di 2mm×2mm per facilitare l'installazione

manuale del canale microuidico al di sopra del substrato.

La progettazione è avvenuta tenendo conto della strumentazione disponibile nel

laboratorio PoliFAB, dei tempi di ottimizzazione richiesti dal processo di produzione e

dalla dicoltà operativa di realizzazione.

Considerato il carattere esplorativo del progetto e la sua connotazione di ricerca

metodologica, si è scelto di utilizzare delle fotomaschere in poliestere prodotte dall'a-

zienda inglese JD-Photodata, a causa del loro basso costo e dei rapidi tempi di evasione

dell'ordine. La fotomaschera richiesta ha dimensioni 250mm×300mm ed una risoluzio-

ne di 32000 DPI che, secondo il produttore, permette di ottenere delle feature minime

di 25µm. Solitamente questo tipo di maschera non è utilizzato per applicazioni che

richiedono una precisione alta e, pertanto, sono generalmente escluse dai processi di

litograa che coinvolgono degli elettrodi, in quanto presentano alcuni difetti:

il materiale di cui sono composte è meno trasmissivo sugli UV rispetto alle

maschere in quarzo;

sono particolarmente dicili da pulire in quanto il poliestere viene aggredito

dall'acetone e l'emulsione stampata su esso viene degradata dall'acqua;

devono essere ssate ad un supporto rigido in quarzo per il loro utilizzo nel mask

aligner ed è dicile mantenere una perfetta planarità della maschera;

36

presentano delle bolle micrometriche all'interno del poliestere, mostrate in Figura

3.10, che potrebbero essere riportate sul fotoresist durante la litograa.

Nonostante questi inconvenienti si è optato per questa soluzione, in quanto compor-

ta i vantaggi precedentemente illustrati: la scelta di utilizzare feature minime di 25µm

ed una serie di precauzioni in fase di fabbricazione possono appianare i difetti descritti

e rendere questa alternativa particolarmente interessante per le necessità preposte.

Dal momento che si prevede di realizzare due diversi layer controllabili elettrica-

mente, è necessario progettare una fotomaschera che permetta di implementare diversi

step fotolitograci, in particolare sarà necessario realizzarne:

uno contenente gli elettrodi per l'elemento di attuazione termoelettrico;

uno che permetta di depositare un layer isolante sagomato in modo da non

impedire l'accesso ai pad di contatto;

uno che contenga gli elettrodi relativi ai sensori.

Per eettuare i test si è scelto di realizzare il solo layer contenente i sensori, in modo

da semplicare la fase di fabbricazione nel laboratorio PoliFAB e limitare la possibilità

di errori dovuti alla produzione del sensore. Le maschere relative alle elaborazioni

successive sono state progettate e rese disponibili per la produzione di sensori durante

dei futuri sviluppi del progetto.

Questi elementi, disposti sulla supercie della maschera in modo da costituire dei

quadrati di lato 6 pollici riportati in Figura 2.10, sono stati disegnati utilizzando il

software CAD AutoCAD® 2017 prodotto da Autodesk e convertiti in formato Gerber

tramite lo script open source DXF2GBR 1.

Nei prossimi paragra verranno descritte le scelte progettuali eettuate per i singoli

elementi del sistema.

1Disponibile dal sito https://sourceforge.net/projects/dxf2gbr/les/2015-06-02/

37

Figura 2.10: Design della fotomaschera. In alto è riportata la fotomaschera utilizza-

ta per litografare gli attuatori termici, al centro la maschera per la deposizione del

layer isolante, in basso quella utilizzata per la litograa dei sensori, con accanto due

ingrandimenti della Geometria 1.

38

2.2.1 Progettazione dell'attuatore termoelettrico

Per controllare la temperatura del sistema è necessario utilizzare un attuatore termoe-

lettrico. Nei paragra precedenti è stato ipotizzato l'utilizzo di una cella di Peltier, ma

questa il suo utilizzo introduce un ritardo nell'attuazione dovuto alla capacità termica

del substrato che si interpone tra la cella e la zona che si desidera controllare.

Questo elemento è stato progettato ed inserito nella fotomaschera realizzata, ma

non è stato implementato nei prototipi realizzati in quanto la sua introduzione complica

notevolmente il processo di produzione. Nonostante ciò la cella di Peltier ha comunque

consentito di ottenere dei risultati accettabili per i ni preposti.

Le esigenze progettuali relative all'attuazione termica possono essere soddisfatte

da una serpentina in metallo: il passaggio di corrente attraverso un resistore elettrico

produce, per eetto Joule, una quantità di calore proporzionale alla potenza elettrica

fornita, secondo la Relazione 2.4. Per ottenere le prestazioni desiderate e dimensionare

l'elettronica di controllo è necessario stimare il valore di R.

Q ∝ IV∆t = I2R∆t (2.4)

R = ρl

S(2.5)

Ricordando la seconda Legge di Ohm riportata nella Relazione 2.5, in cui l rappre-

senta la lunghezza del conduttore ed S la sua sezione, è possibile controllare il valore

di resistenza regolando la lunghezza e la sezione della serpentina che implementerà

l'attuatore.

É possibile massimizzare tale valore scegliendo la minima larghezza consentita come

larghezza della serpentina ed un basso spessore per il layer metallico depositato. Il

resistore è stato realizzato scegliendo una larghezza di 25µm ed una lunghezza tale da

coprire l'intera area sensibile. In fase di deposizione del metallo è opportuno scegliere

uno spessore del layer di almeno 50nm in modo da ottenere una buona solidità alla

struttura.

In Figura 2.11 è riportato un esempio del design adottato. In questo caso il valore

di resistenza associabile all'attuatore da realizzare in oro è di:

39

R = 2.44 · 10−8Ωm 0.4699m50·10−9m×25·10−6m

= 9172.448Ω

con ρ = 2.44Ωm · 10−8 valore di resistività dell'oro a 20, secondo quanto riportato

nel Libro [37].

Queste scelte progettuali permettono di ottenere un valore di resistenza alto, e quin-

di di abbassare la corrente necessaria per riscaldare il liquido, riducendo la possibilità

di rottura a causa di elettromigrazione degli atomi di oro. Nel caso specico, se venis-

se applicata una corrente pari a 2.5mA, considerando una densità di corrente sicura

pari a 1mA/µm2 [23], si otterrebbe una potenza di P = I2R = 57.33mW in un'area

estremamente vicina al sensore da stabilizzare.

In caso di necessità tale valore può essere ridotto aumentando la larghezza della

pista, tuttavia si sconsiglia di aumentarne lo spessore in quanto si rischierebbe di creare

dei dislivelli eccessivi che introdurrebbero la necessità di un livellamento dello spessore,

aumentando la complessità della fabbricazione.

L'aggiunta di un attuatore metallico da litografare introduce la necessità di un

isolamento elettrico dai sensori. Benché la vicinanza dell'attuatore riduca il ritardo

nella trasmissione del calore ed aumenti l'ecacia del controllo, si è scelto di non

realizzare questo passaggio durante i test eettuati per semplicare la fabbricazione

del dispositivo. Ai ni dello svolgimento del presente progetto è stato utilizzato un

elemento termoelettrico CP08,31,06 [25], prodotto da Laird Technologies, posizionato

al di sotto del substrato in vetro.

40

Figura 2.11: Design dell'attuatore termico. Viene implementato come una serpentina

metallica larga 25µm e con piste distanziate 25µm. Le quote riportate sono espresse

in millimetri.

41

2.2.2 Progettazione dei sensori

In base a quanto aermato nel Paragrafo 2.1.1, è necessario progettare un sensore

di temperatura litografabile sul medesimo substrato che ospiterà gli elettrodi per la

misura capacitiva. Esso dovrà essere facilmente integrabile nel processo fotolitograco

e compatibile con la soluzione da analizzare, in modo da non alterarne le caratteristiche.

Una serpentina in oro risponde alle necessità preposte, inoltre la scelta di questo

metallo permette di avere una buona sensitività alla variazione di temperatura: esso,

infatti, ha una resistività di ρ0 = 2.44Ωm·10−8 a 20 ed un coeciente di temperatura

di α = 0.0034°C−1, da cui è possibile ricavare la resistività in funzione della temperatura

espressa in gradi Celsius, secondo quanto riportato nella relazione 2.6.

ρ(T ) = ρ0 [1 + α(T − 20)] (2.6)

Questo materiale assicura una variazione resistiva di 3400ppm per grado centigrado,

ossia 3.4ppm per ogni millesimo di grado. Se lo strumento utilizzato per la lettura del

segnale elettrico fosse in grado di individuare tale variazione, sarebbe possibile ottenere

un'elevata accuratezza in fase di stabilizzazione della temperatura.

La lettura del valore di resistenza può essere aetta da rumore a causa di eetti

parassiti dovuti alla sica del problema. Durante la progettazione si è tenuto conto

del rumore termico subito dal sensore, il cui spettro è calcolabile mediante la relazione

di Johnson SI = 4kTR

in cui k rappresenta la costante di Boltzmann, T la temperatura

espressa in gradi Kelvin ed R è il valore di resistenza. Applicando una stimolazione

in tensione sinusoidale ed ipotizzando di eettuare delle misure ad una temperatura

di 298.15K, è possibile osservare che aumentando il valore di resistenza si otterrà una

corrente minore, ed un rapporto SNR più svantaggioso, quindi è opportuno contenere

tale valore.

Di contro un valore troppo basso richiederebbe una diminuzione della tensione di

stimolazione per limitare la corrente che circola nella resistenza, in modo da evitare

l'insorgenza di fenomeni di autoriscaldamento e di elettromigrazione. In questo caso il

rapporto segnale-rumore verrebbe degradato a causa degli eetti termoelettrici generati

42

all'interfaccia tra materiali dierenti, sia a livello della connessione dei pad del sensore

che a livello delle saldature con i connettori BNC.

Per bilanciare queste necessità è opportuno ottenere un valore di resistenza com-

preso tra circa 500Ω e 1000Ω. In questo modo considerando una banda di 1Hz si

otterrebbe un rumore termoelettrico in corrente compreso rispettivamente tra 5.7pA e

4pA, vale a dire tra 3.49 · 107 e 2.46 · 107 volte più piccolo del valore base del segnale,

ed in entrambi i casi minore del rumore in ingresso dell'amplicatore a transimpedenza

pari a 17pA con impostazioni di amplicazione scelte. Se fosse possibile leggere con la

massima accuratezza e precisione, tale dierenza corrisponderebbe ad una variazione

di temperatura rispettivamente di 8ppm e 11ppm.

Gli eettivi valori di resistenza ottenibili sono soggetti ad una incertezza dovuta

al processo produttivo, infatti la fase di deposizione descritta nel Paragrafo 3.1.2 può

essere aetta da una certa variabilità nello spessore del metallo deposto. Si considerano

accettabili deposizioni di layer con spessore compreso tra 70nm e 120nm.

Per avere un ecace controllo topico della temperatura è necessario che gli elettrodi

per la misura capacitiva siano vicini al sensore termico. Esso, secondo le necessità

espresse nel Paragrafo 2.1.2, può essere implementato tramite delle armature coplanari

interdigitate realizzate in oro, così da semplicare l'integrazione del sistema nel processo

produttivo e da ottenere una struttura compatibile con la soluzione da analizzare.

A seconda della lunghezza e del numero delle dita, si ottiene un valore base di

capacità dierente, che risulta direttamente proporzionale ad entrambi i fattori. Nel

caso studiato la dierenza del segnale capacitivo causata dalla presenza di una singola

molecola di DNA è, in prima approssimazione, indipendente da essi. L'individuazione

di una variazione elettrica sarebbe più semplice se questa fosse di grandezza paragona-

bile al segnale base, per tanto sarebbe opportuno progettare le armature in modo da

ottenere valori di capacità molto bassi.

Ipotizzando, secondo quanto scritto nel Paragrafo 2.2, di utilizzare degli elettrodi

larghi 25µm e spaziati della stessa misura, è possibile agire su questo fattore contenendo

la lunghezza ed il numero delle dita, ma nonostante questi vantaggi si è scelto di

mantenere un'area sensibile larga almeno 2mm per facilitare l'allineamento manuale

del circuito microuidico.

43

Per ottenere delle buone performance in fase di detezione molecolare è opportuno

minimizzare la spaziatura tra le dita, pertanto si è scelto di utilizzare la minima distanza

concessa dalla fotomaschera utilizzata.

Il valore di capacità atteso è stato calcolato utilizzando il modello descritto nel-

l'articolo [19], in cui si considerano degli elettrodi interdigitati posti su un substrato

considerato innito coperti da un layer uniforme con spessore nito, al di sopra del

quale è presente un layer uniforme innito. Nel caso specico il substrato sarà costi-

tuito da vetro borosilicato, il primo layer da acqua bidistillata ed il secondo layer da

PDMS.

Il modello può essere espresso mediante le relazioni dell'Equazione 2.7, in cui:

W rappresenta la larghezza delle singole dita;

G rappresenta il gap presente tra di esse;

L rappresenta la loro lunghezza;

N è il numero complessivo di dita di entrambi gli elettrodi;

εS è la costante dielettrica relativa del substrato considerato spesso;

ε1 è la costante dielettrica relativa del layer al di sopra degli elettrodi;

t1 è lo spessore di tale layer;

ε2 è la costante dielettrica relativa del materiale presente al di sopra del primo

layer, assumendo che abbia spessore innito;

K (k) è l'integrale ellittico completo di prima specie con modulo ellittico k;

sn (z, k) è la funzione ellittica di Jacobi con modulo ellittico k del piano z;

v (0, q) è la funzione theta di Jacobi;

C = (N − 3)CI2

+ 2CICECI + CE

(2.7)

44

CI = ε0L

(ε2

K(kI∞)

K(√

1−k2I∞) + (ε1 − 1)

K(kI,1)K(√

1−k2I,1)+ εS

K(kI∞)

K(√

1−k2I∞))

CE = ε0L

(ε2

K(kE∞)

K(√

1−k2E∞) + (ε1 − 1)

K(kE,1)K(√

1−k2E,1)+ εS

K(kE∞)

K(√

1−k2E∞))

kI,1 = t2

√t24 − 1

t24 − t22t4 =

1

kt2 = sn

(z2, k

2)

z2 = K (k) η k =

(v2 (0, q)

v3 (0, q)

)2

q = exp (−4πr)

r =t1

2 (W +G)kI∞ = sin

(π2η)

η =W

W +G

kE,1 =1

t3

√t24 − t23t24 − 1

t3 = cosh

(π (1− η)

8r

)t4 = cosh

(π (1 + η)

8r

)kE∞ =

2√η

1 + η

Durante la lettura capacitiva, solo una porzione degli elettrodi sarà esposta alla

soluzione da analizzare, in quanto una parte di essi sarà coperta dal PDMS. La capacità

letta durante la misura può essere rappresentata con il modello in Figura 2.12.

Figura 2.12: Modello della capacità misurata. La misura è costituita da un contributo

dovuto al PDMS e ad un contributo dovuto al canale microuidico dipendente dalle

caratteristiche del liquido analizzato.

Nella caso del dispositivo descritto, un'alterazione termica produrrebbe delle varia-

zioni capacitive a causa della dierente costante dielettrica relativa dell'acqua pari a

circa 4500ppm/°C, in base all'articolo [28]. A questa componente deve essere aggiunto

il contributo di variazione introdotto dal PDMS, pari a circa 990ppm/°C secondo i dati

riportati da [29]. Poiché quest'ultima è di entità molto minore rispetto alla prima e dal

momento che stabilizzando la temperatura entrambi i contributi verrebbero ridotti, è

possibile trascurarla durante la presente trattazione.

45

Le scelte progettuali nora discusse pongono un limite alle sperimentazioni che pos-

sono essere eettuate tramite il sistema che verrà realizzato: la scarsa risoluzione della

maschera limita la dimensione minima delle feature e rende dicoltosa la detezione

delle molecole. Applicando il modello descritto nel Paragrafo 2.1.2 in Figura 2.7, è

possibile calcolare il contributo fornito da una singola molecola presente sul sensore.

La variazione introdotta da una molecola di DNA, e quindi il limite di detezione

ottenibile, dipende fortemente dalla distanza tra gli elettrodi interdigitati. Tramite

il modello espresso in Figura 2.7a, un elemento dell'elettrodo con dimensioni pari ad

S = 1.25nm× 1.25nm si avrebbe una capacità calcolabile come CH2O = ε0εH2OSd, con

d = πr ed r pari alla distanza tra il centro del gap tra gli elettrodi e la posizione della

molecola legata.

Nel caso in cui sull'elettrodo fosse presente una molecola di DNA si considererebbe il

modello rappresentato in Figura 2.7b, in cui il contributo capacitivo dell'acqua verrebbe

calcolato come C ′H2O = ε0εH2OS

d−hDNA, con hDNA pari all'altezza della molecola di

DNA. Il contributo oerto dalla molecola sarebbe pari a CDNA = ε0εDNAS

hDNA. Questo

cambiamento può essere calcolato mediante la relazione 2.8, da cui appare evidente

che, a parità di temperatura e di molecola, con dimensioni minori delle geometrie si

otterrebbero variazioni più grandi del valore capacitivo.

∆C = CH2O −(

1

C ′H2O

+1

CDNA

)−1

= ε0εH2OS

1

πr− 1

πr + hDNA

(εH2O

εDNA− 1)(2.8)

A titolo esemplicativo si consideri un elemento della capacità grande 1.25nm ×

1.25nm posto a metà tra la distanza massima e la distanza minima rispetto all'elettrodo

successivo e si calcoli il suo contributo capacitivo approssimato con la relazione Csens =

80ε01.25·10−9·1.25·10−9

π18.75·10−6 = 1.87892 · 10−23F , se si considera il contributo di un semicerchio

di raggio r = 18.75µm. Nel caso in cui una molecola di DNA si legasse al sensore,

essa avrebbe un contributo pari a CDNA = 8ε01.25·10−9·1.25·10−9

16.5·10−9 = 6.7077zF , mentre

il contributo dovuto all'acqua diverrebbe CH2O = 80ε01.25·10−9·1.25·10−9

π18.75·10−6−16.5·10−9 = 1.87944 ·

10−23F , che si tradurrebbe in una capacità equivalente pari a C =(

1CH2O

+ 1CDNA

)−1

=

1.87419 · 10−23F . La presenza di una singola molecola ha causato una diminuzione del

46

valore capacitivo di 4.725·10−26F , ciò signica che per avere una variazione capacitiva di

10fF occorrerebbero circa 10−144.725·10−26 = 2.1 · 1011 molecole. Immaginando di analizzare

un volume di 100µL, corrisponderebbe ad una concentrazione di 2.1·1011

6.022·1023·100·10−6 =

3.5nM .

Se venisse utilizzata una fotomaschera con una risoluzione maggiore si potrebbe-

ro realizzare elettrodi dalle dimensioni più appropriata per una detezione molecolare.

Supponendo che essi avessero larghezza pari a 1µm e distanza pari a 1µm, si avrebbe

una variazione capacitiva di 10fF in presenza di una concentrazione pari a 5.96pM .

Per capire quanto questi fattori possano incidere sulle prestazioni nali del sistema,

sono state realizzate diverse variazioni della geometria del sensore, alcune delle quali

sono dotate di un doppio canale e di un doppio sistema di elettrodi capacitivi. Di

seguito verranno riportati diversi design progettati.

Geometria 1 É stata realizzata una versione a canale singolo del sensore con due

strutture di elettrodi interdigitati in grado di orire un valido supporto ad analisi

esplorative per quanto concerne la stabilizzazione della temperatura e le possibilità di

detezione oerte dal sistema.

Questa geometria, rappresentata in Figura 2.13, presenta un doppio sistema di

capacità separate da una serpentina utilizzata per la lettura termica. Si è scelto di

realizzare dei terzetti di armature interdigitate in cui al centro è presente un'armatura

di stimolazione comune e sui lati due armature per la misura, in modo da avere un

supporto sensoristico in grado di orire eventualmente delle letture dierenziali su breve

distanza, per poter ispezionare il comportamento del sistema durante delle analisi con

un usso continuo di liquido.

É possibile stimare il valore di resistenza della serpentina sfruttando la seconda

Legge di Ohm riportata nell'Equazione 2.5 del Paragrafo 2.2.1. In questo caso la

resistenza utilizzata per la misura della temperatura avrebbe un valore pari a:

R = 2.44 · 10−8Ωm 0.0425m25·10−6m×100·10−9m

= 414.8Ω

Questo valore è aetto da un'incertezza dovuta alla variabilità dello spessore della

lamina in oro depositata.

47

Figura 2.13: Design del dispositivo secondo la Geometria 1. Alle estremità del sensore

di temperatura (rosso) sono presenti due terzine di armature interdigitate uguali (blu).

Le piste hanno una dimensione di 25µm e sono distanziate della stessa misura. Le

quote riportate sono espresse in millimetri.

48

Utilizzando le relazioni riportate nelle Equazioni 2.7 descritte in precedenza e pre-

supponendo che venga utilizzato il circuito microuidico presentato nel Paragrafo 2.2.3,

è possibile stimare il valore della capacità che si otterrebbe in presenza di acqua bidi-

stillata, secondo il modello descritto in Figura 2.12. In base alla geometria adottata si

otterrebbe un valore pari a 1.0581pF , che con un aumento della temperatura di 0.1

diverrebbe 1.0579pF .

Se fosse possibile adottare un riferimento capacitivo che non partecipasse al pro-

cesso di individuazione delle molecole, ma fosse aetto dagli stessi fenomeni sici che

aiggono l'elemento sensibile, sarebbe possibile eliminare l'eetto di inuenze esterne

sfruttando una misura dierenziale dei due segnali ottenuti. Per far questo è fonda-

mentale far si che i due sensori siano simili tra loro e che subiscano gli stessi eetti

esterni. Nel sensore proposto in Figura 2.13, sono presenti due sistemi di armature

posti alle estremità del sensore di temperatura. La loro vicinanza e la loro identità

di geometria permetterebbe di far si che, applicando la stessa stimolazione sinusoida-

le, la loro dierenza escluda fenomeni che altererebbero entrambi i valori, come, per

esempio, delle uttuazioni termiche. Nel caso in cui vi fossero delle diormità tra le

due geometrie si otterrebbero dei residui nel segnale dierenziale dovuti alla dierente

velocità di variazione nel valore capacitivo a seguito di uno stesso stimolo.

Per applicare questa metodologia di lettura è indispensabile far si che le reazio-

ni con l'analita avvengano sulla sola capacità di detezione, pertanto è indispensabile

funzionalizzare solo uno dei sistemi di armature che sarà a contatto con la soluzione.

Nella geometria descritta sarebbe possibile eettuare questa operazione riempiendo il

canale con la soluzione di funzionalizzazione ed utilizzando delle tecniche per rimuo-

vere selettivamente o degradare i biorecettori dove questi non fossero necessari. Nel

caso della Geometria 1 questo risultato potrebbe essere ottenuto esponendo il sensore

funzionalizzato in tutta la sua supercie alla luce UV utilizzando una fotomaschera

che protegga le aree in cui i biorecettore debbano essere preservati. Questa operazione

degraderà le molecole biologiche nelle aree esposte e consentirà di ottenere il risultato

desiderato, ma introdurrà notevoli dicoltà operative:

É necessario utilizzare una fotomaschera degradare selettivamente solo alcune

aree;

49

Occorre curare l'allineamento con il sensore con estrema attenzione, per evitare

di danneggiare le biomolecole utili alla detezione;

Occorre tenere conto degli eetti di rifrazione e diusione che il microcanale in

PDMS potrebbe introdurre.

Queste limitazioni rendono dicile l'applicabilità di questo metodo con la geometria

proposta. Per semplicare tale operazione è stato introdotto un nuovo design, di seguito

descritto, in cui sono presenti due canali microuidici vicini (in modo da ottenere eetti

termici simili), ma separati. In questo modo è possibile funzionalizzare un solo canale

sfruttando la separazione meccanica oerta dal PDMS o, in alternativa, funzionalizzare

entrambi i canali ed iniettare la soluzione da analizzare in uno solo dei due.

Geometria 2 La seconda geometria prevista prevede l'uso di due canali microuidici

simmetrici e vicini tra loro. Questa congurazione permette di eettuare una lettura

dierenziale tra i due: immaginando di immettere la soluzione da analizzare in un

canale ed il buer utilizzato nell'altro si potrebbe leggere la sola dierenza tra i due

per eliminare il valore base e rendere possibile una maggiore accuratezza di misura.

In questo caso la resistenza per la detezione termica abbraccia i sensori capacitivi,

come mostrato in Figura 2.14. La maggiore supercie controllata dalla resistenza rap-

presenta un ostacolo alla puntualità della misura, in quanto viene mediato il contributo

di un'area maggiore. Questo calo di prestazioni può essere compensato dalla possibilità

di una lettura dierenziale.

Durante l'eettiva realizzazione del dispositivo è importante che i due sistemi capa-

citivi siano perfettamente simmetrici, in modo da fornire un segnale dierenziale basso

e da rispondere con le stesse variazioni ai medesimi disturbi termici.

Come fatto in precedenza, è possibile stimare il valore di resistenza della serpentina

tramite la seconda Legge di Ohm:

R = 2.44 · 10−8Ωm 0.119645m25·10−6m×100·10−9m

= 1167.74Ω

Secondo le modalità descritte in precedenza la capacità attesa è pari a 2.6639pF ,

ed un aumento della temperatura di 0.1 porterebbe tale valore a 2.6633pF .

50

Figura 2.14: Design del dispositivo secondo la Geometria 2. Ad ogni canale microui-

dico è associata una coppia di armature interdigitate (blu). Il sensore termico (rosso)

abbraccia le due capacità. Le piste hanno una dimensione di 25µm e sono distanziate

della stessa misura. Le quote riportate sono espresse in millimetri.

51

Nonostante la maggiore facilità di implementazione della lettura dierenziale oerta

rispetto alla Geometria 1, questo design ha un'area sensibile notevolmente maggiore,

pertanto il valore di resistenza del sensore di temperatura è più alto e l'area che inuen-

za il suo valore di resistività è maggiore. Questo delocalizza maggiormente la misura

rispetto al caso precedente e rende più dicoltosa la stabilizzazione termica, ma, in

compenso, il valore capacitivo potrà essere comunque stabilizzato utilizzando la lettura

dierenziale.

Geometria 3 Quest'ultima geometria illustrata in Figura 2.15 rappresenta una lieve

variazione della precedente: in questo caso è stato ridotto il numero di dita per abbas-

sare il valore di ogni sensore capacitivo con l'obiettivo di aumentare la sensitività di

detezione.

In questo caso il valore di resistenza della serpentina è pari a 1077.26Ω, mentre il va-

lore atteso da ogni singola capacità è 656.67fF , che con un aumento della temperatura

di 0.1 diverrebbe 656.53fF .

52

Figura 2.15: Design del dispositivo secondo la Geometria 3. La struttura è simile a

quella presentata in Figura 2.14, ma in questo caso il numero di dita degli elettrodi

interdigitati è ridotto. Le quote riportate sono espresse in millimetri. Il sensore termico

è rappresentato in rosso, mentre i sensori capacitivi sono rappresentati in blu.

53

2.2.3 Progettazione della microuidica

Sono stati realizzati due circuiti microuidici, uno a canale singolo ed uno a canale

doppio, da legare ai substrati litografati. Per ridurre le dicoltà pratiche di montaggio

durante il Plasma Bonding, si è scelto di aumentare la dimensione degli inlet e degli

outlet: questa accortezza facilita la loro individuazione e la centratura del canale sul

sensore.

Il canale è stato dimensionato in modo da minimizzare la pressione al suo interno,

dal momento che se questa fosse eccessivamente alta potrebbe causare il distacco del

circuito microuidico o una fuoriuscita di acqua dall'intercapedine presente tra la su-

percie di PDMS e gli elettrodi in oro, come illustrato in Figura 2.16. Quest'ultimo

eetto osservato sperimentalmente si verica quando la pressione supera i 31kPa: in

questa situazione le forze dovute alla pressione nel canale superano quelle di tensione

superciale all'interfaccia aria-acqua, causando una fuoriuscita di acqua visibile grazie

ad un repentino aumento del segnale capacitivo dovuto al cambio di dielettrico da aria

ad acqua.

Figura 2.16: Rappresentazione schematica dell'interfaccia oro-PDMS-substrato. L'al-

tezza dell'oro crea un dislivello nel PDMS e causa la comparsa di un'intercapedine

triangolare alta circa 100nm

In base alle esigenze illustrate, si è scelto di realizzare dei canali microuidici alti

30µm e larghi 300µm per 1cm in corrispondenza del centro del sensore e con larghezza

di 1mm altrove. I punti di collegamento con l'esterno hanno un diametro di 2mm.

Dal momento che agli estremi del canale la struttura ha un aspect ratio maggiore di

10:1 sono state inserite delle strutture cilindriche di raggio pari a 35µm distanziate di

54

(a) Foto del circuito microuidico a doppio

canale.(b) Foto del circuito microuidico a

canale singolo.

Figura 2.17: Circuiti microuidici realizzati.

300µm per evitare fenomeni di incurvamento. Il canale così realizzato e rappresentato

in Figura 2.17a ha una resistenza microuidica pari a circa 2.034× 1013 Pa·sm3 .

Nel caso del circuito a doppio canale gli inlet e gli outlet sullo stesso lato sono stati

distanziati di 1cm e sono stati aggiunte due strutture circolari tra di essi per semplicare

le operazioni di allineamento durante il montaggio. Il risultato nale, rappresentato

in Figura 2.17b, è caratterizzato da una resistenza pari a 1.953 × 1013 Pa·sm3 per ogni

microcanale.

55

Capitolo 3

Implementazione

In questo capitolo verrà descritta la metodologia adottata per realizzare il sensore

utilizzando le risorse del laboratorio di ateneo PoliFAB, con particolare enfasi sulle

accortezze necessarie durante le diverse fasi della produzione.

In seguito verrà illustrata la metodologia di misura elettrica scelta per estrarre

l'informazione di interesse.

3.1 Realizzazione dei dispositivi

I sensori progettati sono stati realizzati presso il PoliFAB, la cleanroom presente nel

Politecnico, sfruttando opportunamente diverse tecniche di microfabbricazione.

Per realizzarlo occorre eettuare una fotolitograa per trasferire su uno strato di

fotoresist depositato sul substrato il pattern presente sulla maschera progettata; quindi

sarà successivamente necessaria una deposizione di oro per creare un layer uniforme di

metallo sull'intera area del substrato. A questo punto si potrà rimuovere il fotoresist

per eliminare l'oro presente in zone esterne al pattern per poi legare il canale microui-

dico, precedentemente realizzato tramite PDMS molding, sulla supercie del substrato

tramite plasma bonding.

Il substrato su cui è stato realizzato l'elettrodo è vetro soda-lime dalle dimensioni

di 75× 25mm, spesso 1.06mm, prodotto da Corning ed acquistato da Sigma-Aldrich1.

Grazie alle dimensioni standardizzate e alla semplice reperibilità, questi vetrini sono

1Codice prodotto CLS294775X25

56

stati preferiti ai wafer in borosilicato presenti in cleanroom, la cui dimensione imponeva

uno step aggiuntivo di taglio. Un'altra ragione che ha condotto a questa decisione è sta-

ta la minore stabilità del legame tra substrato e canale microuidico sperimentalmente

riscontrata dopo il plasma bonding.

Gli elettrodi sono stati realizzati depositando un layer di cromo spesso 6nm ed un

layer di oro spesso 100nm. Il primo permette di migliorare notevolmente l'adesione del

secondo al substrato.

I materiali scelti sono compatibili con le molecole biologiche e non danno origine a

reazioni indesiderate. L'uso dell'oro, inoltre, permette di creare in modo semplice un

Self-Assembled Monolayer [27] tramite il legame tiolo-oro ed avere una buona sensitività

alla variazione di temperatura, quindi è possibile utilizzarlo anche per realizzare il

sensore termico.

In Figura 3.1 è possibile osservare l'immagine di un sensore realizzato per eettuare

dei test.

Figura 3.1: Foto del sensore realizzato prima del collegamento alla strumentazione

elettrica.

In Figura 3.2 è illustrata una sintesi del processo di fabbricazione completo, mentre

nell'Appendice A è riportata una guida alla micro-fabbricazione in cui sono descritte

diverse tecniche ed accortezze adottate durante la produzione dei sensori.

57

(a) Spin coating del substrato.

(b) Esposizione e sviluppo.

(c) Deposizione del metallo.

(d) Lift-o.

(e) Litograa del master mold.

(f) PDMS Molding.

(g) Peeling del PDMS.

(h) Taglio e foratura del circuito.

(i) Plasma Bonding del PDMS sul substrato litografato.

Figura 3.2: Sintesi del processo di microfabbricazione del sensore.

58

3.1.1 Fotolitograa

La fotolitograa è una tecnica di micro-produzione che permette di riportare pattern

micrometrici e sub-micrometrici realizzati su una fotomaschera su un substrato appo-

sitamente preparato. Essa avviene esponendo una resina fotosensibile, detta fotoresist,

precedentemente depositata sul campione, con dei raggi ultravioletti attraverso una

maschera opacizzata in corrispondenza delle geometrie da riportare.

Il layer così ottenuto può essere utilizzato per depositare del metallo sul substrato

seguendo delle geometrie precise, oppure può essere utile per eettuare un etching

superciale solo in determinate aree.

A seconda del tipo di resist utilizzato, le aree esposte a radiazioni luminose con

una lunghezza d'onda predeterminata diverranno solubili (resist positivo) o insolubili

(resist negativo) durante la fase di sviluppo, come descritto dalla Figura 3.3. La scelta

di questa componente dipende anche dallo spessore che il layer dovrà avere sul substra-

to, infatti fotoresist più viscosi permetteranno di avere spessori maggiori. Altri fattori

intervenienti sono l'aspect ratio specico, che dipende fortemente dalla diusione la-

terale della radiazione luminosa e dal contrasto di comportamento tra aree esposte e

aree non esposte che caratterizza il resist.

Figura 3.3: Polarità dei fotoresist. In seguito all'esposizione ai raggi UV i resist positivi

diventano solubili al developer, mentre i resist negativi diventano insolubili. Immagine

tratta da: https://en.wikipedia.org/wiki/Photopolymer

A seconda della polarità del resist si possono ottenere proli con una pendenza

59

dierente. Generalmente se alla litograa dovrà seguire una deposizione di metallo è

preferibile utilizzare un resist negativo. Infatti, come è possibile osservare dalla Figura

3.4, la diusione laterale delle reazioni di esposizione permette di ottenere un prolo

leggermente inclinato verso le aree scoperte del substrato (detto prolo undercut).

Durante la deposizione del metallo verrà creato un layer sottile e continuo che, come è

indicato in Figura 3.5, può essere facilmente superato durante il lift-o. L'utilizzo di un

resist positivo porterebbe alla creazione di un layer metallico continuo che renderebbe

le fasi successive più dicoltose e con un maggiore rischio di fallimento.

Figura 3.4: Angolo delle pareti del fotoresist con dierenti polarità. La diusione

laterale delle reazioni di esposizione ottenuta in seguito all'esposizione determina la

pendenza delle pareti del resist. Immagine tratta da: https://de.wikipedia.org/

wiki/Fotolack

Per gli scopi preposti si è scelto di usare il resist AZ 5214E [16] prodotto da Micro-

Chemicals. Si tratta di un resist positivo la cui polarità può essere invertita durante il

processo di esposizione tramite un Reversal Bake, come illustrato in Figura 3.6.

Prima di cominciare un processo fotolitograco è importante pulire accuratamente

il substrato che verrà utilizzato, in modo da migliorare l'adesione del resist che verrà

applicato. Ogni substrato è stato abbondantemente pulito con acetone ed isopropa-

nolo: il primo permette di rimuovere i residui organici presenti sul vetro, il secondo

di risciacquare il pezzo ed eliminare del tutto le impurità. A causa della rapidità con

60

Figura 3.5: Eetti della polarità del fotoresist sulla fase di lift-o in seguito al-

la deposizione di metallo. Nel caso di fotoresist positivo l'interruzione del layer

metallico in corrispondenza delle feature è agevolata. Immagine tratta da: http:

//www.mdpi.com/1424-8220/15/6/12218/htm

Figura 3.6: Processo di inversione della polarità del fotoresist. Dopo l'esposizione

eettuata con una maschera progettata per resist negativo, viene eettuato un Reversal

Bake seguito da una esposizione senza l'utilizzo di una maschera. Immagine tratta da:

www.microchemicals.com

61

cui l'acetone evapora a temperatura e pressione ambientale, è necessario utilizzare l'i-

sopropanolo per terminare il risciacquo: in sua assenza le impurità separate dal vetro

tornerebbero a depositarvisi con l'evaporazione. Dopo la pulitura è consigliabile dei-

dratare il substrato ponendolo su un Hotplate per alcuni minuti ad una temperatura

di circa 120.

Secondo i suggerimenti del produttore, l'applicazione del resist può essere opzio-

nalmente preceduta dall'utilizzo del TI Prime [41] prodotto da MicroChemicals. Spe-

rimentalmente è stato appurato che questo passaggio è indispensabile per una buona

adesione del resist su vetro soda-lime ed è necessario per evitare il suo distacco durante

le successive fasi del processo.

Il primer può essere applicato sul substrato pulito utilizzando uno spin coater, una

macchina che permette di distribuire uniformemente un layer di soluzione sfruttando

la forza centrifuga del campione da trattare, ottenuta da una rotazione a parametri

controllati. In questo caso è stata utilizzata una velocità di rotazione di 4000 rpm per

60 secondi con accelerazione di 400 rpm al secondo.

A questo passaggio segue un baking su hotplate a 120 per 2 minuti, che consente

di far evaporare il solvente contenuto nel TI Prime.

Ora può essere applicato il resist seguendo lo stesso procedimento, impostando i

parametri dello spin coater in modo da ottenere lo spessore desiderato, secondo i dati

di calibrazione forniti dal produttore e riportati in Figura 3.7.

Figura 3.7: Tabella di calibrazione dello spin coat del resist AZ 5214E. Lo spessore del

resist è espresso in funzione della velocità di spin. Immagine tratta dal datasheet del

prodotto [16]

Nell'applicazione specica lo spessore del resist non assume un'importanza critica

ai ni della buona riuscita della fabbricazione, pertanto è stato scelto uno spessore

intermedio di 1.4µm. Secondo le indicazioni del produttore è possibile ottenere questo

risultato con un processo a 4000 rpm per 60 secondi con accelerazione di 400 rpm al

62

secondo. Il procedimento termina con un bake su hotplate a 110 per 90 secondi

per permettere l'evaporazione del solvente e raorzare la solidità del resist e il legame

dello stesso al substrato. Un bake insuciente porterebbe ad un'eccessiva produzione

di gas in fase di esposizione che provocherebbe la comparsa di bolle e distacchi, come

illustrato in Figura 3.8.

Figura 3.8: Foto di difetti ottenibili durante il processo di fotolitograa. A sinistra è

presente una bolla comparsa a causa di un Prebake insucientemente lungo. A destra

è possibile osservare dei distacchi a stella dovuti a dello sporco presente sul vetrino

prima dello spin coating.

Per procedere all'esposizione occorre preparare la fotomaschera per la litograa. In

questo caso è necessario ssare la maschera in poliestere ad un substrato in quarzo

rigido, come mostrato in Figura 3.9. Solitamente è bene eettuare una pulitura della

supercie della maschera con acetone ed isopropanolo, ma in questo caso il poliestere è

aggredito dall'acetone e l'emulsione di cui sono costituite le strutture perde compattezza

in presenza d'acqua, pertanto si è scelto di risciacquare con isopropanolo in qualità

VLSI ed asciugare con azoto.

In seguito alla preparazione del substrato è possibile procedere all'esposizione del

campione così ottenuto ai raggi ultravioletti tramite il Mask Aligner. Questa macchina

permette di allineare in modo estremamente accurato la maschera ed il substrato e

di controllare diversi parametri dell'esposizione come il tempo di apertura dello shut-

ter o la distanza tra maschera e substrato. Un contatto eccessivo potrebbe causare

il logoramento della maschera in poliestere, inoltre le tracce di resist che potrebbero

depositarvisi sarebbero dicili da eliminare a causa dell'impossibilità di usare solventi

63

Figura 3.9: Foto della maschera in poliestere ssata al supporto in quarzo.

acquosi per pulirla; di contro, una distanza eccessiva enfatizzerebbe l'eetto della dif-

frazione ottica ed abbasserebbe la risoluzione delle strutture ottenute. E' stato scelto

dunque di utilizzare la modalità Soft Contact prevista nel Mask Aligner Karl Suss

MA6/BA8. Il tempo di esposizione è stato calibrato partendo dai suggerimenti del

produttore ed eseguendo una procedura di ottimizzazione sulla base delle necessità.

Un tempo insuciente, infatti, non permetterebbe una corretta denizione del pat-

tern, mentre un tempo eccessivo causerebbe un irrigidimento del resist ed una perdita

di denizione delle geometrie.

La maschera in poliestere utilizzata presenta delle bolle al suo interno (visibili in

Figura 3.10) che, come osservato sperimentalmente, vengono riportate durante la lito-

graa. Il diametro medio delle bolle è di alcuni micrometri e la loro presenza fra gli

elettrodi durante la metallizzazione può portare alla formazione di cortocircuiti tra di-

verse componenti. Per limitare questo fenomeno è stato sfruttato la diusione laterale

delle reazioni di esposizione: i tempi di esposizione sono stati aumentati per permette-

re la diusione laterale delle reazioni di esposizione. Questo ha permesso di eliminare

la maggior parte delle bolle e di ridurre notevolmente le dimensioni delle rimanenti,

64

come è possibile osservare in Figura 3.11. Infatti, nonostante l'energia di esposizione

suggerita dal produttore fosse di 20 mJcm2 in i-line, è stata utilizzata una energia di 52 mJ

cm2 ,

che in base alla potenza erogata dalla lampada e dall'ottica della macchina di 4.52mWcm2 ,

corrisponde ad un tempo di esposizione di 11.5s.

Figura 3.10: Foto delle bolle presenti all'interno della maschera in poliestere.

Figura 3.11: Foto dei substrati litografati prima (sinistra) e dopo (destra)

l'ottimizzazione del processo.

Seguendo le indicazioni di MicroChemicals al termine dell'esposizione è stato eet-

tuato un Reversal Bake su hotplate a 110 per 90 secondi per permettere l'inversione

65

della polarità del resist. A questo passaggio segue un esposizione del substrato senza

l'utilizzo della maschera per un tempo di circa 50s per fornire al fotoresist un'energia

maggiore di 200 mJcm2 .

Una volta esposto il substrato, è necessario svilupparlo in modo da dissolvere le

parti del resist che non si sono solidicate durante l'esposizione, tramite l'immersione

del campione in AZ 726 MIF [17], prodotto da MicroChemicals, per 35 secondi. Anche

in questo caso il tempo è stato ottimizzato con una sequenza di esperimenti per evitare

una dissolvimento parziale delle aree da rimuovere (sottosviluppo) o un logoramento

dei bordi delle feature (sovrasviluppo). L'azione chimica del developer viene interrotta

risciacquando abbondantemente il substrato. Il risultato ottenuto no a questo punto

è rappresentato in Figura 3.12.

Figura 3.12: Foto del substrato al termine della fotolitograa.

Il substrato litografato può essere valutato con un'osservazione diretta tramite

microscopio. In Figura 3.13 sono presenti alcune immagini catturate in questa fase.

É altresì importante valutare lo spessore del layer di resist eettivamente ottenu-

to tramite un prolometro: valori eccessivamente diversi da quanto atteso potrebbero

indicare dei problemi di adesione. Nella cleanroom del PoliFAB è presente un prolo-

metro KLA Tencor P-15 Proler che utilizza uno stilo di diamante a contatto con la

supercie da analizzare, muovendosi lateralmente sul campione e registrando le forze

di contatto. In Figura 3.14 è possibile osservare un graco ottenuto dalla prolometria

di un substrato litografato.

Una volta ottenuta una litograa soddisfacente è possibile passare alle fasi successive

della lavorazione.

66

Figura 3.13: Immagini di alcuni substrati al termine del processo di fotolitograa

ottenute tramite microscopio.

Figura 3.14: Prolometria del layer di resist al termine della fotolitograa. Dati

misurati con il prolometro KLA Tencor P-15 Proler applicando una forza di 2mg.

67

3.1.2 Deposizione dell'oro

Durante questa fase della produzione si desidera depositare sul substrato litografato

un layer sottile ed uniforme di oro con cui si otterranno gli elettrodi del sensore. Prima

di depositare l'oro è necessario creare un layer di adesione in cromo: senza di esso

l'oro non riuscirebbe a legarsi direttamente al vetro e la metallizzazione del substrato

fallirebbe.

Questa operazione può essere svolta in diversi modi: lo sputtering e l'evaporazio-

ne termica sono entrambi compatibili con il substrato ed il resist utilizzati. Il primo

permette di ottenere uno strato metallico più compatto rispetto al secondo, ma tende

ad irrigidire il resist a causa della presenza del plasma, della formazione di fotoni UV

durante il processo e delle temperature sviluppate localmente, complicando la fase di

lift-o. Si è scelto, tuttavia di utilizzare comunque la tecnica dello sputtering, in quan-

to assicura una compattezza maggiore del metallo, aspetto ritenuto particolarmente

importante alla luce della necessità di ulteriori lavorazioni.

Durante l'attività svolta in laboratorio è stato realizzato un layer di adesione in

cromo spesso 6nm ed un layer in oro spesso 100nm utilizzando la macchina Magnetron

Sputtering System LEYBOLD LH Z400. Il processo richiede la creazione del vuoto

nella camera di reazione (con una pressione di circa 10−8bar) e l'immissione controllata

di Argon. Un generatore ad alta frequenza ionizza il gas formando del plasma ed

accelera gli ioni verso il metallo da depositare, detto target. L'urto provoca il distacco

di alcuni atomi dal target e la loro dispersione nella camera di reazione. Ciò permette

la deposizione del metallo sul substrato in un layer uniforme. L'intero processo è

sintetizzato in Figura 3.15.

É possibile variare lo spessore del substrato modicando alcuni parametri del pro-

cesso, come la potenza applicata dal generatore, la quantità di gas presente nella camera

o il tempo di deposizione: aumentando il primo valore è possibile aumentare la velo-

cità di deposizione, tuttavia, a causa degli eetti secondari presenti durante gli urti,

questa variazione non è lineare; aumentando la quantità di gas è possibile aumentare

la quantità degli urti sul substrato, tuttavia una maggiore presenza di atomi potrebbe

portare ad urti inecaci e quindi ridurre l'ecienza complessiva; aumentando il tempo

è possibile aumentare lo spessore del layer deposto.

68

Figura 3.15: Sintesi del processo di sputtering. Gli ioni di Argon vengono accelerati

verso il target no ad urtarlo. Alcuni atomi si distaccano dalla supercie e si diondono

nella camera di reazione. Alcuni di essi aderiscono al substrato, creando su di esso

un sottile layer metallico. Immagine tratta da https://it.wikipedia.org/wiki/

Polverizzazione_catodica.

Figura 3.16: Foto del substrato al termine del processo di sputtering.

69

La pressione del gas Argon utilizzato e la potenza del generatore sono stati de-

terminati sperimentalmente in base alle calibrazioni precedentemente eettuate sulla

macchina. Nel processo realizzato per il layer di adesione è stato scelto un usso di

gas Argon di 66sccm, una potenza di 25W ed un tempo di applicazione di 2 minuti,

mentre per il layer in oro è stato scelto un usso di gas Argon di 50sccm, una potenza

erogata di 50W (con una potenza riessa di 26W ) ed un tempo di applicazione di 6

minuti e 15 secondi.

Una volta estratti i campioni dalla macchina, essi saranno completamente ricoperti

da uno strato metallico, come mostrato in Figura 3.16.

A questo punto è possibile procedere al lift-o del resist.

70

3.1.3 Lift-o

In questa fase della lavorazione si elimina il layer di fotoresist utilizzato tempora-

neamente per denire il pattern geometrico degli elettrodi: il metallo non legato

direttamente al vetro viene rimosso assieme al resist.

Alla ne del processo si ottiene il risultato riportato in Figura 3.17 che pone ne al

processo di fabbricazione dei sensori sintetizzato in Figura 3.18.

Figura 3.17: Foto del substrato al termine del processo di lift-o.

L'operazione viene eettuata immergendo il substrato in un solvente per AZ 5214E

per un tempo dipendente dalla compattezza del resist e del layer metallico depositato.

Essa può essere agevolata mediante una lieve azione meccanica ottenuta grazie a degli

ultrasuoni.

Per una buona riuscita è importante adottare, in questa fase, un solido metodo

di risciacquo del campione: uno dei principali problemi che potrebbero vericarsi è la

ridepositazione di lamine precedentemente separate dal vetro, che potrebbero causare

dei contatti elettrici indesiderati tra diverse componenti del sensore.

Nel caso di layer metallici spessi o di proli di resist di tipo overcut - ottenuti

utilizzando un fotoresist positivo o eettuando un reow prima della deposizione -

è possibile incorrere nel distacco di parti dell'elettrodo aderenti al vetro, oppure nel

distacco parziale del metallo che, come visto in precedenza, può creare dei cortocircuiti.

Le conseguenze di questi problemi sono rappresentate in Figura 3.19 e sono superabili

scegliendo opportunamente i tempi e le modalità da applicare.

Durante lo sviluppo del sensore il processo è stato ostacolato dalla compattarsi

del resist a causa dell'uso dello sputtering. In base alle esigenze speciche è stata

71

Figura 3.18: Sintesi del processo di deposizione di elettrodi metallici. I. Pulitura del

substrato (1); II. Creazione di un layer di fotoresist (2); III. Fotolitograa; IV. Depo-

sizione del metallo (3); V. Lift-o; VI. Presenza del pattern metallizzato. Immagine

tratta da https://en.wikipedia.org/wiki/Lift-off_(microtechnology).

72

ottimizzata una procedura di lift-o descritta nel Paragrafo A.3.

Si è scelto di immergere il campione in un bagno di acetone per 30 minuti, di

favorire il processo con pochi secondi di ultrasuoni a bassa potenza e di concludere con

un bagno in AZ 100 Remover [15], fornito da MicroChemicals, per 15 minuti.

L'acetone è particolarmente aggressivo sul resist e permette di rimuoverlo facilmente

nonostante l'irrigidimento, ma tende ad essere maggiormente soggetto alla rideposita-

zione del materiale eliminato. Per impedire che ciò accada bisogna assicurarsi che il

campione non sia mai asciutto durante il processo.

L'immersione in AZ 100 Remover permette di eliminare questi ultimi residui e di

migliorare la pulizia del campione.

I risultati ottenuti a questo punto possono essere valutati tramite microscopio (al-

cune immagini sono riportate in Figura 3.20) e prolometro (è possibile osservarne un

esempio in Figura 3.21).

Figura 3.19: Immagini ottenute al microscopio di alcuni substrati in seguito a dei

processi di lift-o non riusciti.

73

Figura 3.20: Immagini ottenute al microscopio di substrati in seguito al processo di

lift-o.

Figura 3.21: Prolometria del layer metallico al termine del lift-o. Dati misurati con

il prolometro KLA Tencor P-15 Proler applicando una forza di 2mg.

74

3.1.4 Realizzazione della microuidica

Per aggiungere al sensore realizzato un canale microuidico è possibile sfruttare la

tecnica del PDMS Molding : consiste nel versare del polimero liquido su uno stampo

precedentemente litografato, lasciarlo solidicare e separarlo dal mold per ottenerne

un calco.

I microcanali in PDMS possono essere legati al vetro tramite Plasma Bonding : le

superci vengono attivate dal plasma e poste in contatto per creare un legame stabile.

Al termine del procedimento si ottiene il dispositivo mostrato in Figura 3.1, pronto

da integrare nel setup di misura elettrica.

Litograa del Master Mold

Per eettuare la litograa del Master Mold si è adottato un procedimento simile a

quanto descritto nel Paragrafo 3.1.1. Tuttavia, nel caso specico, la scelta del substrato

e del resist è guidata da esigenze dierenti da quelle precedentemente esposte: il resist

AZ 5214E non permetterebbe di ottenere uno spessore suciente dello stampo (ciò

limiterebbe l'altezza dei canali microuidici). Poiché è prioritario avere un alto spessore

del layer di resist, è stato litografato dell'SU8-2035 prodotto da MicroChem [31] su un

wafer di silicio da 6 pollici.

Secondo le indicazioni del produttore riportate in Figura 3.22, è stata scelta una

velocità di spin di 3000 rpm per ottenere un'altezza dei canali di circa 30µm. In questo

caso non è stato necessario utilizzare alcun primer, dal momento che l'adesione del

resist al silicio è già sucientemente stabile.

Il solvente presente nel resist è stato fatto evaporare tramite un trattamento ter-

mico eettuato secondo le indicazioni del datasheet riportate in Figura 3.23a: è stato

utilizzato circa un minuto a 65 e circa 5 minuti e 20 secondi a 95.

Prima dell'esposizione è stata ssata la maschera in poliestere sul supporto di quarzo

come descritto precedentemente. L'esposizione è stata tarata secondo le indicazioni di

MicroChemicals riportate in Figura 3.23b: dal momento che occorre fornire al resist

153 mJcm2 ed è noto che la potenza ottica erogata dalla lampada è pari a 4.5mW

cm2 , è stato

utilizzato un tempo di esposizione di 34s in modalità Soft Contact.

75

Figura 3.22: Curve di spin SU8-2000. Immagine tratta dal datasheet del prodotto [31].

A questo punto è stato eettuato un Post Exposure Bake per 1 minuto alla tempe-

ratura di 65 e 5 minuti e 20 secondi a 95, secondo le indicazioni del produttore in

Figura 3.23c.

Lo sviluppo è stato eettuato immergendo il wafer in SU8 Developer, fornito da

MicroChemicals per 4 minuti e 20 secondi, secondo le istruzioni del datasheet presenti

in Figura 3.23d, ed è stato interrotto sciacquando il wafer con isopropanolo.

Per aumentare la rigidità delle feature e per assicurarsi che le temperature utilizzate

durante il PDMS Molding non le danneggino è stato eettuato un Hard Bake al termine

della fotolitograa ad una temperatura di 150 per 5 minuti.

Il risultato nale è rappresentato in Figura 3.24.

PDMS Molding

La tecnica del PDMS Molding permette di creare dei canali microuidici in PDMS

partendo da uno stampo rigido ottenuto dalla fase precedente. Durante l'operazione

del PDMS liquido viene versato sullo stampo, lasciato solidicare e staccato da esso

per ottenerne un calco.

Dopo aver pulito accuratamente lo stampo con acetone ed isopropanolo, viene co-

struito un contenitore il cui fondo sarà costituito dallo stampo ottenuto modellando

76

(a) Soft-Bake SU8-2000.(b) Energia di esposizione SU8-2000.

(c) Post-Bake SU8-2000.(d) Tempi di sviluppo SU8-2000.

Figura 3.23: Immagini tratte dal datasheet del prodotto [31].

Figura 3.24: Litograa del Master Mold microuidico. Risultato della litograa di un

wafer in silicio da 6 pollici secondo le modalità descritte.

77

dei fogli di alluminio.

A questo punto occorre preparare il PDMS mescolando la base polimerica e l'agente

di curing in proporzione 10:1 e versarlo nello stampo precedentemente preparato. Per

la realizzazione è stato utilizzato il Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit [10].

Le bolle d'aria inglobate nel composto durante il mescolamento devono essere eli-

minate ponendo la struttura ottenuta in una macchina per il vuoto: in questo modo

l'aria presente nel materiale sarà attratta in supercie no all'eliminazione di tutte le

bolle (solitamente occorrono almeno 30 minuti).

L'attivazione dell'agente di curing e la conseguente reticolazione del polimero av-

vengono tramite un trattamento termico ad 85 per 60 minuti, al termine del quale il

PDMS sarà solidicato.

Ora è possibile eliminare i fogli di alluminio e separare delicatamente i microcanali

dal substrato, avendo cura di non danneggiare il Master Mold durante l'operazione con

trazioni eccessive.

Le diverse strutture di canali presenti nel calco devono essere separate utilizzando

un taglierino e forati in corrispondenza degli inlet e degli outlet, usando un ago di

dimensioni leggermente minori dei tubi che verranno utilizzati per il collegamento mi-

crouidico. Queste ultime fasi della lavorazione devono essere eseguite con particolare

attenzione, in quanto le posizioni dei tagli e dei fori potrebbero essere dicili da indi-

viduare a causa della trasparenza dei canali e della loro scarsa visibilità sul polimero

trasparente.

In Figura 2.17 è presente un esempio del risultato ottenuto al termine delle opera-

zioni descritte.

Plasma Bonding

L'ultima fase della lavorazione consiste nel legare permanentemente il substrato, su

cui sono presenti gli elettrodi, ai microcanali che guideranno il percorso del uido da

analizzare e permette di terminare la creazione del sensore.

Grazie alla tecnica del Plasma Bonding è possibile legare due superci idroliche

senza la necessità di utilizzare dei layer intermedi o alte temperature, non utilizzabili a

78

causa della grande dierenza nei coecienti di espansione termica del vetro e dell'oro

che provocherebbe il distacco del metallo dal substrato.

Questa tecnica viene generalmente realizzata utilizzando un Plasma Cleaner, che

permette di rimuovere dei residui organici da una supercie, utilizzando un plasma di

Ossigeno o Argon a bassa pressione. Modulando il tempo di esposizione, la potenza

del generatore a radiofrequenza e la quantità di gas immesso nella camera è possibile

determinare il risultato nale.

Durante l'esposizione al plasma di ossigeno le superci trattate vengono modicate

dall'azione di ioni reattivi: in seguito alla loro azione aumenta la quantità dei gruppi

silanolo esposti (Si-OH) e quindi l'idrolicità del materiale. Quando le due superci

trattate vengono poste a contatto si formano dei legami Si-O-Si molto stabili, come

illustrato in Figura 3.25.

Figura 3.25: Processo di Plasma Bonding. Le superci da legare vengono attivate dal

plasma di ossigeno. Quando verranno poste a contatto si creeranno nuovi legami stabili

tra di esse. Immagine tratta da https://plasmatreatment.co.uk/.

L'esposizione del PDMS agli ioni reattivi del plasma tende a danneggiarne la su-

percie: se l'energia fornita fosse eccessiva la rugosità della supercie aumenterebbe e

si avrebbe un numero minore di legami ecaci tra i due materiali. Ai ni della buona

riuscita del procedimento, è indispensabile che le superci da trattare vengano accu-

ratamente pulite tramite acetone ed isopropanolo ed asciugate con azoto: l'eventuale

presenza di contaminanti ridurrebbe notevolmente l'ecienza delle reazioni.

I tempi di esposizione, la potenza da utilizzare e la quantità di ossigeno da im-

mettere nella camera sono stati vagliati sperimentalmente e grazie ad un processo di

79

ottimizzazione si è scelto di eettuare un trattamento di 40 secondi a 50W con una

pressione di ossigeno di 1mbar.

Non appena terminata l'esposizione al plasma, le superci restano attive solo per

alcuni minuti, durante i quali devono essere messe a contatto per formare i legami.

É necessario procedere al posizionamento con rapidità e precisione, infatti un errore

seguìto da un successivo tentativo di collocamento causerebbe il fallimento del bonding.

Il legame può essere agevolato premendo leggermente e con estrema cautela sul PDMS

utilizzando una pinzetta, tenendo a mente che una pressione eccessiva causerebbe la

deformazione del canale e potrebbe portare all'ostruzione dei condotti microuidici.

Per agevolare la formazione dei nuovi legami è necessario riscaldare i substrati

appena legati su un hotplate a circa 65 per almeno 2 ore.

Sperimentalmente si è osservato che al termine del lift-o alcune tracce puntiformi

di resist dal diametro di alcuni micrometri possono rimanere ancorate al vetro: la

scarsa pulizia del substrato degrada notevolmente la qualità del legame, pertanto è

opportuno rimuovere tali impurità immergendo per alcuni minuti il substrato in acetone

o esponendololo a plasma di ossigeno per almeno 10 minuti a 200W .

80

3.2 Lettura ed elaborazione dei dati

L'alta accuratezza richiesta durante la lettura dei segnali impone l'uso di speciche

precauzioni volte a proteggere i componenti da disturbi elettrici esterni. In questo

caso il sistema è stato schermato per mezzo di una scatola in alluminio di dimensioni

120 × 80 × 59mm fornita da RS2. Il dispositivo prodotto durante le fasi precedenti è

stato ssato alla scatola grazie a due morse realizzate con rispettivamente due bulloni

in nylon a cui sono state ssate due barre in alluminio forate in corrispondenza dei

bulloni. Questo semplice espediente permette di immobilizzare il pezzo alla scatola in

modo ecace e di ottenere una misura più adabile, in quanto tale sistema elimina

possibili contributi capacitivi variabili che potrebbero derivare da un movimento del

pezzo e quindi da un cambiamento della distanza dei conduttori di connessione.

Il substrato contenente i sensori è poggiato su una cella di Peltier CP08,31,06,

prodotto da Laird Technologies [25]. É sta applicata della pasta termoconduttiva RS

Heat Sink Compound3 sia sul lato superiore, in contatto con il vetro del sensore, sia

sul fondo, in contatto con la scatola metallica, per facilitare lo scambio di calore. Sono

state utilizzate delle guide in nylon per ssare il sensore in modo da ostacolare lo

scambio di calore tra il vetro e la scatola.

Il collegamento alla strumentazione è stato realizzato tramite dei connettori BNC

non isolati che sono stati ssati alla scatola, in modo che questa abbia lo stesso potenzia-

le di massa dello strumento di misura. La connessione elettrica con il dispositivo è stata

realizzata collegando dei cavi ai pad di contatto utilizzando della vernice conduttiva di

argento4.

Su un lato della scatola sono stati praticati altri tre fori per permettere il colle-

gamento elettrico della cella di Peltier e di un termistore NTC B57861 prodotto da

EPCOS [1] utilizzato per monitorare la temperatura nelle prime fasi della sperimenta-

zione. Inne su entrambi i lati corti della scatola sono stati realizzati due incavi per

permettere la comunicazione con il circuito microuidico.

La lettura dell'impedenza dei sensori è stata eettuata utilizzando un'Amplicatore

2Contenitore schermato in alluminio Hammond serie 1590 IP54, codice RS 343-96253Grasso termico RS Pro, Ossido di metallo, 0.65 W

m·K , codice RS 554-3114Adesivo conduttivo argento, codice RS: 186-3593

81

Lock-In, applicando una tensione sinusoidale e misurando la corrente ottenuta dopo

averla convertita in tensione con un amplicatore a transimpedenza.

Il funzionamento dello strumento, sintetizzato in Figura 3.26, viene descritto di

seguito:

Viene generato un segnale sinusoidale ad una frequenza prestabilita e lo si utilizza

per stimolare l'oggetto di cui si desidera misurare l'impedenza;

La corrente risultante viene letta tramite un amplicatore a transimpedenza,

ltrata con un ltro passa banda centrato sulla frequenza di stimolazione ed

amplicata da un amplicatore AC;

La sinusoide generata verrà moltiplicata con il segnale in ingresso tramite un cir-

cuito moltiplicatore chiamato Phase Sensitive Detector. Il risultato conterrà una

componente in banda base e delle armoniche a frequenze multiple di riferimento;

Il segnale ottenuto viene quindi ltrato con un ltro passa basso. Il risultato di

questa operazione è la parte reale dell'ammettenza complessa misurata espressa

in VRMS;

La componente immaginaria può essere ricavata moltiplicando il segnale ottenuto

dall'amplicatore AC per la medesima onda sinusoidale di riferimento sfasata di

90 gradi e ltrando quanto ne risulta come visto in precedenza;

Dalla componente reale e da quella immaginaria è possibile ricavare il modulo e

la fase dell'impedenza in esame.

Durante le registrazioni eettuate è stato utilizzato un Amplicatore Lock-In HF2LI

prodotto da Zurich Instrument, il cui schema a blocchi è riportato in Figura 3.27.

Questo strumento è dotato di due generatori controllabili singolarmente e di due canali

in ingresso indipendenti con lettura dierenziale e banda no a 50MHz. I segnali in

ingresso vengono amplicati con dei PGA, ltrati e digitalizzati con ADC a 14bit ad una

frequenza di 210MSa/s. Ciascun canale ha una coppia di demodulatori per estrarre la

componente in fase ed in quadratura rispetto al segnale di riferimento, eventualmente

sfasato di un valore desiderato.

82

Figura 3.26: Principio di funzionamento dell'amplicatore Lock-In. Un'onda sinusoi-

dale a frequenza predeterminata stimola il sistema da analizzare. La tensione ottenuta

dall'elemento da ispezionare viene amplicata, ltrata e moltiplicata con l'onda di ri-

ferimento e la stessa onda sfasata di 90°. Le componenti dell'impedenza complessa

vengono ottenute ltrando il risultato delle moltiplicazioni con un ltro passa basso.

I segnali di stimolazione sono generati per mezzo di oscillatori con frequenza ed

ampiezza programmabile a cui è possibile aggiungere una tensione analogica esterna.

Il sistema è dotato anche di due ingressi ausiliari con una banda di 100kHz letti tramite

ADC a 16bit ad una frequenza di 400kSa/s e quattro uscite ausiliarie che è possibile

programmare in modo da fornire delle elaborazioni lineari dei risultati ottenuti dai

demodulatori. Le principali speciche dello strumento sono riportate in Figura 3.28.

Durante il progetto è stato utilizzato un amplicatore a transimpedenza HF2TA,

il cui schema a blocchi è illustrato in Figura 3.29. Esso è utilizzato per convertire la

corrente proveniente dai sensori capacitivi in una tensione elaborabile dall'amplicatore

Lock-In. L'HF2TA è dotato di due canali a guadagno programmabile, dei ltri AC

attivabili opzionalmente ed ore la possibilità di compensare dei bias in ingresso.

Lo strumento è connesso ad un computer tramite USB 2.0 e viene controllato grazie

al software ziControl 16.12 fornito dal produttore. Esso permette di congurare la

macchina, di visualizzare i dati ottenuti e di registrarli.

Poiché si intende eettuare una lettura dierenziale sul sensore capacitivo, è ne-

83

Figura 3.27: Diagramma a blocchi dell'amplicatore Lock-In Zurich Instrument HF2LI.

Tratto dal datasheet del prodotto [2].

Figura 3.28: Speciche tecniche dell'amplicatore Lock-In Zurich Instrument HF2LI.

Tratto dal datasheet del prodotto [2].

84

Figura 3.29: Diagramma a blocchi dell'amplicatore a transimpedenza Zurich

Instrument HF2TA. Tratto dal datasheet del prodotto [2].

cessario adoperare un terzo canale di amplicazione a transimpedenza per leggere il

segnale resistivo. Si è scelto di utilizzare l'amplicatore DHPCA-100 prodotto da FEM-

TO, un amplicatore a transimpedenza programmabile in cui è possibile selezionare il

guadagno ed aggiungere opzionalmente una correzione dell'oset, un ltraggio AC ed

un ltro passa basso in uscita. Il suo schema di funzionamento è illustrato nel dia-

gramma a blocchi in Figura 3.30, mentre le prestazioni che consente di ottenere sono

riportate in Figura 3.31.

3.2.1 Elaborazione del segnale capacitivo

La lettura del segnale capacitivo avviene stimolando un'armatura con un'onda sinusoi-

dale avente solitamente una frequenza pari a 10MHz ed una tensione di picco pari a

100mV . La seconda armatura della capacità viene collegata all'amplicatore a tran-

simpedenza HF2TA, in cui è stato impostato un guadagno di 1000V/A ed una post

amplicazione pari a 10. Si è scelto di utilizzare questa frequenza di stimolazione in

quanto è la più alta applicabile prima dell'instaurarsi di fenomeni di distorsione dovuti

a limitazioni in banda delle componenti utilizzate. L'ampiezza è stata scelta in modo

da evitare reazioni di elettrolisi indesiderate durante la lettura capacitiva.

85

Figura 3.30: Diagramma a blocchi dell'amplicatore a transimpedenza FEMTO

DHPCA-100. Tratto dal datasheet del prodotto [14].

Figura 3.31: Speciche tecniche dell'amplicatore a transimpedenza FEMTO DHPCA-

100. Tratto dal datasheet del prodotto [14].

86

In alcuni test sono state eettuate delle letture della dierenza tra due sensori

capacitivi sfruttando gli ingressi dierenziali dell'amplicatore: in tal caso il segnale

di stimolazione viene applicato ad un'armatura di entrambe le capacità e la corrente

delle due capacità è convertita in tensione dai due amplicatori a transimpedenza

presenti nell'HF2TA. Tutti i cavi utilizzati hanno uguale lunghezza per non introdurre

sfasamenti dovuti ad un dierente ritardo di propagazione.

La lettura dierenziale non solo permette di ridurre le variazioni che aiggono

entrambi i canali, ma, riducendo il valore base del segnale, aumenta la risoluzione

dell'amplicatore Lock-in, dal momento che lo strumento permette di individuare nel

caso migliore variazioni maggiori di circa 30ppm sul valore letto [6].

L'amplicatore è stato impostato in modo da introdurre un ltraggio AC sul segnale

in ingresso, per ridurre ulteriormente i rumori nella banda di segnale non signicativa.

É stata scelta un'impedenza di ingresso pari a 50Ω in base a quanto suggerito dal

Datasheet dell'amplicatore HF2TA. La demodulazione avviene sulla prima armonica

del segnale ed il ltraggio viene eettuato da un ltro digitale del quarto ordine con una

frequenza di taglio pari a 973mHz. La catena di elaborazione del segnale è sintetizzata

in Figura 3.32.

Durante la scelta dell'ampiezza del segnale di stimolazione è stata valutata la possi-

bilità che si instaurino delle reazioni chimiche di ossidoriduzione. Si è scelto di utilizzare

un'ampiezza di stimolazione pari a 100mV in quanto con tale valore non sono state

osservate reazioni REDOX e al contempo la risoluzione della misura ottenuta non è

limitata dal rumore strumentale.

Secondo i modelli riportati nei Paragra 2.1.2 e 2.2.2, la lettura dovrebbe fornire

delle informazioni sulla capacità della soluzione. In base a quanto aermato nel Para-

grafo 2.1, le sue variazioni potrebbero essere associate a fenomeni di evaporazione o a

uttuazione termica, e sono destinati a diminuire nel caso in cui delle molecole siano

immobilizzate in prossimità dell'elettrodo.

Ricordando che in un condensatore I = C dV (t)dt

e che nel caso specico V (t) =

VP sin(2πft), si otterrà un picco di corrente pari a IP = 2πfCVp. La tensione ottenuta

dopo la demodulazione è pari a Vdemod = 2πfCVp10000√

2in quanto l'amplicatore a

transimpedenza ha un guadagno pari a 10000Ω ed il demodulatore fornisce una tensione

87

Figura 3.32: Catena di elaborazione del segnale capacitivo. L'amplicatore Lock-In

fornisce un'onda sinusoidale ad una frequenza di 10MHz, ad un'armatura di entrambe

le capacità interdigitate. Il segnale ottenuto viene elaborato da un amplicatore a tran-

simpedenza con guadagno pari a 1000Ω ed amplicato ulteriormente di un fattore 10.

La dierenza dei due segnali viene amplicata, ltrata e demodulata. Le due compo-

nenti dell'impedenza complessa sono ottenute ltrando il risultato della demodulazione

con un ltro passa basso con frequenza di taglio pari a 1Hz.

espressa in VRMS. Applicando un fattore di scala a Vdemod è possibile ottenere il valore

di capacità associato al sensore.

3.2.2 Elaborazione del segnale di temperatura

La resistenza del sensore di temperatura è ricavata stimolando l'elettrodo con un'onda

sinusoidale avente una frequenza di 11kHz ed una tensione di picco pari a 100mV .

Il segnale in corrente che ne risulta viene letto con l'amplicatore a transimpedenza

DHPCA-100, su cui è stato impostato un guadagno di 1000Ω.

Come illustrato nel Paragrafo 2.1, occorrerà mantenere un valore di resistenza co-

stante per stabilizzare la temperatura, ciò signica che occorre mantenere costante il

valore della corrente letta, in base a quanto aermato dalla Prima legge di Ohm I = VR.

Come spiegato nel Paragrafo 2.2.2, un aumento della temperatura causerà un aumento

del valore di resistenza, e quindi una diminuzione della corrente letta.

Solitamente lo spettro di potenza del rumore osservabile mediante elettronica a

88

stato solido ha l'andamento di un icker noise5 no ad una frequenza di transizione

oltre la quale il rumore bianco diventa predominante, come rappresentato in Figura

3.33.

Figura 3.33: Spettro di potenza del rumore elettronico. A basse frequenze predomina

l'eetto del icker noise. Oltre ad una frequenza caratteristica il rumore bianco assume

maggiore rilevanza. Immagine tratta da [21].

L'amplicatore Lock-In stimola il sistema con un'onda sinusoidale generata ad alta

frequenza e trae l'informazione ricercata da segnali a frequenze maggiori di quelle in

cui si concentra la maggior parte della potenza del rumore. Durante la lettura solo i

segnali in ingresso con la stessa frequenza del segnale di riferimento vengono preservati,

quindi, idealmente, l'unica componente di rumore che altera la misura è quella presente

alla stessa frequenza della stimolazione [36].

In questo caso l'utilizzo di un amplicatore lock-in permette di eettuare la mi-

sura resistiva ad una frequenza in cui il rumore ha una potenza minore, in modo da

massimizzare l'SNR ed ottenere una maggiore accuratezza.

Per massimizzare la sensibilità della misura di temperatura superando il limite di

risoluzione dell'amplicatore Lock-In di 30ppm (che corrispondono ad una tempera-

tura di circa 20m, nel caso della Geometria 1) si è deciso di elaborare unicamente

la dierenza di resistenza rispetto al valore a temperatura ambiente. Questo è stato

ottenuto collegando all'ingresso dierenziale negativo dell'amplicatore Lock-In il me-

desimo segnale di stimolazione inviato alla resistenza, attenuato mediante un partitore5Rumore con andamento proporzionale a 1

f , spesso dovuto a uttuazioni lente delle proprietà di

componenti a stato solido.

89

di tensione implementato con un trimmer. Calibrandolo per avere un segnale inferiore

alle centinaia di microVolt è possibile raggiungere una risoluzione di circa 1.5ppm nella

misura della resistenza, corrispondenti a variazioni termiche di 1m.

In questo caso l'amplicatore HF2LI è stato impostato in modo da introdurre anche

un ltraggio AC sul segnale in ingresso. Poiché si intende misurare variazioni molto

piccole, è stato scelto un'impedenza di ingresso pari a 1MΩ, in modo che le uttuazioni

delle resistenze di contatto non alterino la misura. La demodulazione avviene sulla

prima armonica del segnale di riferimento ed il ltraggio viene eseguito da un ltro

digitale con una frequenza di taglio pari a 1Hz, ottimizzata empiricamente a partire

dai risultati di calibrazione ottenuti mediante il metodo di Ziegler e Nichols. La catena

di elaborazione del segnale è sintetizzata in Figura 3.34.

Figura 3.34: Catena di elaborazione del segnale resistivo. L'amplicatore Lock-In

fornisce un'onda sinusoidale ad una frequenza di 11kHz. Il segnale di corrente viene

elaborato da un amplicatore a transimpedenza con guadagno pari a 1000Ω, sottratto

ad un riferimento ottenuto dallo stesso segnale di stimolazione, quindi amplicato,

ltrato e demodulato. Le due componenti dell'impedenza complessa sono ottenute

ltrando il risultato della demodulazione con un ltro passa basso con frequenza di

taglio pari a 1Hz.

Durante la scelta dell'ampiezza del segnale di stimolazione si è tenuto conto della

possibilità di introdurre un autoriscaldamento del sensore. Nel caso specico la potenza

dissipata è pari a P = V 2

2R= 0.1V 2

2·414.8Ω= 12µW . Per vericare che tale valore non

90

causi un autoriscaldamento è stato confrontato mediante una termocoppia6 il valore di

temperatura ottenuto prima dell'accensione dell'amplicatore e durante la misura, al

ne di individuare eventuali drift termici.

Il segnale ottenuto in seguito alla demodulazione è stato inviato al controller PI per

stabilizzare la temperatura del sistema, secondo quanto indicato nel Paragrafo 2.1.1.

Per i test è stato utilizzato un Controller TEC precedentemente realizzato durante un

progetto all'interno dello stesso laboratorio [35]. Si è scelto di utilizzare una metodo-

logia di connessione che non implicasse alcuna modica sul dispositivo, in modo da

poterlo utilizzare per altre applicazioni senza la necessità di alterarne di volta in volta

il funzionamento.

Per eettuare il collegamento è stato utilizzato un semplice circuito di adattamen-

to: durante il suo regolare funzionamento, il controller riceve in ingresso un segnale

compreso tra circa 1.5V e 2.5V . Si è scelto di utilizzare due uscite ausiliare dell'am-

plicatore HF2LI per fornire un segnale con le caratteristiche sopra descritte ottenuto

come la somma di due contributi:

una tensione Vbias ssa pari a 1.947V , ossia alla tensione associata alla tempera-

tura impostata sul controller;

una elaborazione lineare dell'uscita del demodulatore corrispondente al segnale

resistivo descritta dall'Equazione 3.1. Il valore Scala è stato scelto in base ai

requisiti di stabilità riportati nel Paragrafo 2.1.1, mentre il valore Offset può

essere scelto in base alla temperatura che si desidera imporre al sistema.

VAUX = Scala · Vdemod + Offset (3.1)

Dal momento che l'amplicatore fornisce un'uscita compresa tra −10V e +10V ,

è stato necessario ridurre il segnale per evitare di danneggiare il controller di tem-

peratura. Si è scelto di compiere tale operazione utilizzando due diodi connessi in

antiparallelo: questo espediente permette di preservare una buona linearità intorno al-

la tensione di 0V , ottenuta quando il sistema è stabile, e di impedire che variazioni di

tensione particolarmente ampie nelle prime fasi della stabilizzazione possano causare la

6Termometro digitale RS Pro, accuratezza 0.1 °, codice RS: 206-3722

91

saturazione dello stadio integrale. Il circuito di connessione realizzato è rappresentato

nello schema in Figura 3.35.

Figura 3.35: Circuito di connessione del controller termico. La componente proveniente

dall'uscita ausiliaria viene compressa da due diodi in antiparallelo. Ad essa viene

aggiunto un bias per mezzo di una seconda uscita.

92

Capitolo 4

Risultati sperimentali

Durante la fase di sperimentazione sono state fatte delle valutazioni sulla stabilità della

misura capacitiva nel sistema in diverse condizioni ed è stata valutata l'ecacia delle

contromisure proposte nel Paragrafo 2.1.

In primo luogo sono stati studiati gli eetti dell'evaporazione sulla stabilità della

misura. Le modalità di test ed i risultati ottenuti sono descritti nel Paragrafo

4.1;

In seguito, nel Paragrafo 4.2 si è cercato di comprendere il modo in cui le va-

riazioni termiche inuenzino la misura capacitiva e di valutare l'ecacia delle

contromisure proposte;

La stabilità della misura è stata valutata con un test di misura durante la deposi-

zione di microsfere in polistirene immerse in una soluzione di acqua deionizzata,

secondo quanto descritto nel Paragrafo 4.3;

Inne, nel Paragrafo 4.4, è stato eettuato un test di detezione capacitiva sulla

creazione di un Self-Assembled Monolayer, con l'obiettivo di sfruttare le carat-

teristiche di stabilità del sistema per monitorare in tempo reale l'andamento

dell'adesione di tioli agli elettrodi.

Per eettuare la lettura sono state utilizzate le modalità di lettura descritte nel

Paragrafo 3.2. Lo schema di connessione delle diverse componenti è sintetizzato in

Figura 4.1, mentre in Figura 4.2 è presente una foto del setup utilizzato.

93

Figura 4.1: Schema di collegamento del setup sperimentale. La Syringe Pump controlla

il usso di liquido all'interno del circuito microuidico. L'amplicatore Lock-In fornisce

agli elettrodi un segnale di stimolazione e misura la risposta in corrente tramite gli

amplicatori a transimpedenza HF2TA e DHPCA-100. Il segnale di controllo generato

dal Lock-In viene ltrato e fornito al controller termico, permettendogli di stabilizzare

la temperatura utilizzando una cella di Peltier.

Tutti i componenti sono stati descritti durante la trattazione del Capitolo 3. Il

sensore è stato posizionato all'interno di una scatola metallica, ssato su una cella di

Peltier [25] e collegato ai connettori BNC utilizzando una vernice conduttiva d'argento.

Il canale microuidico è stato riempito utilizzando una Syringe Pump World Precision

Instruments AL1000 [20]. Le misure capacitive sono state eettuate utilizzando un

amplicatore Lock-In HF2LI [2] attraverso l'amplicatore a transimpedenza HF2TA.

Il segnale di temperatura è stato misurato dal medesimo amplicatore a seguito di una

amplicazione tramite il FEMTO DHPCA-100 [14]. L'informazione termica è stata

elaborata linearmente dall'amplicatore secondo la relazione 3.1 e compressa tramite

la rete analogica illustrata in Figura 3.35 prima di essere utilizzata come ingresso per

il controller termico HTC3000 [43] presente nel dispositivo descritto in [35].

Prima di eettuare i test in liquido ogni sensore è stato risciacquato utilizzando

2mL di acqua deionizzata con categoria ASTM Tipo I, prelevata dall'area ISO6 del

laboratorio PoliFAB.

La strumentazione di lettura è stata accesa un'ora prima di ogni test per impedire

94

Figura 4.2: Foto del setup sperimentale utilizzato. La Syringe Pump WPI AL1000

(1) è collegata al circuito microuidico del sensore (2), che, stimolato in tensione dal-

l'amplicatore Lock-In Zurich Instruments HF2LI (5), fornisce dei segnali in corrente

che verranno elaborati dallo strumento in seguito alla conversione in tensione ad opera

dello Zurich Instruments HF2TA (3) e del FEMTO DHPCA-100 (4). L'amplicatore

Lock-In genera un segnale di controllo che viene ltrato (6) e fornito in ingresso al

controller termico (7).

95

che dei transitori iniziali dovuti al riscaldamento dei componenti elettronici alterassero

la misura.

I collegamenti microuidici sono stati realizzati utilizzando delle siringhe da 5mL1

e da 1mL2, degli aghi3 collegati elettricamente alla scatola metallica per ridurre le

interferenze elettromagnetiche, dei tubi essibili prodotti da Tygon4 che collegano gli

aghi a dei tubicini in argento di 1cm con diametro interno 1.12mm ed esterno 1.72mm

inseriti all'interno della struttura microuidica in PDMS.

Durante gli esperimenti è stato utilizzato il software ziControl 16.12 fornito da

Zurich Instruments per controllare l'amplicatore Lock-In e registrare i dati da esso

elaborati, ed il software MATLAB 2016b per visualizzare ed elaborare i dati registrati.

I test sono stati condotti in una stanza separata dal resto del laboratorio per evitare

disturbi termici indesiderati.

L'entità del rumore è stata quanticata calcolando la radice della deviazione qua-

dratica media normalizzata con il valore medio, descritta dalla relazione 4.1, sull'intera

durata della registrazione.

NRMSD =RMSD

y=

√∑nt=1(y−yt)2

n

y(4.1)

4.1 Eetti dell'evaporazione

Per valutare l'inuenza dell'evaporazione sul sistema sono stati confrontati i dati ot-

tenuti da due esperimenti ripetuti in condizioni analoghe: in un caso si utilizza un

sensore che non è dotato di un canale microuidico, mentre nell'altro si utilizzano le

metodologie descritte in 2.2, in cui il canale del sensore viene collegato alla Syringe

Pump e la lettura dei canali avviene utilizzando l'amplicatore Lock-In. In questo

caso non viene utilizzata una la lettura dierenziale dei canali. Durante gli esperimenti

sono stati utilizzati due sensori caratterizzati dalla Geometria 2, dotata di un doppio

1Terumo SS-05S 5cc Luer Slip Tip Syringe.2Syringe PP/PE luer slip tip, acquistate da Sigma-Aldrich, codice Z683531.3BD Precisionglide gauge 18, L 1 1/2 in., Codice Sigma-Aldrich Z1180444Tygon R-3603 Z118044

96

canale microuidico, e non è stato utilizzato il controller per la stabilizzazione della

temperatura.

Confrontando le prestazioni ottenute durante le due prove è possibile capire se,

e quanto, l'evaporazione inuenzi la lettura capacitiva e valutare l'ecacia del canale

microuidico per contrastare tale disturbo. Nel caso in cui le ipotesi fatte nel Paragrafo

2.1 fossero veritiere, nel primo test si osserverebbero delle uttuazioni sovrapposte ad

un drift, mentre nel secondo solo delle uttuazioni.

Nel primo esperimento una camera di reazione in polipropilene dal volume di 0.6mL

ottenuta da un chip per analisi impedenziometriche rappresentato in Figura 1.10 è stata

incollata al substrato litografato utilizzando della colla bicomponente5. Una foto del

dispositivo ottenuto è riportata in Figura 4.3.

Figura 4.3: Foto del sensore utilizzato per il test sull'evaporazione.

La camera di reazione è stata pulita riempiendola con acqua bidistillata e risciac-

quandola ogni 30 minuti per 4 ore. Il chip è stato installato nella scatola per la misura

ed è stato collegato alla strumentazione, secondo quanto descritto nel Paragrafo 3.2.

Per impedire la contaminazione dell'acqua e per ostacolare l'evaporazione, la camera

di reazione è stata coperta con un piatto di Petri in polistirene.

La misura capacitiva è avvenuta secondo le modalità previste nel Paragrafo 3.2.1 ed

il valore di capacità è stato campionato con una frequenza di 7.03S/s per una durata

5Adesivo epossidico, codice RS 236-7995

97

complessiva di 12 ore, durante le quali nessuno ha avuto accesso alla stanza in cui è

avvenuta la registrazione. Il modulo dell'andamento capacitivo risultante è riportato

in Figura 4.4, mentre la sua fase è riportata in Figura 4.5. La deviazione quadratica

media normalizzata del segnale calcolata sull'intero segnale con la relazione 4.1 è pari

a 1253ppm, mentre osservando un periodo di 10 minuti la deviazione è pari a 38.8ppm.

Il drift che è possibile osservare durante la registrazione è pari a 0.5fF/h.

Figura 4.4: Esperimento sull'evaporazione - Misura della capacità nel caso di liquido

contenuto in una camera di reazione.

Nel secondo esperimento è stato utilizzato un sensore dotato di un circuito microui-

dico prodotto secondo le metodologie indicate nel Paragrafo 3.1. Una volta ssato alla

scatola di metallo e connesso alla strumentazione di lettura e al circuito microuidico,

il sensore è stato risciacquato facendo scorrere 2mL di acqua bidistillata all'interno del

canale, ossia un volume 20 volte maggiore di quello del circuito, includendo il volume

dei condotti per il collegamento alla Syringe Pump, con un usso pari a 5µL/min.

La misura capacitiva è stata eettuata secondo quanto descritto nel Paragrafo 3.2.1

con una frequenza di campionamento di 7.03S/s per una durata di 12 ore. Il modulo

dell'andamento capacitivo registrato è riportato in Figura 4.6, mentre la sua fase è

98

Figura 4.5: Esperimento sull'evaporazione - Misura dello sfasamento della capacità nel

caso di liquido contenuto in una camera di reazione.

riportata in Figura 4.7. Occorre ricordare che la fase misurata negli esperimenti è

aetta dal ritardo di propagazione dei segnali lungo i cavi di collegamento e dagli

sfasamenti aggiunti dalla banda nita degli amplicatori utilizzati. Il valore assoluto

della fase è quindi poco signicativo e nelle analisi si farà unicamente riferimento alle

sue variazioni. In questo caso la deviazione quadratica media normalizzata del modulo

della capacità sull'intera registrazione è pari a 171ppm, mentre su una durata di 10

minuti è pari a 29.7ppm.

Poiché non è stato utilizzato alcuno strumento di stabilizzazione termica, entrambe

le registrazioni sono aette da variabilità introdotte da un abbassamento della tem-

peratura dovuto allo spegnimento del sistema di riscaldamento dell'edicio durante la

notte. Tale abbassamento provoca una diminuzione della temperatura dell'acqua e

quindi un aumento della sua costante dielettrica e della capacità misurata, oltre che

una riduzione della sua conducibilità. Nel caso in cui si assistesse ad un fenomeno di

evaporazione, la concentrazione ionica della soluzione aumenterebbe a causa della dimi-

nuzione del volume del liquido, pertanto si registrerebbe un aumento della conducibilità

99

Figura 4.6: Esperimento sull'evaporazione - Misura della capacità nel caso di liquido

contenuto in un microcanale.

Figura 4.7: Esperimento sull'evaporazione - Misura dello sfasamento della capacità nel

caso di liquido contenuto in un microcanale.

100

della soluzione. Confrontando i graci in Figura 4.5 e 4.7 relativi rispettivamente alla

fase del primo e del secondo esperimento, è possibile notare che la seconda diminui-

sce nel corso della notte quasi del 2%, che associata ad un aumento del modulo della

capacità è riconducibile ad una diminuzione della componente reale dell'ammettenza,

quindi della conducibilità della soluzione. Nel caso del primo esperimento, invece, la

fase ha una variabilità di circa 300ppm, nonostante le condizioni termiche siano ana-

loghe per entrambe le registrazioni. Tale andamento è spiegabile con il bilanciamento

di due fenomeni, l'evaporazione ed il rareddamento del liquido, che agiscono sulla

conducibilità in modo opposto.

Confrontando l'andamento ottenuto durante i due esperimenti è possibile osservare

che la variabilità registrata è drasticamente diminuita, passando da 1253ppm in assenza

del circuito microuidico a 171ppm in presenza di quest'ultimo. Anche le elaborazioni

relative a nestre temporali di 10 minuti indicano un miglioramento, in quanto si passa

da una deviazione di 38.8ppm ad una di 29.7ppm, valore al limite dell'accuratezza dello

strumento utilizzato, secondo quanto indicato nell'articolo [6].

In base a quanto esposto sembrano esserci evidenze sperimentali per aermare che

le prestazioni del sistema vengono migliorate dall'utilizzo di un canale microuidico.

101

4.2 Eetti della variazione di temperatura

In questa fase della sperimentazione si desidera ispezionare l'inuenza delle variazioni

termiche sul sistema progettato in diverse condizioni e quanticare il miglioramento

prestazionale ottenuto con le metodologie descritte nel capitolo precedente.

Esperimento 1 - Variazioni di temperatura controllate In questo esperimento

si desidera imporre al sistema una sequenza di temperature utilizzando il controller

termico ed osservare le i cambiamenti che queste variazioni producono nel valore di

capacità e nel segnale ottenuto dal sensore di temperatura. Secondo quanto descritto

nei precedenti capitoli si dovrebbe ottenere una diminuzione del valore di capacità

all'aumentare della temperatura.

Durante questo test è stato utilizzato un sensore con il design della Geometria 1.

Prima di iniziare il test il sensore è stato risciacquato con 2mL di acqua bidistillata

con un usso pari a 5µL/min. Il collegamento alla strumentazione è avvenuto secondo

quanto descritto nel Paragrafo 3.2. Il trimmer associato al riferimento del sensore di

temperatura è stato impostato in modo da avere un valore pari a 0.4µV alla tempera-

tura di 23°C. La tensione dierenziale ottenuta dal sensore viene elaborata linearmente

ed inviata al controller di temperatura tramite la relazione Verr = 10000Vdemod+Offset .

Durante l'esperimento il valore di Offset viene portato da 0 a 50 con step di 5 dalla du-

rata media di 10 minuti. In Figura 4.8 è riportato l'andamento del modulo del valore di

capacità, mentre in Figura 4.9 è riportata la componente reale del segnale proveniente

dal sensore di temperatura. Entrambi i valori vengono campionati con una frequenza

di 7.03S/s.

La temperatura è stata vericata utilizzando la termocoppia durante ogni cambia-

mento. La variazione di oset impostata corrisponde ad un aumento medio di 3.7°C,

che si traduce in una diminuzione del segnale pari a circa 33fF e di una diminuzione

del segnale proveniente dal sensore di temperatura pari a circa 0.5mV . Tali cambia-

menti corrispondono rispettivamente a variazioni di 8600ppm e 4450ppm, inferiori di

circa un terzo rispetto a quanto atteso.

É possibile valutare la stabilità del sistema calcolando il rumore presente in pros-

simità del punto di lavoro impostato considerando gli ultimi 6 minuti prima dell'ag-

102

Figura 4.8: Esperimento 1 sulla temperatura - Misura della capacità con variazioni

termiche controllate.

Figura 4.9: Esperimento 1 sulla temperatura - Misura del sensore di temperatura con

variazioni termiche controllate.

103

giornamento dello stimolo termico. Una volta stabilizzata la temperatura la capacità

presenta una deviazione quadratica media normalizzata pari a 65ppm, mentre tale valo-

re vale 7.3ppm per il sensore di temperatura, considerando un valore di corrente medio

pari a 58.2µA. L'ottima stabilità del sensore di temperatura è stata raggiunta anche

grazie alla misura dierenziale discussa nel Paragrafo 3.2.2 che ha permesso di miglio-

rare il limite di risoluzione dell'amplicatore Lock-In impiegato negli esperimenti. In

base ai dati ricavati durante l'esperimento tali valori corrispondono ad una stabilità di

3.14m°C. Rispetto ai valori riportati negli articoli [8] [9], in cui la variabilità registrata

era pari a circa l'1%, il segnale capacitivo registrato è circa 153 volte più stabile.

Da questo esperimento è possibile osservare che l'andamento del valore di capa-

cità dipende fortemente dalla temperatura del sensore con un coeciente di circa

−8.9fF/°C. Questo valore implica che è suciente una uttuazione di 10m°C del-

la temperatura per avere un'incertezza nella misura di capacità maggiore di quella

introdotta dallo strumento di misura. Il modulo della tensione registrata sul canale

relativo al controllo termico aumenta proporzionalmente alla temperatura. Superata

una temperatura di circa 41°C il controller entra in una condizione di stabilità margi-

nale e compaiono delle oscillazioni permanenti in entrambi i segnali registrati. Questo

avviene perché il modulo del segnale di temperatura ottenuto è circa 10000 volte più

grande di quello utilizzato durante la calibrazione del sistema: in questo contesto il

guadagno impostato per la correzione impone variazioni termiche di grande intensità

in un tempo ridotto. Per evitare questo problema è opportuno impostare il trimmer

utilizzato per la lettura dierenziale in modo da ottenere un segnale di alcuni micro-

Volt in corrispondenza della temperatura a cui si desidera avere una maggiore stabilità

termica.

Esperimento 2 - Stabilità termica su lungo periodo In questo esperimento si

intende valutare la stabilità del valore capacitivo su un periodo lungo. Secondo quanto

descritto nel Paragrafo 2.1, le misure adottate dovrebbero garantire la stabilità del

sistema.

Durante il test è stato utilizzato un sensore caratterizzato dalla Geometria 2, in cui

sono presenti due canali microuidici distinti. Esso è stato ssato alla scatola di metallo,

104

connesso alla strumentazione di lettura ed al circuito microuidico, e risciacquato con

2mL di acqua bidistillata fatti scorrere con un usso pari a 5µL/min. Il controller

termico è stato attivato ad una temperatura di 25°C tramite la relazione lineare Verr =

6000Vdemod + 3V .

La misura capacitiva è stata eettuata secondo quanto descritto nel Paragrafo 3.2.1,

utilizzando una lettura della misura termica dierenziale, con una frequenza di cam-

pionamento di 7.03S/s per una durata di 16 ore durante la notte. Il modulo dell'anda-

mento capacitivo registrato è riportato in Figura 4.10, mentre il segnale proveniente dal

sensore di temperatura è riportato in Figura 4.11. In questo caso la deviazione quadra-

tica media normalizzata è pari a 73ppm per il modulo del valore capacitivo e 3.9ppm

per il modulo del segnale termico, considerando una corrente media pari a 38µA. Con-

siderando un periodo di 10 minuti tali valori diventano rispettivamente 32.9ppm per il

segnale capacitivo e 3.3ppm per il segnale termico.

Figura 4.10: Esperimento 2 sulla temperatura - Misura della capacità su lungo termine

con temperatura stabilizzata.

Confrontando le Figure 4.10 e 4.6 è possibile notare che l'utilizzo del controller

termico ha ridotto notevolmente la variabilità della misura capacitiva, passando da

deviazioni di 171ppm a deviazioni di 73ppm, ed eliminando i drift registrati nel corso

105

Figura 4.11: Esperimento 2 sulla temperatura - Misura del sensore di temperatura su

lungo termine con il controller attivo.

del precedente esperimento. Considerando un intervallo di tempo di 10 minuti la

variabilità della misura è passata da 29.7ppm a 32.9ppm. Questo lieve aumento può

essere giusticato da possibili errori causati dalla vicinanza con il limite di accuratezza

dell'amplicatore Lock-In utilizzato.

I dati registrati indicano un miglioramento delle prestazioni del sensore in condizioni

nel caso di utilizzo di un sistema di stabilizzazione della temperatura.

Esperimento 3 - Misura dierenziale e stabilità Con questo esperimento si

intende valutare la capacità della misura capacitiva dierenziale di compensare le ut-

tuazioni termiche. Secondo quanto aermato nel Paragrafo 2.2.2, si prevede la presenza

di un residuo dovuto alle lievi dierenze che le armature potrebbero avere a causa di

imperfezioni durante il processo di produzione.

Il test è stato svolto utilizzando un sensore dotato della Geometria 1, dotato di un

singolo canale microuidico e due sensori capacitivi separati dal sensore di temperatura,

connesso alla strumentazione ed al circuito microuidico, e risciacquato con 2mL di

acqua bidistillata fatti scorrere con un usso pari a 5µL/min. Il segnale di stimolazione

106

per la lettura dell'informazione capacitiva è stato inviato alle due armature comuni

posti agli estremi del sensore. La misura è ottenuta sottraendo il segnale di corrente

proveniente dalle armature ad esse associate.

Il sistema è stato collegato al controllore di temperatura e nel corso dell'esperimento

sono stati impostati diversi setpoint, rispettivamente 25°C, 30°C, 32°C, 31°C, 35°C,

30°C e 31°C. La temperatura è stata misurata utilizzando un NTC EPCOS B57861

[1] posizionato in un incavo nel PDMS in prossimità dell'area sensibile. Questa scelta

è dovuta alla volontà di valutare il comportamento del sistema a temperature molto

diverse senza però avere stabilità termica attorno all'area di detezione.

In Figura 4.12 è riportato l'andamento del modulo della dierenza delle capacità,

mentre in Figura 4.13 è riportato il valore di resistenza misurato tramite il sensore di

temperatura. Poiché il valor medio del modulo delle due capacità è pari a 2.52pF , la

deviazione quadratica media normalizzata è pari a 8.1ppm il sensore capacitivo. Tale

valore è mediamente pari a 155ppm per il sensore di temperatura. Ricordando che nei

casi precedenti si registrava una deviazione della misura di temperatura pari a circa

5ppm, è possibile aermare che le uttuazioni termiche presenti in questa registrazione

sono circa 30 volte maggiori di quelle registrate nei precedenti esperimenti. Questo

valore conferma la necessità di utilizzare un sensore di temperatura integrato nel di-

spositivo per stabilizzare ecacemente le condizioni termiche in prossimità dell'area di

analisi, secondo quanto descritto nel Paragrafo 2.1.1.

Osservando i risultati dell'esperimento è possibile notare che, nonostante la presen-

za di uttuazioni termiche, la lettura dierenziale permette di compensare i fenomeni

comuni ad entrambe le capacità e di migliorare le prestazioni di lettura di raggiungere

un livello di più di 4 volte, passando dai 35ppm che mediamente venivano registrati

utilizzando un singolo canale a 8.1ppm. Questa tecnica permette di superare le limita-

zioni di accuratezza dello strumento di misura e di discriminare variazioni capacitive

di minore entità.

Quando le uttuazioni di temperatura sono particolarmente intense, come nel caso

di cambio di temperatura, il segnale capacitivo ha delle alterazioni dovute alle dierenze

presenti tra le armature litografate: dierenti valori base di capacità causano diverse

velocità di variazione in risposta ad un cambiamento di temperatura. L'utilizzo della

107

Figura 4.12: Esperimento 3 sulla temperatura - Misura della capacità dierenziale nel

caso di stimoli termici.

Figura 4.13: Esperimento 3 sulla temperatura - Misura del sensore di temperatura

durante gli stimoli termici imposti.

108

misura capacitiva dierenziale permette di compensare ecacemente delle uttuazioni

termiche proporzionalmente alla similarità delle due capacità di partenza.

A causa delle disuniformità geometriche degli elettrodi, anche le misure dierenziali

sono aette da fenomeni di uttuazione. In Figura 4.14 e 4.15 sono riportati rispetti-

vamente il modulo del segnale capacitivo e del segnale di temperatura registrati subito

prima dell'esperimento presentato, quando il controller termico non era ancora stato

attivato. Durante la registrazione è stata registrata una variazione di temperatura di

0.15°C, secondo i dati di calibrazione del sensore di temperatura litografato. La devia-

zione registrata durante l'intera registrazione è pari a 37ppm per il segnale capacitivo

e a 265ppm per il segnale di temperatura. Nel caso in cui si considerasse una nestra

temporale di 10 minuti tali valori diverrebbero rispettivamente 14ppm e 68ppm.

É possibile osservare che l'entità della variazione è tale da non consentire una com-

pensazione del fenomeno. La presenza di variazioni di temperatura poco superiori ad

un decimo di grado quadruplicano la deviazione registrata, vanicando l'incremento

prestazionale ottenuto utilizzando una lettura dierenziale. Questo permette di af-

fermare che tale tecnica di misura, pur essendo meno inuenzata dalle uttuazioni

termiche, non è del tutto immune ai loro eetti negativi. É necessario dotare il se-

tup sperimentale di un controller di temperatura per assicurarsi una migliora stabilità.

La sua presenza permette inoltre di modicare in modo controllato la temperatura

dell'ambiente di analisi, rendendo possibile l'utilizzo di reazioni chimiche controllabili

termicamente.

Esperimento 4 - Compensazione disturbi esterni Durante questo esperimento

si è sono state eettuate delle valutazioni sulla capacità del sistema di stabilizzazione di

rispondere a disturbi termici esterni. Durante questo test è stato utilizzato un sensore

caratterizzato dalla Geometria 2, che è stato preventivamente risciacquato con 2mL di

acqua bidistillata fatti scorrere con un usso pari a 5µL/min.

Sono state realizzate due registrazioni consecutive sul medesimo sensore in con-

dizioni analoghe: nella prima il controller di temperatura era spento, mentre nella

seconda era acceso ed impostato con un setpoint di 25°C tramite la relazione lineare

Verr = 6000Vdemod+1.2V . Il canale capacitivo è stato misurato in modo non dierenzia-

109

Figura 4.14: Esperimento 3 sulla temperatura - Misura della capacità dierenziale nel

caso di uttuazioni termiche dovute a fenomeni ambientali.

Figura 4.15: Esperimento 3 sulla temperatura - Misura del sensore di temperatura in

presenza di uttuazioni termiche dovute a fenomeni ambientali.

110

le, mentre il sensore di temperatura è stato misurato utilizzando l'approccio descritto

nel Paragrafo 3.2.2.

Durante il test il sistema è stato stimolato dall'esterno posando la mano sul coper-

chio della scatola metallica per 1 minuto e registrando per 20 minuti la risposta del

sistema. Lo stimolo esterno è stato quanticato ponendo la termocoppia tra la mano

ed il coperchio metallico. Sono stati misurati mediamente 32.4°C con una deviazione

standard pari a 0.2°C.

In Figura 4.16 e 4.17 sono riportate rispettivamente il modulo della misura del

sensore capacitivo e quello della misura del sensore di temperatura nel caso in cui il

controllore sia spento. La deviazione quadratica media normalizzata è pari a 385ppm

nel caso della capacità e 331ppm nel caso della temperatura, considerando un valore

medio di corrente pari a 40µA . In Figura 4.18 e 4.19 sono analogamente riportati i

graci relativi alla misura capacitiva e termica nel caso in cui il controllore sia acceso.

In questo caso si ha una deviazione quadratica media normalizzata pari a 73ppm per

il canale capacitivo e 9.9ppm per la misura termica. La variazione termica prodotta a

livello dell'area di detezione è mediamente pari a 0.3°C, secondo i dati di calibrazione

sul sensore.

Questo esperimento permette di valutare la capacità del sistema di reagire a disturbi

termici esterni in presenza ed in assenza di un controllo termico esterno. Ipotizzando

uno scenario di utilizzo di un sensore capacitivo in liquido, è facile immaginare che

delle interazioni con l'esterno potrebbero introdurre dei disturbi termici. In base ai

dati riportati in Figura 4.16 viene applicato uno stimolo nei minuti 10, 32 e 54. Dalla

Figura 4.17 è possibile notare che 20 minuti non sono sucienti per permettere al

sensore di tornare alla temperatura iniziale e che quindi il calore tende ad accumularsi

nell'ambiente di detezione. Osservando la Figura 4.19 è possibile notare che nei minuti

0, 21 e 43 viene fornito uno stimolo termico. La Figura 4.18 indica che il controller

riesce a compensare il disturbo e a ridurre le alterazioni visibili nel canale di misura

capacitivo. Nel primo caso, quando il controller non è attivo, le variazioni termiche

dovute al singolo stimolo sono pari a circa 0.25°C, mentre nel secondo caso le variazioni

registrate sono pari a circa 0.05°C, ossia 5 volte meno grandi. Questo si traduce in

una minore ampiezza delle uttuazioni capacitive, infatti si passa da 3fF a 0.6fF , e

111

Figura 4.16: Esperimento 4 sulla temperatura - Misura della capacità nel caso di stimoli

termici esterni imposti.

Figura 4.17: Esperimento 4 sulla temperatura - Misura del sensore di temperatura

durante gli stimoli termici esterni imposti.

112

Figura 4.18: Esperimento 4 sulla temperatura - Misura della capacità dierenziale nel

caso di stimoli termici e controller attivo.

Figura 4.19: Esperimento 4 sulla temperatura - Misura del sensore di temperatura

durante gli stimoli termici esterni imposti e controller attivo.

113

nell'assenza di drift nella misura. Osservando i risultati dell'esperimento, è possibile

aermare che il controller riesce a compensare i disturbi termici esterni ecacemente

e a migliorare l'adabilità della misura in un possibile scenario di utilizzo ordinario.

114

4.3 Detezione capacitiva di microsfere

In questo esperimento è stata valutata la capacità del sistema di individuare la presenza

di microsfere in polistirene sulla supercie degli elettrodi. Per fare questo è stata

preparata una soluzione all'1% in volume di microsfere in polistirene con diametro

5µm fornite da Sigma-Aldrich6 in acqua bidistillata. La scelta del diametro è volta a

favorire la deposizione delle sfere sugli elettrodi, mentre la scelta del materiale è dovuta

alla sua bassa costante dielettrica relativa, pari a εr = 2.6 [29], che fornisce un ottimo

contrasto rispetto all'acqua.

Durante l'esperimento è stato utilizzato un sensore caratterizzato dalla Geometria

1, che è stato preventivamente risciacquato con 2mL di acqua bidistillata fatti scorrere

con un usso pari a 5µL/min. Sia la temperatura che la capacità sono state rilevate

utilizzando un approccio non dierenziale. Il controller termico è stato impostato in

modo da ssare una temperatura pari a 25°C.

Ipotizzando che la concentrazione di microsfere sia uniforme in tutto il volume

della soluzione, nella porzione di microcanale che sovrasta l'elettrodo dovrebbero essere

presenti circa 0.01×VolumeCanaleV olumeSfera

= 700 microsfere. Ipotizzando che il liquido sia fermo nel

canale, e che quindi non vi siano forze di trascinamento agenti sulle sfere, è possibile

calcolare il tempo di deposizione sapendo che la forza agente su di esse è pari a Fg =

(ρPS − ρH2O) g 43πr3 = 32fN , considerando la densità ρPS = 1050kg/m3 [29], in quanto

la forza di gravità viene contrastata dalla spinta di Archimede. Se il liquido è fermo le

sfere tenderanno a depositarsi, quindi la forza di gravità verrà bilanciata dalle forze di

trascinamento in direzione verticale. Poiché esse possono essere calcolate mediante la

relazione Fdrag = 6πηrv, con η = 0.001Pa/s pari alla viscosità dell'acqua, è possibile

calcolare la velocità di deposizione come v = Fg

6πηr= 0.68µm/s. Pertanto le microsfere

impiegheranno circa 44 secondi per depositarsi sul fondo del sensore quando il liquido

sarà fermo.

É possibile stimare la variazione introdotta da una singola microsfera posata sul-

l'elettrodo seguendo il medesimo modello rappresentato in Figura 2.7 e lo stesso me-

todo utilizzato nel Paragrafo 2.2.2. Per semplicare il calcolo ogni singola sfera ver-

6Codice prodotto 79633

115

rà descritta come un cubo di pari volume, quindi dal lato di 4µm. In questo ca-

so in assenza della sfera un elemento dell'elettrodo introdurrebbe un contributo pari

a CH2O = ε0εH2O(4µm)2

π18.75µm= 192aF . Nel caso in cui fosse presente una microsfe-

ra, questa introdurrebbe un contributo pari a Cbead = ε0εbead(4µm)2

4µm= 92aF , men-

tre il contributo dovuto all'acqua diverrebbe C ′H2O = ε0εH2O(4µm)2

π18.75µm−4µm= 206aF .

La variazione capacitiva stimata per una singola microsfera aggiunta è pari a ∆C =

CH2O −(

1Cbead

+ 1C′H2O

)−1

= 129aF . Per avere un più ecace riscontro con cui con-

frontare i dati sperimentalmente ottenuti è stata eettuata una simulazione numerica

utilizzando il software COMSOL Multiphysics 5.2, prodotto da COMSOL, in cui è

stata valutata la dierenza della misura capacitiva introdotta dalla presenza di una

microsfera caduta in diverse posizioni del sensore. In tal caso la diminuzione di va-

lore registrata è compresa tra 25aF , nella posizione indicata durante l'elaborazione

del modello semplicato, e 81aF , ottenuti in prossimità del bordo dell'elettrodo, con

una diminuzione media pari a 50aF per ogni microsfera sedimentata. La dierenza

rispetto al valore precedentemente stimato può essere spiegata dall'eettivo andamen-

to delle linee di campo, che tendono ad evitare la microsfera invece che attraversarla,

contrariamente a quanto è stato ipotizzato nel modello semplicato proposto.

La registrazione del segnale capacitivo ottenuta al termine del test è riportata in

Figura 4.20. Nel corso dell'esperimento è stato iniettato il liquido da analizzare utiliz-

zando la Syringe Pump con usso di 5µL/min. Nel trentesimo minuto è stata spenta

per permettere la deposizione delle sfere. La registrazione è proseguita per altri 50

minuti per valutare possibili drift nel valore capacitivo. In seguito la pompa è stata

nuovamente accesa per 5 minuti altre tre volte nel corso della registrazione per valutare

la ripetibilità della misura.

Durante alcune registrazioni eettuate precedentemente in condizioni analoghe uti-

lizzando della sola acqua bidistillata, è stato sperimentalmente osservato che l'accensio-

ne e lo spegnimento della Syringe Pump con il usso indicato provoca rispettivamente

un aumento ed una diminuzione del valore capacitivo letto pari a 1fF con un transitorio

che ha una durata di 35± 1s a causa dell'inerzia del uido.

Nella registrazione dovrebbe essere visibile un contributo dovuto al movimento del

uido, sperimentalmente quanticato in precedenza, ed una diminuzione del valore

116

capacitivo dovuta alla deposizione delle microsfere.

In Figura 4.20 ed in Figura 4.21 sono riportati i graci relativi al modulo ed alla

fase della capacità misurata, mentre in Figura 4.22 è riportato il modulo della misura

di temperatura.

Figura 4.20: Esperimento di detezione di microsfere - Misura della capacità. Nelle aree

contrassegnate in rosso la pompa microuidica è accesa, mentre in quelle contrassegnate

in verde è spenta.

É possibile osservare che in seguito al primo spegnimento della pompa si osserva

una diminuzione del valore pari a 6.5fF in 162s. Durante la seconda accensione si

osserva un aumento pari a 6.5fF in 305s, mentre nel seguente spegnimento il valore

diminuisce di 6fF in 192s. Nella successiva accensione si ha una crescita pari a 6fF

in 390s e con lo spegnimento si ottiene una diminuzione di 4.5fF in 177s. Durante

l'ultima accensione il valore aumenta di 4.5fF in 460s e durante l'ultimo spegnimento

diminuisce di 4.5fF in 191s.

Osservando i risultati ottenuti durante l'esperimento, è possibile notare che l'en-

tità delle variazioni ottenute e la le tempistiche che caratterizzano i transitori sono

compatibili con la detezione delle microsfere in soluzione. Considerando il primo tran-

117

Figura 4.21: Esperimento di detezione di microsfere - Misura dello sfasamento della

capacità. Nelle aree contrassegnate in rosso la pompa microuidica è accesa, mentre

in quelle contrassegnate in verde è spenta.

Figura 4.22: Esperimento di detezione di microsfere - Misura del sensore di

temperatura.

118

sitorio, se si assume che il contributo dovuto al moto del uido sia pari a 1fF , è

possibile calcolare il numero di microsfere individuate secondo le stime eettuate come

5.5fF/50aF = 110 sfere. Allo stesso modo è possibile calcolare il tempo di deposizione

come 162− 35s = 127s.

Osservando in Figura 4.21, la fase della capacità tende a cambiare andamento in

presenza ed in assenza delle microsfere. Quando queste sono presenti la conducibilità

rilevata tende a diminuire, in accordo al fatto che le microsfere sono isolanti e rendono

la conducibilità media del liquido più bassa.

Nel corso dell'esperimento è possibile notare un leggero drift crescente nel valore

capacitivo che è stato attribuito ad una lieve inessione termica causata dalla dicoltà

del controllore ad adattarsi ai repentini cambiamenti di moto del uido imposto durante

il test.

La disparità del cambiamento registrato pari a 5.5fF , rispetto ai 35fF attesi po-

trebbe indicare un errore nel modello o dei dati utilizzati durante la stima. Inoltre

il contributo di ogni microsfera dipende dalla sua esatta posizione sul sensore a causa

della particolare geometria interdigitata, il che rende necessario l'utilizzo di un modello

più complesso per prevedere la variazione introdotta.

La dierenza dei tempi di deposizione rispetto alle stime esposte durante la descri-

zione dell'esperimento, pari a circa 127s può essere dovuta ad una densità del polistirene

inferiore a quanto inizialmente previsto, ad una dispersione nel diametro delle sfere o

all'inuenza dei moti browniani che avvengono nel uido.

Durante i successivi azionamenti della pompa si osserva un andamento molto simile

a quanto registrato durante il primo tentativo, ma dei valori di stabilizzazione legger-

mente superiori negli ultimi due casi. Questo fenomeno potrebbe essere causato da un

tempo di accensione della pompa insuciente: alcune sfere potrebbero essere rimaste

sull'elettrodo durante la precedente deposizione.

119

4.4 Detezione capacitiva di un Self-Assembled Mono-

layer

Durante questo esperimento si intende misurare l'evoluzione del valore di capacitiva

del sensore durante la sua funzionalizzazione tramite Self-Assembled Monolayer.

Si desidera valutare la capacità del sensore di monitorare in tempo reale la reazione

di adesione delle molecole al substrato utilizzando i metodi di stabilizzazione proposti.

Durante l'esperimento è stata utilizzata una soluzione di Poly(2-ethyl-2-oxazoline), α-

benzyl, ω-thiol, fornito da Sigma-Aldrich7, in acqua bidistillata con una concentrazione

pari a 80µM . In questo test è stato utilizzato un sensore caratterizzato dalla Geometria

3, risciacquato con 2mL di acqua bidistillata con un usso di 5µL/min. Il segnale

capacitivo è stato letto utilizzando un approccio non dierenziale, mentre il segnale

di temperatura è stato letto utilizzando come riferimento la temperatura ambientale.

Il controller termico è stato impostato ad una temperatura di 25°C durante il test

mediante la relazione lineare Verr = 4500Vdemod + 3V .

Prima dell'esperimento il canale è stato riempito con acqua bidistillata, la registra-

zione del segnale capacitivo ottenuta al termine del test è riportata in Figura 4.23. Nel

minuto 20 la siringa è stata sostituita con quella contenente i tioli in soluzione e la

pompa è stata nuovamente avviata. Dopo circa 15 minuti l'acqua nel canale è stata

sostituita dalla soluzione. Nel minuto 50 la pompa è stata spenta. Nel minuto 110 la

siringa è stata nuovamente sostituita da una contente acqua e la pompa è stata avviata.

Dopo circa 15 minuti la soluzione nel canale è stata sostituita dall'acqua e nel minuto

170 la pompa è stata spenta.

Partendo dalla concentrazione della soluzione è possibile calcolare il numero di mo-

lecole in prossimità nella strizione del canale corrispondente ai sensori. Se si considera

che il volume tale componente è pari a circa 0.09µL, si ottiene che in prossimità del-

l'area sensibile sono presenti 80µM × 0.09µL = 7.2 · 10−12 moli, che corrispondono a

7.2 · 10−12 × 6.022 · 1023 = 4.34 · 1012 molecole.

La molecola scelta ha una lunghezza molto simile a quella analizzata a titolo esem-

plicativo nel Paragrafo 2.2.2, ma ha una struttura molto più semplice ed occuperà una

7Codice prodotto 809438

120

supercie minore. Secondo la relazione 2.8, il cambiamento capacitivo introdotto da

una singola molecola è direttamente proporzionale alla supercie che essa occupa sull'e-

lettrodo, pertanto ci si aspetta un contributo leggermente inferiore di quanto previsto

nella trattazione illustrata. Se tutte le molecole si legassero al sensore si otterrebbe una

variazione capacitiva dell'ordine di circa 50fF , ma, poiché sono presenti altre strutture

in oro nel canale e l'area sensibile rappresenta solo un quinto dell'area disponibile al

legame, ci si aspetta una variazione massima pari a circa 10fF .

In Figura 4.23 è riportato l'andamento del modulo del valore di capacità, in Figura

4.24 è riportata la sua fase, mentre in Figura 4.25 è presentato l'andamento registrato

mediante il sensore di temperatura.

Figura 4.23: Esperimento di detezione di un Self-Assembled Monolayer - Misura della

capacità. Nelle aree contrassegnate in rosso la pompa microuidica è accesa, mentre in

quelle contrassegnate in verde è spenta. Quando sul sensore è presente acqua la banda

in alto è blu, quando invece è presente la soluzione contente i tioli è gialla.

Durante l'attivazione e lo spegnimento del sensore sono state registrate delle varia-

zioni pari a 3fF a causa dell'inerzia del uido. Il cambio della siringa ha causato due

picchi in corrispondenza dei minuti 20 e 110. Nei momenti in cui nel canale è avvenuto

121

Figura 4.24: Esperimento di detezione di un Self-Assembled Monolayer - Misura dello

sfasamento della capacità. Nelle aree contrassegnate in rosso la pompa microuidica

è accesa, mentre in quelle contrassegnate in verde è spenta. Quando sul sensore è

presente acqua la banda in alto è blu, quando invece è presente la soluzione contente i

tioli è gialla.

Figura 4.25: Esperimento di detezione di un Self-Assembled Monolayer - Misura del

sensore di temperatura.

122

un cambio della composizione della soluzione sono stati registrati due picchi ampi circa

4fF scomparsi nell'arco di 10 minuti.

Durante l'esperimento, il sistema è inuenzato da una moltitudine di eetti che

agiscono contemporaneamente sul valore capacitivo registrato. Fino al ventesimo mi-

nuto il valore di capacità è stabile a 1.12pF , in questo punto viene sostituita la siringa

collegata al circuito microuidico. L'aumento pressorio introdotto nel canale a causa

dell'inserimento dell'ago nella nuova siringa ha causato un picco istantaneo nel valore.

La seguente accensione della Syringe Pump ha provocato un aumento pari a 300aF

che si esaurisce in circa 35s in conseguenza dell'inerzia del uido.

Dopo circa 15 minuti è possibile osservare un picco del valore capacitivo in corri-

spondenza del cambio del liquido analizzato: associando questa informazione al cor-

rispondente picco in Figura 4.25, è possibile ipotizzare che questo cambiamento sia

in parte dovuto ad una dierenza della temperatura delle due soluzioni pari a circa

0.4°C, secondo le calibrazioni termiche precedentemente eettuate. L'eetto termico

viene corretto dal controllore in circa 5 minuti. Un'altra possibile causa di aumento

del valore è da ricercarsi nella dierente composizione delle due soluzioni.

Terminato questo transitorio la capacità tende a diminuire lentamente: questo an-

damento potrebbe essere spiegato dall'adesione di un numero crescente di tioli alla

supercie in oro.

Nel cinquantesimo minuto la pompa microuica viene spenta, e ciò provoca un

abbassamento del valore di capacità registrato pari a 300aF . Fino al minuto 110 il

valore registrato sembra diminuire molto lentamente di circa 100aF , ma a causa del

rumore nella misura è dicile quanticare il fenomeno con esattezza o associarlo ad un

evento chimico.

Nel minuto 110 la siringa viene sostituita e la pompa viene attivata. Il movimen-

to instaurato nel uido sembra favorire l'abbassamento del valore. Questo fenomeno

potrebbe essere spiegato dall'arrivo di nuove molecole nell'area di detezione. Quindici

minuti più tardi l'acqua prende il posto della soluzione nel canale microuidico. Ancora

una volta è possibile osservare un picco nel valore capacitivo spiegabile dalla dierente

temperatura dei due uidi e dal cambiamento di ambiente elettrochimico. Durante il

risciacquo il valore capacitivo non torna a crescere: ciò signica che il contatto con la

123

soluzione di tioli ha introdotto delle modiche sulla supercie dell'elettrodo alterando-

ne le proprietà elettriche. Questa variazione di proprietà è confermata dal dierente

sfasamento della capacità rappresentato in Figura 4.24. Al termine del risciacquo, nel

minuto 170, è possibile osservare una nuova diminuzione dovuta all'inerzia del uido.

La diminuzione del valore capacitivo sembra quasi arrestarsi durante il tempo che

intercorre tra il primo spegnimento della pompa ed il secondo cambio della siringa.

Questo potrebbe essere avvenuto a causa dell'assenza di tioli disponibili al legame. É

possibile calcolare il tempo necessario per le molecole presenti nel canale per raggiun-

gere il substrato utilizzando la legge di Fick. Nel caso monodimensionale x =√Dt,

da cui t = x2

D. Approssimando il coeciente di diusione della molecola utilizzata con

quello di una molecola di simili dimensioni come del microRNA, è possibile considerare

D = 100µm2/s [50] e quindi t = 9s, considerando x pari all'altezza del canale pari a

30µm. Questo dato è consistente con l'ipotesi fatta: superati pochi minuti dal contatto

con la soluzione il numero di molecole non ancora legate è estremamente ridotto.

Confrontando i valori di capacità registrati all'inizio e alla ne dell'esperimento è

possibile notare che il sensore ha subito una variazione pari a circa 0.9fF , circa un

ordine di grandezza in meno rispetto a quanto atteso inizialmente.

Tale dierenza può essere spiegata dalla presenza di strutture metalliche su cui

l'adesione dei tioli è possibile ma non sarebbe rilevabile, come per esempio le porzioni di

elettrodo relative al sensore di temperatura, i puntini in oro causati dalle bolle presenti

nella maschera, o i tubicini in argento utilizzati per il collegamento microuidico.

124

Capitolo 5

Conclusioni

Dal confronto dei risultati ottenuti con l'esperimento sull'evaporazione descritto nel

Paragrafo 4.1, è possibile osservare che l'utilizzo di un canale microuidico riduce di

oltre 7 volte i drift sulla misura capacitiva, in quanto, a parità di arco temporale, si

passa da variazioni di 1253ppm a variazioni di 171ppm.

Il controllo della temperatura ha permesso di ridurre l'eetto di perturbazioni ester-

ne di 5 volte, permettendo di svolgere gli esperimenti in maniera più semplice. Anche

quando il dispositivo è stato utilizzato in una stanza isolata, il controllo di temperatura

ha permesso di migliorare la stabilità della misura di un fattore 2.3 raggiungendo 73ppm

di variazione in 16 ore di registrazione, in corrispondenza di una stabilità termica di

3.5m°C.

L'utilizzo della misura capacitiva dierenziale permette di eliminare le uttuazioni

dovute a fenomeni che aiggono entrambe le capacità e di ottenere degli ottimi li-

velli di stabilità, riducendo le deviazioni registrate a 8.1ppm. Tuttavia si è osservato

che le possibilità di stabilizzazione oerte da tale metodo dipendono fortemente dal-

l'uguaglianza geometrica delle due capacità e dalla loro distanza. In assenza di un

controllore di temperatura le uttuazioni termiche ambientali possono intaccare la sta-

bilità della misura dierenziale e produrre delle uttuazioni nel segnale, introducendo

una variabilità pari a 37ppm.

Gli esperimenti descritti nei Paragra 4.3 e 4.4 hanno permesso di valutare la capa-

cità del sensore nell'individuare rispettivamente delle microsfere presenti in soluzione e

delle molecole sulla supercie degli elettrodi. Grazie alla stabilità del segnale ottenuta

125

è stato possibile osservare le dinamiche di tali fenomeni attraverso il segnale capacitivo

registrato.

L'utilizzo di un canale microuidico e di un controllore termico guidato da un

sensore di temperatura, integrato nell'area di detezione, nonché l'uso di una strategia

di lettura dierenziale, eettuata tramite un riferimento capacitivo locale, permettono

di migliorare di oltre 154 volte la stabilità della misura, passando da deviazioni di

1253ppm a deviazioni di 8.1ppm. Queste strategie di misura consentono di ottenere

prestazioni circa 1000 volte migliori rispetto a quanto presentato negli articoli [8] [9],

tuttavia le due misure non sono immediatamente confrontabili, in quanto in queste

ricerche la detezione si basa sulla capacità di Double Layer, sensibile ai primi nanometri

al di sopra dell'elettrodo e non all'intero volume presente tra gli elettrodi. Il metodo

proposto potrebbe essere utilizzato per realizzare una detezione molecolare capacitiva

in liquido, tuttavia, per raggiungere tali livelli di sensibilità, è necessario che la distanza

tra gli elettrodi sia inferiore al micrometro.

126

5.1 Limiti attuali e sviluppi futuri

Uno dei maggiori fattori limitanti in fase di progettazione è stata la scarsa qualità della

fotomaschera utilizzata. L'ottimizzazione dell'intero processo produttivo ha richiesto

diversi mesi, inizialmente per la qualità insoddisfacente delle litograe, in seguito per

dicoltà legate al processo di lift-o e di Plasma Bonding.

La presenza delle bolle presenti nella maschera e riportate sul substrato è stata

attenuata notevolmente utilizzando una serie di accorgimenti e modicando il processo

fotolitograco, ma mai totalmente eliminata. Se, da un punto di vista elettrico, esse

non impediscono il funzionamento del sensore, da un punto di vista chimico rappresen-

tano un impedimento notevole in quanto ostacolano l'adesione del PDMS e vengono

funzionalizzate al pari degli elettrodi, creando delle zone cieche in cui gli analiti ricercati

saranno dicilmente individuabili.

Il progetto si pone l'obiettivo di sondare possibili metodologie di stabilizzazione della

misura capacitiva, ma, nel caso in cui si desideri utilizzare tale design per individuare

delle molecole in soluzioni a bassa concentrazione, sarebbe necessario utilizzare una

fotomaschera con risoluzione sub-micrometrica, per permettere una riduzione nella

dimensione degli elettrodi.

Il processo di PDMS Molding si è rivelato essere un'altra fonte di errore, in quanto

in molti casi le proprietà meccaniche del PDMS, strettamente collegate alla durata del

baking, si sono dimostrate insucienti.

Durante gli esperimenti sono state riscontrate alcune dicoltà riguardanti l'utilizzo

del circuito microuidico. É stato osservato che l'inserimento dei tubi metallici per il

collegamento alla pompa spesso causa un logoramento degli inlet e degli outlet a causa

della formazione di crepe nel materiale. Questo difetto si manifesta con fuoriuscite

di liquido in corrispondenza di tali crepe o con fenomeni di evaporazione dovuti a

zone a contatto con l'aria. Questo aspetto è particolarmente limitante per gli scopi

preposti: benché il circuito riduca l'eetto dell'evaporazione, questa potrebbe avvenire

partendo da una zona molto vicina all'area sensibile. In tal caso gli eetti sulla misura

sarebbero particolarmente accentuati a causa del ridotto volume di liquido presente nel

canale. Per risolvere questo problema è necessario migliorare l'interfaccia tra il circuito

127

microuidico e la Syringe Pump e aumentare la rigidità del PDMS.

Un altro problema individuato è la facilità di distacco del circuito microuidico a

causa della presenza di puntini in oro dal diametro medio di 1µm causati dalla presenza

di bolle nella fotomaschera che impediscono l'adesione del PDMS, riducendo l'ecacia

complessiva del legame. L'utilizzo di una pompa microuidica per sessioni sperimentali

prolungate aumenta il rischio di distacco del circuito microuidico. Questo aspetto può

essere migliorato utilizzando una maschera in quarzo.

Durante la produzione, la larghezza del sensore è stata ampliata in modo da sempli-

care la centratura del canale microuidico sul sensore. Se fossero disponibili tecniche

di allineamento più accurate sarebbe possibile ridurre le dimensioni dell'area sensibile

e, di conseguenza, favorire l'omogenizzazione della temperatura nell'area di detezione.

Inoltre migliorando la tecnica di connessione elettrica del sensore alla strumentazio-

ne di lettura sarebbe possibile ridurre la probabilità che accoppiamenti termoelettrici

introducano degli errori di lettura.

Il sensore di temperatura è stato realizzato in oro per rendere il processo di produ-

zione più semplice ed economico, ma esistono materiali che rispondono con variazioni

maggiori ad alterazioni termiche. Molti semiconduttori, come per esempio il Germanio,

permetterebbero di avere una sensitività alle variazioni circa 15 volte maggiore [37],

ma potrebbero richiedere la deposizione di un layer isolante nel caso di incompatibilità

con l'ambiente chimico da analizzare.

Nel caso di utilizzo di sensori con doppio canale microuidico si hanno maggiori

dicoltà nella stabilizzazione della temperatura, in quanto la maggiore estensione del-

l'area sensibile causa l'integrazione delle uttuazioni termiche provenienti da un'area

maggiore rispetto al sensore dotato di un solo canale. Se si adottassero tecniche per l'a-

desione selettiva dei biorecettori sarebbe possibile utilizzare la sola struttura a singolo

canale, in modo da garantire anche l'uniformità della composizione della soluzione in

prossimità delle capacità di riferimento e di misura. Sfruttando un'esposizione control-

lata ai raggi UV sarebbe possibile degradare i biorecettori presenti in aree in cui non si

desidera creare dei legami di anità. Una possibile alternativa consiste nell'utilizzare

un desorbimento riduttivo dei tioli applicando un potenziale negativo agli elettrodi su

cui si desidera rimuoverli, come indicato negli articoli [38] [33].

128

Per abbassare il limite di detezione del sensore è possibile elaborare il campione

prima dell'analisi in modo da concentrare il DNA presente [5] o introdurre nell'ambiente

di analisi delle molecole che possano amplicare la variazione di segnale elettrico [26]

[24]. Nel caso in cui in soluzione fosse presente una molecola ane all'analita ricercato,

ma con dimensioni maggiori e bassa costante dielettrica, sarebbe possibile sfruttare le

variazioni da essa introdotte per semplicare l'individuazione della molecola target.

Il sistema realizzato può essere considerato un punto di partenza per la creazione

di un sensore capacitivo molecolare in grado di operare in liquido. Nella fase attuale la

soluzione da analizzare deve essere elaborata a priori in modo da abbassarne il conte-

nuto salino, in quanto il front-end di lettura utilizzato non è in grado di operare ad una

frequenza sucientemente alta. Inoltre durante la fase sperimentale sono emerse delle

dicoltà relative al contenimento di soluzioni saline da parte del canale microuidico.

Si attribuisce questo problema al fenomeno descritto nel Paragrafo 2.2.3, nei punti di

contatto del PDMS con gli elettrodi.

Se al detector venisse associato un biochip per l'estrazione e la concentrazione del-

l'analita di interesse, sarebbe possibile realizzare un sistema integrato per la detezione

molecolare automatizzabile mediante un microcontrollore. Questo lo renderebbe uno

strumento semplice da utilizzare ed autonomo nel processo di analisi.

5.1.1 Esempio di automatizzazione della ricerca di DNA

Si ipotizza di voler individuare la presenza di una specica sequenza in un campione

che si suppone essere costituito esclusivamente da acqua bidistillata e DNA.

Per poter eettuare la detezione sfruttando l'anità delle doppie eliche di acidi

nucleici è indispensabile scegliere dei biorecettori adatti allo scopo preposto. In questo

caso la sonda genica ricercata deve:

essere complementare alla molecola da individuare ed orire una buona specicità

ed anità di legame;

essere facilmente vincolabile all'elettrodo;

non avere carica negativa per non impedire l'ibridazione in acqua deionizzata.

129

Una sequenza di PNA (Peptide Nucleic Acid) terminante con un tiolo rispetterebbe

tutti i requisiti elencati. L'acido peptidonucleico [32] [30] rappresentato in Figura 5.1

è un polimero molto simile al DNA, ma a dierenza di quest'ultimo le unità monome-

riche non presentano il gruppo fosfato ed il deossiribosio e sono legate tramite legami

peptidici a cui sono connesse le basi azotate. A dierenza del DNA, il PNA non ha

una carica netta, quindi in caso di ibridazione l'anità di legame sarebbe maggiore a

causa dell'assenza della repulsione tra i due backbone polimerici. Questa peculiarità

lo renderebbe particolarmente interessante per l'applicazione specica: se si utilizzasse

del DNA l'ibridazione avverrebbe dicilmente in acqua deionizzata a causa della repul-

sione tra le due catene negative. In soluzioni in cui sono presenti ioni liberi le cariche

delle catene verrebbero parzialmente schermate dall'avvicinamento di ioni positivi, ma

in soluzioni deionizzate questa situazione non potrebbe vericarsi.

Figura 5.1: Legame tra PNA e DNA. Le due molecole sviluppano dei legami idrogeno in

presenza di basi azotate complementari, ma dieriscono per la composizione chimica

dei monomeri: mentre il DNA ha un gruppo fosfato che gli attribuisce una carica

negativa, il PNA ha dei legami peptidici neutri.

Dal momento che il sistema è dotato di un controllo di temperatura, sarebbe possi-

bile programmare delle variazioni termiche che permettano il processo di denaturazione

e di ibridazione del DNA al ne di individuare una specica sequenza di acidi nucleici

nella soluzione da analizzare.

130

Per condurre un test di detezione su un nuovo campione occorrerebbe:

Aumentare la temperatura della soluzione per permettere la denaturazione delle

molecole di DNA;

Applicare un bias positivo agli elettrodi capacitivi per favorire l'avvicinamento

delle molecole degli acidi nucleici;

Ridurre gradualmente la temperatura no a raggiungere la temperatura di let-

tura, in modo da permette l'ibridazione tra le molecole di DNA e le sonde

geniche;

Applicare un bias negativo per allontanare dagli elettrodi il DNA non vincolato

da legami;

Rimuovere il bias ed eettuare la misura capacitiva.

La detezione potrebbe avvenire confrontando il valore di capacità registrato prima

di iniziare il test con il nuovo valore letto alla stessa temperatura. Tale procedimento

può essere automatizzato sfruttando l'architettura software dell'amplicatore Lock-In

utilizzato, come illustrato nell'Appendice B.

131

Appendice A

Guida alla produzione del sensore in

PoliFAB

In questa appendice verrà proposto un procedimento per la realizzazione di elettrodi

in oro su vetro soda-lime utilizzando delle fotomaschere in poliestere. In seguito verrà

descritta la creazione di un circuito microuidico da legare al chip creato.

Figura A.1: Dispositivo prodotto al termine della lavorazione.

Per ottenere il risultato in Figura A.1 è necessario eettuare una sequenza di

lavorazioni sul substrato:

La Litograa permette di riportare il pattern presente sulla maschera sul sub-

strato esponendo uno strato di fotoresist ai raggi UV;

Nella Deposizione del metallo tramite sputtering o evaporazione termica si crea

una sottile lamina di metallo uniforme sul substrato che costituirà gli elettrodi;

132

Durante il Lift-O il resist viene rimosso. Questo permette di eliminare il metallo

in eccesso e di ottenere il pattern degli elettrodi sul substrato;

Il PDMS Molding permette di creare i canali microuidici necessari;

Tramite il Plasma Bonding è possibile legare i canali al substrato in modo molto

stabile.

Ad ogni fase della lavorazione è dedicata una sezione, in cui verranno illustrate

le modalità d'uso delle varie macchine ed alcuni suggerimenti per ottenere un buon

risultato.

A.1 Litograa

La litograa determina la qualità del pattern che verrà ottenuto dopo la deposizione del

metallo. Qualora in questa fase il risultato dovesse essere poco soddisfacente, sarebbe

meglio anare il procedimento prima di proseguire con le fasi successive.

Questa lavorazione richiede una sequenza di passaggi da svolgere in camera gialla,

ognuno dei quali richiederà particolari accortezze per permettere di avere un buon

risultato.

Innanzitutto occorre pulire il campione che si desidera litografare, in seguito occorre

distribuire uno strato uniforme di resist, esporre il substrato ai raggi UV ed inne

sviluppare il pezzo in modo da eliminare le aree di resist non solidicate.

A.1.1 Preparazione del campione

Le fasi che precedono l'esposizione sono essenziali per ottenere un buon risultato. Se il

campione non è ben pulito, il resist non aderirà correttamente o includerà dello sporco.

Questo creerà delle anomalie nei pattern riportati al termine della litograa.

Prima di cominciare la litograa è opportuno:

Preparare una tovaglietta di carta pulita su cui appoggiare il pezzo tra una fase

e l'altra;

Pulire le pinze per essere certi di non contaminare il campione;

133

Pulire un piatto di Petri che verrà rovesciato sul pezzo semi lavorato per impedire

che eventuali particelle di polvere vi si posino sopra;

Accendere l'hotplate in Figura A.2 a 120 per avviare il riscaldamento della

piastra.

La pulitura dei pezzi avviene sotto la cappa aspirata tramite acetone e isopropanolo.

Il primo è un ottimo solvente, stacca lo sporco in modo molto ecace, ma evapora

immediatamente ridepositandolo. Occorre utilizzare l'isopropanolo per rimuovere lo

sporco staccatosi prima che l'acetone evapori. Al termine occorre asciugare il tutto

con azoto.

Figura A.2: Hotplate Sawatec.

É buona norma pulirlo da entrambi i lati, ma è bene concentrarsi sulla faccia che si

utilizzerà per la litograa eettuando due o tre passaggi. Al termine occorre asciugare il

pezzo con azoto e lasciarlo sull'hotplate a 120 per almeno 5 minuti. Questo permette

di far evaporare eventuali particelle d'acqua che ostacolerebbero l'adesione.

134

(a) Spin coater per substrati grandi.

(b) Spin coater per substrati piccoli.

Figura A.3: Spin coater presenti in camera gialla.

Una volta terminata la deidratazione è necessario rareddare e pulire il campione

con azoto prima di posizionarlo nello spin coater. Questo permetterà di eliminare even-

tuali granelli di polvere posati sulla supercie durante il tempo trascorso sull'hotplate

e permetterà di abbassare la temperatura prima di aggiungere il primer sul campione.

Se si desidera elaborare un wafer o un substrato piuttosto grande è necessario

utilizzare lo spin coater illustrato in Figura A.3a, o, in alternativa, quello in Figura

A.3b presente sotto la cappa aspirata.

Sarà necessario programmare lo spin coater in base allo spessore desiderato: per

ottenere uno strato di 1.2µm si può impostare una velocità di 4000rpm, un'accelerazione

di 400rpm/s, un tempo di 60 secondi. Le stesse impostazioni possono essere usate sia

per il resist che per il primer.

A questo punto occorre posizionare il campione nella macchina centrandolo per

quanto possibile sulle incavature che attiveranno il vuoto ed utilizzare le pipette per

spargere sul campione prima il TI Prime e poi l'AZ 5214E. Entrambi devono essere

conservati ad una temperatura di 4°C e devono essere prelevati dal frigorifero subito

prima del loro utilizzo.

135

In questa fase bisogna fare molta attenzione a non contaminare le riserve di resist

e di primer, pertanto bisogna utilizzare delle pipette diverse per le due sostanze. Se

si fanno più litograe contemporaneamente è preferibile eettuare lo spinning con TI

Prime per tutti i pezzi e solo in seguito utilizzare l'AZ, in modo da evitare errori.

Come prima cosa occorre coprire la supercie del pezzo con TI Prime, che permette

di migliorare notevolmente l'adesione dell'AZ al vetro (mediamente ne occorre 1mL per

pollice); bisogna distribuire uniformemente il primer facendo molta attenzione a non

creare bolle sulla supercie. Se ciò accadesse è possibile spostarle delicatamente verso

l'esterno con la punta della pipetta o aspirarle con attenzione. Per evitare di formarne

è bene continuare a premere leggermente la pipetta.

Nel caso in cui non fosse possibile utilizzare il TI Prime sul substrato sarebbe

opportuno sostituirlo con un'esposizione al Plasma a circa 100W per almeno 2 minuti:

ciò attiva la supercie del vetro e migliora l'adesione dell'AZ.

Terminato lo spin, occorre posizionare il campione sull'hotplate per 120 secondi a

120 per far evaporare il solvente del primer e permettergli di permeare negli strati

superciali del vetro.

L'intera operazione deve essere ripetuta con il resist, ma, a dierenza di prima,

occorre posizionare il campione sull'hotplate per 90 secondi a 110. In questo caso

occorre fare attenzione alla maggiore viscosità del resist: durante l'applicazione sul

substrato sarà molto più probabile che si creino delle bolle.

A.1.2 Esposizione

Per eettuare l'esposizione è possibile utilizzare il Mask Aligner mostrato in Figura

A.4.

Una volta avviato il controller della lampada UV ed acceso il Mask Aligner, occorre

settare il programma di esposizione. Nel caso specico occorre impostare: il tipo di

esposizione su Soft Contact, l'Al Gap su 150µm, il WEC Type su Cont ed il tempo di

esposizione su 11.5 secondi.

Questo programma sovraespone leggermente il resist e ciò permette di ridurre l'in-

uenza esercitata dalle numerose bolle presenti all'interno della maschera in poliestere:

136

Figura A.4: Mask aligner.

esse verrebbero altrimenti riportate sul substrato in modo molto accentuato, come

illustrato nel Paragrafo A.1.5.

A questo punto è necessario posizionare la maschera da usare per l'esposizione. É

sempre bene conservare la maschera in un contenitore rigido pulito per evitare che si

sporchi o si gra. Bisogna posizionare la maschera sul porta-maschere mostrato in

Figura A.5, poggiandola sulle scanalature che permetteranno di creare il vuoto per

sostenerne il peso. Se la macchina non riuscisse a fare il vuoto bisognerebbe controllare

di aver posizionato correttamente la maschera e vericare che il tubicino che collega

il porta-maschere sia ben collegato alla macchina. É sempre bene provare a muovere

manualmente la maschera per vericare che sia saldamente legata al supporto. Ora

bisogna ribaltare il porta-maschere e riposizionarlo nella sua sede, facendo molta at-

tenzione a non staccare il tubicino del vuoto (per ogni eventualità è sempre meglio

prendere il porta-maschere in modo da riuscire ad aerrare la maschera in caso di

distacco).

A questo punto è possibile caricare nella macchina il substrato da esporre: è neces-

sario aprire il carrello porta-campioni e posizionarlo su di esso. Una volta confermato il

caricamento, la maschera andrà in contatto e permetterà di eettuare un allineamento

più ne. Quando si sarà soddisfatti del risultato si potrà avviare l'esposizione, al ter-

mina della quale sarà necessario eettuare un trattamento termico sull'hotplate per 90

137

Figura A.5: Carrello porta-maschere e slide per il caricamento del substrato.

secondi a 110 (con estrema attenzione alla precisione della temperatura e dei tempi

di trattamento) per avviare l'inversione della polarità del resist.

Ora è necessario rimuovere la maschera dal porta-maschere e posizionare il campio-

ne nella macchina per eettuare una Flood Exposure che completi il trattamento di

inversione, avviando il test della lampada e cronometrando un'esposizione di circa 50

secondi (la durata esatta non è rilevante, purché superi i 45 secondi).

A.1.3 Sviluppo

Dopo aver completato la Flood Exposure, è possibile proseguire con lo sviluppo. Oc-

corre preparare un piatto Petri ben pulito e versarvi una quantità di AZ Developer 726

MIF suciente a coprire completamente ed abbondantemente il substrato esposto.

Lo sviluppo avviene immergendo il campione nel bagno di developer per 35 secondi,

durante i quali è possibile favorire la reazione muovendo leggermente il Petri in modo

da mettere in movimento la soluzione. É bene compiere questa operazione sotto cappa

e con molta cautela, a causa della tossicità del developer.

Alcuni secondi prima che scada il tempo cronometrato pressato, è opportuno pre-

pararsi a recuperare il campione dal bagno, dal momento che uno sviluppo eccessivo

138

frastaglierebbe i bordi delle strutture litografate. Per terminare le reazioni chimiche

occorre sciacquare abbondantemente il substrato ed asciugarlo con azoto.

Durante la pulitura della vetreria è necessario ricordare che i residui di AZ 726 MIF

devono essere opportunamente smaltiti con i riuti chimici basici, contrassegnati dal

nastro verde.

A.1.4 Reow

É possibile eettuare un reow dell'AZ litografato tramite un trattamento termico sul-

l'hotplate per 50 secondi a 120. Questo processo è facoltativo, e può essere utile per

ridurre l'irregolarità dei bordi dei pattern o per eliminare eventuali crepe che potreb-

bero comparire sulla supercie del resist in seguito ai precedenti trattamenti termici.

Tuttavia in base ai test di produzione eettuati e ai ni preposti, esso è sconsigliato, in

quanto aumenta la rigidità del resist e smussa le pareti delle feature ottenute. Questi

eetti renderebbero più lungo e dicoltoso il lift-o e aumenterebbero il rischio di di-

stacco degli elettrodi, perché l'oro tenderebbe a formare una lamina più coesa a causa

della maggiore gradualità dei dislivelli ottenuti.

A.1.5 Valutazione del risultato

Una volta terminata la litograa è possibile valutare il risultato ottenuto con il mi-

croscopio. Nel caso in cui esso non fosse soddisfacente, sarebbe bene ottimizzare il

processo prima di proseguire con gli step successivi della lavorazione.

Durante le valutazioni eettuate, si è osservato che le maschere in poliestere presen-

tano delle bolle, visibili in Figura A.6. Esse vengono riportate sul substrato durante la

litograa e possono alterare notevolmente i pattern riportati. Le tempistiche d'esposi-

zione e di sviluppo indicate sono state ottenute tramite un processo di ottimizzazione

e permettono di ridurre questo eetto (Figura A.7).

Occorre valutare anche lo spessore dello strato di resist ottenuto tramite il pro-

lometro, che permette di tracciare il prolo del campione litografato. Tale macchina

sora il campione con un sottile stilo di diamante per determinarne il prolo, permet-

tendo di valutare lo spessore del resist depositato e la profondità delle bolle ottenute.

139

Figura A.6: Foto in microscopia di una maschera in PET.

Figura A.7: Esempio di litograa eettuata correttamente (a sinistra) e di interferenza

dovuta alle bolle presenti nella maschera (a destra).

140

Questa operazione permette di osservare quante di esse hanno raggiunto il substrato e,

di conseguenza, quante ne rimarranno al termine della deposizione del metallo.

Per utilizzare il prolometro occorre posizionare il campione sul piano porta-campioni,

attivare la leva del vuoto ed avviare il caricamento del pezzo tramite il software

dedicato.

É inoltre possibile spostarsi sulla supercie no ad individuare la regione di interesse

che si desidera analizzare. Una volta individuata, è necessario impostare i parametri

della scansione, come velocità (si consiglia pari a 20µm/s), frequenza di acquisizione

(40Hz), forza applicata (2mg) e vertical range (13µm, ossia ±6.5µm) ed avviare la

scansione.

Durante la prolometria è bene allontanarsi dal banco e rimanere fermi, dal mo-

mento che anche le più piccole vibrazioni potrebbero alterare l'esito dell'analisi.

Una volta terminata la scansione, è necessario fornire al software l'indicazione di

un'area pianeggiante da scegliere come altezza zero per eliminare i drift presenti. Ora è

possibile misurare l'altezza del resist spostando i due cursori di misura rispettivamente

subito prima e subito dopo la dierenza di altezza da valutare: a sinistra saranno

riportate le altezze medie dei due cursori, da cui è possibile ricavare lo spessore del

resist.

A.1.6 SU8

Nel caso in cui fosse necessario realizzare la componente microuidica, sarebbe oppor-

tuno utilizzare l'SU8 in sostituzione dell'AZ. Il procedimento per l'utilizzo di questo

resist è molto simile a quanto visto in precedenza con poche dierenze che verranno

illustrate in questo paragrafo.

Nella fase di spin coating occorrerà scegliere il programma di spin consultando il

datasheet fornito dal produttore per il resist utilizzato. Per uno spessore di 30µm si

utilizzerà una velocità di 3000rpm. In questo caso non sarà necessario utilizzare alcun

primer, ma sarà suciente versare il resist sul substrato direttamente. Nel far ciò,

occorre prestare particolare attenzione alla sua altissima densità e viscosità.

141

Il trattamento termico da eettuare dopo lo spin è leggermente diverso da quanto

precedentemente descritto. Occorre lasciare il substrato sull'hotplate a 65 per 1

minuto, quindi aumentare la temperatura no a 95, in modo da creare una rampa

termica graduale dalla durata di circa 1 minuto con l'hotplate Sawatec presente in

Yellow Room, e lasciar proseguire il trattamento per altri 4 minuti e 30 secondi.

I tempi di esposizione sono ricavabili dal datasheet, a seconda dello spessore che

si desidera ottenere e dai dati di calibrazione della lampada. In questo caso occorre

impostare nel programma di esposizione un contatto Soft Contact, un tempo di espo-

sizione di 34s ed un Al Gap di 220µm per evitare contatti accidentali con la maschera

durante la fase di allineamento.

Terminata l'operazione è necessario eettuare un trattamento termico a 65 per

1 minuto, impostare la temperatura a 95 ed attendere altri 6 minuti. La gradualità

della rampa termica ridurrà il rischio di formazione di crepe sul resist.

Lo sviluppo viene eettuato in SU8 Developer, la cui azione viene interrotta dall'iso-

propanolo. Bisogna porre il substrato in un bagno di developer e lasciarlo in immersione

per circa 4 minuti; a questo punto occorre spruzzarlo con isopropanolo, in quanto la

comparsa di aloni bianchi sarà indice di uno sviluppo incompleto, in tal caso sarà ne-

cessario porre nuovamente il pezzo nel developer. Al termine dello sviluppo, ovvero

in totale assenza di aloni, si procede risciacquando abbondantemente con isopropanolo

e asciugando con azoto. Se necessario il substrato litografato può essere pulito con

acetone ed isopropanolo.

Per aumentare la rigidità delle feature è possibile eettuare un Hard Bake a 150

per 5 minuti.

142

A.2 Sputtering

Durante il processo di sputtering, eettuato nell'area Magnetic Thin Films, è possibile

depositare un sottile strato uniforme di metallo sul substrato precedentemente elabora-

to. Per far ciò il campione viene caricato in una camera in cui viene creato il vuoto ed

immesso dell'Argon. Un generatore a radiofrequenza permetterà di creare del plasma,

i cui ioni verranno accelerati verso il metallo da depositare (detto target) provocando

il distacco di alcuni atomi che urteranno il substrato, formando una lamina metallica

uniforme.

Per ottenere degli elettrodi in oro è necessario depositare prima del cromo (in questo

processo 6nm), in modo da creare un adhesion layer che permetta l'adesione dell'oro

(in questo processo 100nm).

Figura A.8: Macchina per la creazione di un lm sottile tramite sputtering.

Verrà utilizzata la macchina mostrata in Figura A.8. Essa è costituita da una

camera di reazione ed un rack contenente l'elettronica di controllo necessaria. É fonda-

mentale controllare l'azione delle due pompe per il vuoto (una rotativa ed una turbo),

143

Figura A.9: Camera di reazione per lo sputtering.

l'ingresso dei gas da utilizzare per la creazione del plasma (sono disponibili Argon e

Ossigeno) e l'azione del generatore che guiderà lo sputtering. É importante che nella

camera sia presente il vuoto: ciò permette di controllare in maniera capillare la compo-

sizione dei gas presenti. Aumentando la quantità di questi ultimi (e quindi di ioni che

colpiscono il target) è possibile accelerare la deposizione, ma un eccesso ostacolerebbe

il percorso degli atomi metallici nel loro percorso verso il substrato. Aumentando la

potenza è possibile accelerare maggiormente gli atomi e quindi aumentare la forza degli

impatti sul target.

In Figura A.9 è rappresentata la camera di reazione. Sul lato sinistro è presente

un selettore di catodo, tramite cui è possibile selezionare il catodo da collegare al

generatore a seconda dell'elemento che si desidera depositare. Sul lato destro è presente

una manopola che permette di spostare il campione al di sopra dell'area di sputtering.

A.2.1 Caricamento del campione

Solitamente si preferisce lasciare la camera di reazione sottovuoto per limitare la pre-

senza di contaminanti all'interno. Per aprirla è necessario spegnere la pompa rotativa

e attendere l'aumento della pressione no a circa 1mbar dovuti al vuoto statico. A

questo punto occorre immettere azoto nella camera no a consentirne l'apertura.

Il campione è ssato con un nastro di Kapton tenendo presente che la macchina è

in grado di depositare uniformemente metallo su un diametro di circa 3 pollici.

144

A questo punto è necessario ssare il porta-campioni alla macchina, rimuovere le

coperture in metallo dai catodi che si utilizzeranno durante la deposizione e coprire

quelli che non saranno necessari, in modo da evitare contaminazioni.

Una volta assicuratisi che il coperchio e le valvole di azoto siano chiusi, occorre

attivare la pompa rotativa, che dovrà essere in funzione durante l'intero processo di

deposizione.

Trascorsi circa 10 minuti l'indicatore della pressione avrà raggiunto circa 5·10−2mbar

e verrà attivata l'alimentazione della pompa turbo e dell'MFC.

Ora sarà possibile avviare la pompa turbo (la pompa rotativa dovrà restare accesa)

ed accendere il Penning, un misuratore utilizzabile per pressioni molto basse che può

essere acceso solo quando nella camera è già presente un buon livello di vuoto. Esso

garantisce un'accurata valutazione della pressione nella camera.

É necessario attendere circa un'ora per far scendere la pressione no a circa 5 ·

10−5mbar.

A.2.2 Deposizione del metallo

Una volta raggiunta la giusta pressione è possibile spegnere l'indicatore Penning ed

annotare sul quaderno accanto alla macchina i dati della deposizione (é necessario

riportare la data della deposizione, il nome dell'operatore ed i dati del processo che

verrà eettuato), ovvero:

il usso di gas usato,

la pressione nella camera,

la potenza diretta,

la potenza riessa,

la tensione DC,

i coecienti CL e CT,

lo spessore depositato,

145

il tempo di deposizione.

Per attivare il plasma è necessario selezionare il catodo da cui deve avvenire la

deposizione, assicurandosi di avere il campione in posizione Home, per collegarlo al ge-

neratore RF, quindi occorre immettere del gas Argon nella camera tramite il controller

MFC, non superando i 66 sccm.

In questa fase è importante controllare spesso la pressione all'interno della camera,

dal momento che se si dovesse immettere troppo gas e si superasse 8 · 10−2mbar la

macchina isolerebbe l'alimentazione dalla pompa turbo e dall'MFC.

Una volta stabilizzata la pressione è possibile procedere con l'attivazione del pla-

sma tramite il generatore. Occorre aumentare la potenza no a circa 70W. Il display

indicherà la potenza riessa ed il bias DC letto. Quando il plasma sarà attivato cor-

rettamente, l'indicatore del bias mostrerà una tensione diversa da zero e sarà possibile

osservare una luminescenza fucsia attraverso i vetri della camera.

Molto spesso per attivare il plasma è necessario minimizzare la potenza riessa: a

causa della dierente impedenza del contenuto della camera, parte della potenza sarà

riessa verso il generatore e non contribuirà alla deposizione. Minimizzando questo

valore è possibile migliorare l'ecacia dello sputtering e favorire l'azione del plasma.

Per fare ciò è necessario regolare i fattori CL e CT (costituiscono le componenti di

una impedenza di compensazione) ed osservare i cambiamenti nella potenza riessa.

Una buona strategia è generalmente individuare i punti che portano ad un risultato

migliore e variare CT in corrispondenza di tali valori, dal momento che durante questa

operazione si hanno buone probabilità di incappare in minimi locali.

In questa fase non è necessaria una regolazione ne, ma sarà suciente ottenere

una potenza riessa abbastanza bassa da permettere l'attivazione del plasma.

Nel caso in cui non si avesse ancora successo si potrebbe aumentare la quantità di

gas (facendo attenzione a non eccedere) e la potenza erogata. In alternativa è possibile

creare una instabilità variando repentinamente la potenza del generatore in un range

abbastanza ampio.

Una volta che il plasma si sarà stabilizzato è possibile regolare i parametri per

la deposizione: prima occorrerà selezionare la pressione di Argon corretta, in seguito

impostare la potenza del generatore e inne minimizzare in modo accurato la potenza

146

riessa, infatti una diversa quantità di Argon può portare a dierenti CL e CT. In

questa fase il plasma sarà presente in modo stabile ed è possibile cambiare le condizioni

nella camera in un range piuttosto alto senza interromperlo.

A questo punto è necessario attendere 5 minuti per permettere la stabilizzazione

delle condizioni dello sputtering e la pulitura della supercie del target da eventuali

impurità, durante i quali occorrerà annotare sul quaderno i dati delle condizioni della

deposizione, ossia:

pressione nella camera,

potenza riessa,

CL e CT,

il bias DC.

Per avviare la deposizione sarà suciente spostare il selettore di posizione in corri-

spondenza del target desiderato, misurandone il tempo con un cronometro. Al termine

sarà necessario spostare il campione in posizione Home, azzerare la potenza diretta e

spegnere il generatore.

Nel caso in cui fosse necessario depositare più metalli sarà possibile ricominciare

dalla creazione del plasma.

Secondo gli ultimi dati di calibrazione, è possibile depositare 6nm di cromo utiliz-

zando una pressione di Argon di 66sccm (pressione della camera di 6.5 · 10−2mbar) a

25W per 2 minuti e 100nm di oro utilizzando una pressione di Argon di 50sccm (pres-

sione della camera di 5.5 · 10−2mbar) a 50W per 6 minuti e 15 secondi. Consultando il

quaderno è possibile leggere nuove calibrazioni ed aggiornare questi valori se necessario.

A.3 Lift-o

Il processo di lift-o permette di rimuovere il resist depositato durante la litograa in

modo da preservare sul vetro solo il pattern degli elettrodi in metallo.

147

Questa fase della lavorazione ha una durata dipendente dalla compattezza del resist

e dal tempo necessario per provocare una rottura della lamina d'oro in corrispondenza

dei dislivelli presenti. Utilizzando il metodo proposto saranno necessari circa 45 minu-

ti. Questa fase costituisce una parte particolarmente critica del lavoro: se non viene

eettuata correttamente si rischia di eliminare parte dell'oro necessario alla composi-

zione degli elettrodi, rendendo inutilizzabile il pezzo lavorato. Inoltre occorre prestare

particolare attenzione alla pulizia del substrato ottenuto, dal momento che da essa di-

pende l'esito del Plasma bonding per legare il PDMS al substrato. Per facilitare questa

operazione può essere utile non eettuare la fase di Reow durante la litograa.

Prima di cominciare è necessario pulire la vetreria che sarà utilizzata: un Petri da

riempire con acetone, un Petri da riempire con isopropanolo (quanto basta per coprire

il substrato) ed un becker in cui raccogliere i riuti organici. É bene eettuare l'intera

operazione aprendo il meno possibile la cappa aspirata.

Come prima cosa è necessario immergere il pezzo in acetone per circa 15 minuti

agitando leggermente in modo da facilitare la reazione che permetterà al resist di dissol-

versi nel bagno di acetone. Alcuni frammenti d'oro potrebbero cominciare a staccarsi

già nei primi minuti e questo dipende principalmente dallo spessore - e quindi dalla

compattezza - della lamina d'oro. Negli ultimi due o tre minuti è possibile spruzzare

dell'acetone direttamente sul pezzo tramite spruzzetta. L'azione meccanica, attenuata

dal liquido che copre il campione, favorisce il distacco in modo non troppo aggressivo.

Giunti a questo punto si ottiene una soluzione molto sporca e ricca di frammenti

d'oro, pertanto occorre sostituirla per continuare: bisogna prendere il pezzo, sciacquarlo

immediatamente con abbondante isopropanolo prima che si asciughi, e porlo nel bagno

di isopropanolo. Questa misura è necessaria perché nel caso in cui l'acetone si seccasse

prima del risciacquo, i frammenti non eliminati aderirebbero nuovamente al substrato

e sarebbero particolarmente dicili da rimuovere. Occorre dunque smaltire il vecchio

bagno di acetone e pulire accuratamente il Petri prima di riempirlo nuovamente.

A questo punto occorre sciacquare il pezzo con acetone e porlo nel nuovo bagno

per altri 15 minuti proseguendo come descritto in precedenza. Questa operazione

è necessaria per mantenere un'alta ecacia d'azione dell'acetone e per impedire che

alcuni residui d'oro in soluzione si ridepositino.

148

Una volta accertatisi che il pattern contenente le feature più piccole sia libero dal-

l'oro in eccesso, è possibile concludere l'eliminazione del metallo ponendo il Petri nella

macchina per ultrasuoni presente sotto la cappa. Saranno necessari pochi secondi

impostando una frequenza di 59kHz ed una potenza del 40%.

A questo punto è possibile sciacquare il campione con abbondante acetone ed isopro-

panolo avendo cura di non farlo mai asciugare durante l'operazione e porlo nuovamente

nel bagno di isopropanolo.

Il Petri contenente l'acetone deve essere svuotato e pulito molto accuratamente, il

suo contenuto deve essere sostituito con AZ 100 Remover, in cui il pezzo dovrà essere

immerso per 15 minuti. Questo permette di eliminare i residui di resist più piccoli che

potrebbero essere rimasti. Per migliorare l'ecienza della reazione è possibile riscaldare

l'AZ Remover su un hotplate a 60.

Ora è possibile sciacquare il pezzo con abbondante acqua ed asciugarlo con azoto.

Al termine della procedura è opportuno vericare al microscopio che tutti i pattern

siano ben liberi e che il substrato non presenti tracce di sporco.

Nel caso in cui la pulizia della supercie non fosse soddisfacente sarebbe possibile

eettuare un altro bagno in AZ Remover o, in alternativa, potrebbe essere utilizzato

del plasma per rimuovere le ultime tracce di resist (in genere una esposizione di 15

minuti a 200W è suciente).

Tutti i reagenti utilizzati devono essere smaltiti come riuti chimici organici.

149

A.4 PDMS Molding

Questa operazione, eettuata nella sezione Back End della camera grigia, permette

di creare dei canali microuidici in PDMS partendo da uno stampo precedentemente

realizzato tramite fotolitograa con SU8. Durante questo processo, del PDMS liqui-

do verrà versato sul master mold, lasciato solidicare e staccato da esso in modo da

ottenere un calco dello stampo.

Prima di cominciare è necessario procurarsi un bicchiere di plastica che verrà uti-

lizzato per il mix dei reagenti e gli aghi necessari per la foratura del PDMS in corri-

spondenza degli inlet e degli outlet. Questi elementi dovranno essere accuratamente

puliti con isopropanolo dato che l'acetone rischia di aggredire la plastica di cui sono

composti, ed essere asciugati con azoto prima di iniziare la lavorazione.

Come prima cosa è necessario pulire accuratamente il master mold con acetone ed

isopropanolo ed asciugarlo con azoto. Occorre quindi utilizzare dei fogli di alluminio per

creare un contenitore il cui fondo deve essere costituito dal master mold, con le feature

rivolte verso l'alto. Questa operazione permette di creare dei bordi per lo stampo in

grado di contenere il polimero in forma liquida.

Bisogna dunque procurarsi i reagenti necessari alla preparazione del PDMS: la base

per il polimero e il curing agent, che dovranno essere mischiati in proporzione 10:1

nel bicchiere. In generale per un wafer da 6 pollici sono sucienti circa 50 grammi di

PDMS.

Una volta mescolato accuratamente il composto con una spatola, occorre posizio-

nare lo stampo in una delle macchine del vuoto mostrate in Figura A.10 e versare il

contenuto del bicchiere nello stampo. Ora è necessario collegare la macchina al tubo del

vuoto (solitamente contrassegnato dal colore giallo) e chiudere le valvole che la collega-

no verso l'esterno. Questa operazione permette di far salire in supercie ed eliminare

le bolle d'aria create durante il mix dei reagenti. Questa fase è particolarmente impor-

tante, perché eventuali bolle non eliminate potrebbero nire sul fondo della struttura

ed alterare la geometria delle feature. É necessario attendere almeno mezz'ora, durante

la quale è possibile aprire con cautela la valvola della camera (in quanto oltre una certa

soglia tenderà ad aprirsi rapidamente) per aumentare repentinamente la pressione e

150

Figura A.10: Camere per la creazione del vuoto.

causare la rottura delle bolle, in modo da accelerare il processo. Si potrà passare alla

fase successiva solo quando non saranno più presenti bolle in supercie.

La reticolazione del polimero avviene tramite un trattamento ad una temperatura di

85. Il campione deve essere lasciato nel forno per 60 minuti avendo cura di mantenere

un allineamento orizzontale.

Al termine del trattamento il PDMS sarà solidicato. Bisogna eliminare la carta

stagnola ed utilizzare il taglierino presente sullo scaale per liberare i bordi ed il fon-

do del master mold (dal lato opposto rispetto alle feature). A questo punto occorre

sollevare molto delicatamente con le mani il blocco di PDMS ottenuto dallo stampo in

modo da separarli. Nel caso in cui si esercitasse troppa forza si rischierebbe di causare

il distacco di alcune porzioni di SU8, provocando un danno irreparabile al mold.

A questo punto è necessario rilare il circuito microuidico utilizzando il taglierino

e poggiandosi su un dischetto in ceramica, avendo cura di mantenere le feature verso

l'alto per evitare che si depositino detriti sui microcanali.

Per concludere la lavorazione occorre utilizzare gli aghi per forare il PDMS in corri-

spondenza degli inlet e degli outlet. Per far questo bisogna fare particolare attenzione

ad individuare la posizione corretta di questi ultimi: data la trasparenza del circuito

microuidico, essi potrebbero essere dicili da individuare. Bisogna premere gli aghi

no in fondo avendo cura di realizzare un foro dritto, per evitare la formazione di crepe

151

nella struttura. La foratura avverrà asportando il materiale tagliato dall'ago, che si

congura come una struttura di PDMS cilindrica dal raggio pari alle dimensioni del

foro. Occorre eliminare questo scarto di lavorazione per essere certi di non ostruire

l'ago o il foro.

152

A.5 Plasma bonding

Questa fase della lavorazione viene svolta in camera gialla e permette di legare chi-

micamente il substrato su cui erano stati precedentemente depositati gli elettrodi ed i

canali microuidici creati. Per realizzare questa operazione viene utilizzato un plasma

alle microonde in grado di rompere alcuni legami chimici sulla supercie dei due com-

ponenti e permettere la creazione di nuovi legami una volta che essi entrino in contatto

tra loro.

Al contrario del vetro, il PDMS subisce fortemente l'aggressione del plasma: un'e-

sposizione eccessiva causerebbe una degradazione della supercie che non permettereb-

be più di creare un legame. Nel caso in cui un tentativo di bonding dovesse fallire,

non sempre il blocco microuidico esposto sarebbe in grado di sostenere nuovamente il

trattamento.

Come primo passaggio è necessario pulire accuratamente le superci da legare con

acetone ed isopropanolo ed asciugarli con azoto. La presenza di sporco renderebbe

impossibile il legame. Occorre, quindi, posizionare i pezzi nella camera di esposizione,

avendo cura di rivolgere verso l'alto la supercie che si desidera legare.

Per avviare l'esposizione occorre creare il vuoto nella camera, immettervi ossigeno

con una pressione di 1mbar ed attivare la creazione del plasma, in modo da fornire

una potenza di circa 50W per 40 secondi. Una potenza eccessiva o un tempo troppo

alto potrebbero danneggiare la supercie del PDMS e l'aumento di rugosità che ne

deriverebbe renderebbe impossibile il legame.

Una volta attivate, le superci possono essere legate entro circa un minuto, pertanto

è essenziale una rapidità di esecuzione durante la fase successiva all'esposizione. Dopo

aver attivato il Venting, bisogna estrarre i pezzi (evitando di toccare la supercie espo-

sta) e porli in contatto nel più breve tempo possibile. Occorre curare il posizionamento

con attenzione, in quanto un eventuale errore già al primo contatto, comporterebbe

il fallimento del bonding. É possibile valutare l'aderenza dei due blocchi osservando

le bolle d'aria in trasparenza. Una delicata pressione tramite pinzetta può favorire

l'adesione, in quanto una pressione troppo decisa provocherebbe l'adesione della parete

interna del microcanale e quindi la sua ostruzione.

153

Il legame appena creato è estremamente debole e deve essere raorzato tramite un

trattamento termico di almeno due ore a circa 65 su hotplate. Si suggerisce di lasciar

riposare il pezzo per 24 ore prima di utilizzare il circuito microuidico.

154

Appendice B

Script MATLAB 2016b per

automatizzare l'analisi

In questa appendice viene presentato un esempio di automatizzazione della detezione

specica di sequenze di DNA presenti nel campione da elaborare. Tale processo può

essere implementato tramite script sfruttando le funzionalità oerte dall'architettura

del software di Zurich Instrument, descritta in Figura B.1.

Il programma ore la possibilità di interagire con lo strumento attraverso un server

in esecuzione sul computer a cui è collegato. Il processo di analisi può essere automa-

tizzato sfruttando le interfacce API oerte in modo da rendere la detezione semplice e

facilmente riproducibile in modo standardizzato.

Prima di avviare il processo è necessario eettuare una calibrazione termica del

sistema per denire il valore dei parametri di controllo da utilizzare. Ipotizzando che il

canale microuidico sia stato precedentemente riempito con la soluzione da analizzare,

è possibile eettuare l'analisi svolgendo una sequenza di operazioni:

Inviare all'amplicatore Lock-In i parametri di funzionamento da utilizzare du-

rante la lettura;

Attendere alcuni minuti per permettere al controller di stabilizzare la tempera-

tura;

Leggere i valori iniziali provenienti dai due sensori. Il valore di capacità è utile per

valutare la presenza di DNA al termine dell'analisi, mentre il valore proveniente

155

Figura B.1: Architettura software Zurich Instrument. La comunicazione con tutti i

dispositivi viene gestita da un unico server, a cui è possibile interfacciarsi utilizzando

delle API per diversi linguaggi di programmazione.

156

dal canale resistivo può essere utilizzato per valutare il raggiungimento delle

medesime condizioni termiche al termine del test;

Aumentare la temperatura nel canale microuidico per avviare la denaturazione

del DNA. Questa operazione può essere eettuata semplicemente inviando un

nuovo valore di oset all'amplicatore Lock-In per l'elaborazione lineare della

misura di temperatura rilevata;

Attendere la denaturazione del DNA ed attivare un bias sull'elettrodo capacitivo

per favorire l'avvicinamento delle molecole, sfruttando la possibilità oerta dallo

strumento di sommare un segnale analogico esterno a quello generato;

Procedere all'ibridazione riducendo gradualmente la temperatura no al raggiun-

gimento delle corrette condizioni di lettura. Questo passaggio può essere imple-

mentato cambiando l'oset gradualmente no a tornare al valore inizialmente

impostato;

Allontanare le molecole non complementari che sono state attratte elettrostati-

camente applicando gradualmente all'elettrodo capacitivo un bias negativo;

Attendere per alcuni minuti la stabilizzazione delle condizioni del sistema, leggere

il nuovo valore di capacità e confrontarlo con quello letto prima del test.

Il risultato dell'analisi può essere interpretato confrontando la variazione ottenuta

con una soglia nota, ottimizzabile tramite l'elaborazione di curve ROC. L'esito può

essere fornito sia in forma binaria per semplicare l'interpretazione del test, che in

forma quantitativa per valutare particolari fenomeni o l'evoluzione di una situazione

clinica, nel caso di test ripetuti in tempi dierenti.

Di seguito è presente una proposta di implementazione di tale algoritmo tramite

uno script per il software MATLAB sviluppato da MathWorks.

1 %Impostare i valore di calibrazione prima di iniziare

2 %Offset25 e offset60 sono gli offset di lettura ed ibridazione

3 fattorescala=-4000.000000;

4 offset25=2.700000;

5 offset60=18.300000;

6 sogliadetezioneppm=600;

157

7 sogliatermicappm=350;

8 device_id='dev313';

9

10 fprintf('Connessione a ziServer\n');

11 clear ziDAQ;

12 supported_apilevel = 5;

13 [device, ~] = ziCreateAPISession(device_id, supported_apilevel);

14

15 fprintf('Inizializzazione HF2LI...\n');

16 ziDAQ('setInt', ['/' device '/demods/*/enable'], 0);

17 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/sigouts/' out_c '/range'], 1);

18

19 % System settings

20 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SYSTEM/EXTCLK'], 0);

21 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SYSTEM/SYNCENABLE'], 0);

22 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SYSTEM/SYNCRESET'], 0);

23

24 % Demod settings

25 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/ADCSELECT'], 0);

26 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/ORDER'], 4);

27 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/DEMODS/0/TIMECONSTANT'], 0.071153);

28 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/DEMODS/0/RATE'], 7.027074);

29 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/TRIGGER'], 0);

30 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/ENABLE'], 1);

31 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/OSCSELECT'], 0);

32 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/HARMONIC'], 1);

33 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/DEMODS/0/PHASESHIFT'], 0);

34 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/SINC'], 0);

35 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/1/ENABLE'], 0);

36 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/2/ENABLE'], 0);

37 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/ADCSELECT'], 1);

38 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/ORDER'], 4);

39 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/DEMODS/0/TIMECONSTANT'], 0.006776);

40 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/DEMODS/0/RATE'], 7.027074);

41 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/TRIGGER'], 0);

42 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/ENABLE'], 1);

43 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/OSCSELECT'], 1);

44 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/HARMONIC'], 1);

45 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/DEMODS/0/PHASESHIFT'], 0);

46 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/0/SINC'], 0);

47 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/4/ENABLE'], 0);

48 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DEMODS/5/ENABLE'], 0);

49

50 % Input settings

51 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/OSCS/0/FREQ'], 10000000);

52 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/OSCS/1/FREQ'], 10964.912281);

53 ziDAQ('setInt', ['/' device '/PLLS/0/ENABLE'], 0);

54 ziDAQ('setInt', ['/' device '/PLLS/1/ENABLE'], 0);

55 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/SIGINS/0/RANGE'], 0.193109);

158

56 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGINS/0/AC'], 1);

57 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGINS/0/IMP50'], 1);

58 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGINS/0/DIFF'], 1);

59 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/SIGINS/1/RANGE'], 0.009997);

60 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGINS/1/AC'], 1);

61 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGINS/1/IMP50'], 0);

62 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGINS/1/DIFF'], 1);

63

64 % output settings

65 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/0/ON'], 1);

66 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/0/ADD'], 0);

67 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/SIGOUTS/0/RANGE'], 1);

68 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/SIGOUTS/0/OFFSET'], 0);

69 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/0/ENABLES/6'], 1);

70 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/0/ENABLES/7'], 0);

71 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/SIGOUTS/0/AMPLITUDES/6'], 0.099999);

72 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/SIGOUTS/0/AMPLITUDES/7'], 0);

73 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/0/WAVEFORMS/6'], 0);

74 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/0/WAVEFORMS/7'], 0);

75 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/1/ON'], 1);

76 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/1/ADD'], 0);

77 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/SIGOUTS/1/RANGE'], 1);

78 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/SIGOUTS/1/OFFSET'], 0);

79 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/1/ENABLES/6'], 0);

80 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/1/ENABLES/7'], 1);

81 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/SIGOUTS/1/AMPLITUDES/6'], 0);

82 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/SIGOUTS/1/AMPLITUDES/7'], 0.099999);

83 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/1/WAVEFORMS/6'], 0);

84 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/1/WAVEFORMS/7'], 0);

85

86 % Aux settings

87 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DIOS/0/EXTCLK'], 0);

88 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DIOS/0/DECIMATION'], 256);

89 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DIOS/0/DRIVE'], 0);

90 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DIOS/0/OUTPUT'], 0);

91 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DIOS/0/SYNCSELECT0'], 8);

92 ziDAQ('setInt', ['/' device '/DIOS/0/SYNCSELECT1'], 8);

93 ziDAQ('setInt', ['/' device '/AUXINS/0/AVERAGING'], 256);

94 ziDAQ('setInt', ['/' device '/AUXOUTS/0/OUTPUTSELECT'], 0);

95 ziDAQ('setInt', ['/' device '/AUXOUTS/0/DEMODSELECT'], 3);

96 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/0/SCALE'], fattorescala);

97 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/0/OFFSET'], offset25);

98 ziDAQ('setInt', ['/' device '/AUXOUTS/1/OUTPUTSELECT'], -1);

99 ziDAQ('setInt', ['/' device '/AUXOUTS/1/DEMODSELECT'], 0);

100 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/1/SCALE'], 1);

101 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/1/OFFSET'], -1.943054);

102 ziDAQ('setInt', ['/' device '/AUXOUTS/2/OUTPUTSELECT'], -1);

103 ziDAQ('setInt', ['/' device '/AUXOUTS/2/DEMODSELECT'], 0);

104 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/2/SCALE'], 1);

159

105 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/2/OFFSET'], 0);

106 ziDAQ('setInt', ['/' device '/AUXOUTS/3/OUTPUTSELECT'], -1);

107 ziDAQ('setInt', ['/' device '/AUXOUTS/3/DEMODSELECT'], 0);

108 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/3/SCALE'], 1);

109 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/3/OFFSET'], 0);

110

111 % Tia settings

112 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/CAMP/R'], 0);

113 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/CAMP/GAIN'], 1);

114 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/CAMP/DC'], 0);

115 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/CAMP/SINGLEENDED'], 0);

116 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/TAMP/0/CURRENTGAIN'], 1000);

117 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/TAMP/0/DC'], 1);

118 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/TAMP/0/VOLTAGEGAIN'], 10);

119 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/ZCTRLS/0/TAMP/0/OFFSET'], 0);

120 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/TAMP/1/CURRENTGAIN'], 1000);

121 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/TAMP/1/DC'], 1);

122 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/ZCTRLS/0/TAMP/1/VOLTAGEGAIN'], 1);

123 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/TAMP/1/OFFSET'], 0);

124 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/0/TAMP/EXTBIAS'], 0);

125 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/ZCTRLS/0/TAMP/BIASOUT'], 0.000153);

126 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/CAMP/R'], 0);

127 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/CAMP/GAIN'], 1);

128 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/CAMP/DC'], 0);

129 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/CAMP/SINGLEENDED'], 0);

130 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/TAMP/0/CURRENTGAIN'], 1000);

131 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/TAMP/0/DC'], 1);

132 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/TAMP/0/VOLTAGEGAIN'], 1);

133 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/ZCTRLS/1/TAMP/0/OFFSET'], 0);

134 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/TAMP/1/CURRENTGAIN'], 1000);

135 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/TAMP/1/DC'], 1);

136 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/ZCTRLS/1/TAMP/1/VOLTAGEGAIN'], 1);

137 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/TAMP/1/OFFSET'], 0);

138 ziDAQ('setInt', ['/' device '/ZCTRLS/1/TAMP/EXTBIAS'], 0);

139 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/ZCTRLS/1/TAMP/BIASOUT'], 0.000153);

140 pause(5);

141 ziDAQ('sync');

142

143 input('Inizializzazione completata. Premere INVIO per iniziare il test.');

144 fprintf('Attesa stabilizzazione temperatura.');

145 %Lettura effettuata prima del test

146 for cont=1:1:204

147 sample = ziDAQ('getSample', ['/' device '/demods/0/sample']);

148 r = abs(sample.x + j*sample.y);

149 fprintf('Ampiezza valore capacitivo %f V.', r);

150 sample = ziDAQ('getSample', ['/' device '/demods/3/sample']);

151 r = abs(sample.x + j*sample.y);

152 fprintf ('Ampiezza valore resistivo %f V.', r);

153 if mod(cont,12) = 0

160

154 fprintf ('Minuti rimanenti: %d.', 240/12-cont/12);

155 end

156 pause(5);

157 %Durata del riscaldamento 17 minuti

158 end

159

160 rcapiniziale=0;

161 rtmp25=0;

162 fprintf ('Calcolo valore medio...\n');

163 for cont=1:1:360

164 sample = ziDAQ('getSample', ['/' device '/demods/0/sample']);

165 rcapiniziale = rcapiniziale+abs(sample.x + j*sample.y);

166 sample = ziDAQ('getSample', ['/' device '/demods/3/sample']);

167 rtmp25 = rtmp25+abs(sample.x + j*sample.y);

168 if mod(cont,120) = 0

169 fprintf ('Minuti rimanenti: %d.', 360/120-cont/120);

170 end

171 pause(0.5);

172 %Durata: 3 minuti

173 end

174 rcapiniziale=rcapiniziale/360;

175 rtmp25=rtmp25/360;

176

177 fprintf ('Inizio analisi DNA. Aumento della temperatura in corso...\n');

178 step=(offset25-offset60)/360

179 for cont=1:1:359

180 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/0/OFFSET'], offset25-cont*step);

181 if mod(cont,60) = 0

182 fprintf ('Minuti rimanenti: %d.', 360/60-cont/60);

183 end

184 pause(1);

185 %Durata rampa termica 6 minuti

186 end

187 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/0/OFFSET'], offset60);

188

189 for cont=1:1:120

190 sample = ziDAQ('getSample', ['/' device '/demods/0/sample']);

191 r = abs(sample.x + j*sample.y);

192 fprintf('Ampiezza valore capacitivo %f V.', r);

193 sample = ziDAQ('getSample', ['/' device '/demods/3/sample']);

194 r = abs(sample.x + j*sample.y);

195 fprintf ('Ampiezza valore resistivo %f V.', r);

196 if mod(cont,12) = 0

197 fprintf ('Minuti rimanenti: %d.', 120/12-cont/12);

198 end

199 pause(5);

200 %Durata riscaldamento 10 minuti

201 end

202

161

203 fprintf ('Denaturazione DNA avviata, attesa...\n');

204 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/0/ADD'], 1);

205 for cont in range(1,6):

206 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/2/OFFSET'], cont*0.5);

207 pause(5);

208 %Durata 30s

209 end

210 for cont=1:1:60

211 sample = ziDAQ('getSample', ['/' device '/demods/0/sample']);

212 r = abs(sample.x + j*sample.y);

213 fprintf('Ampiezza valore capacitivo %f V.', r);

214 sample = ziDAQ('getSample', ['/' device '/demods/3/sample']);

215 r = abs(sample.x + j*sample.y);

216 fprintf ('Ampiezza valore resistivo %f V.', r);

217 if mod(cont,12) = 0

218 fprintf ('Minuti rimanenti: %d.', 60/12-cont/12);

219 end

220 pause(5);

221 %Durata attesa denaturazione 5 minuti

222 end

223

224 fprintf ('Inizio ibridazione...\n');

225 step=(offset60-offset25)/360;

226 for cont=1:1:359

227 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/0/OFFSET'], offset60-cont*step);

228 if mod(cont,12) = 0

229 fprintf ('Minuti rimanenti: %d.', 360/12-cont/12);

230 end

231 pause(5);

232 %Durata attesa ibridazione 30 minuti, rampa decrescente

233 end

234 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/0/OFFSET'], offset25);

235 pause(5);

236

237 fprintf ('Eliminazione molecole non complementari...\n');

238 for cont=1:1:12

239 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/2/OFFSET'], 0.3+cont*0.05);

240 pause(5);

241 %Durata 1 minuto, attivazione bias

242 end

243 for cont=1:1:5

244 fprintf ('Minuti rimanenti: %d.\n', 5-cont);

245 pause(60);

246 %Durata 5 minuti

247 end

248 for cont=1:1:6

249 ziDAQ('setDouble', ['/' device '/AUXOUTS/2/OFFSET'], -0.3+cont*0.05);

250 pause(60);

251 %Durata 30s, eliminazione bias

162

252 end

253 ziDAQ('setInt', ['/' device '/SIGOUTS/0/ADD'], 0);

254

255 fprintf ('Stabilizzazione termica in corso...\n');

256 for cont=1:1:12

257 fprintf ('Minuti rimanenti: %d.', 12-cont);

258 pause(60);

259 %Durata 12 minuti

260 end

261

262 tentativo=0;

263 while 1

264 tentativo=tentativo+1

265 rcap=0;

266 rtmp=0;

267 fprintf ('Lettura valore medio...\n');

268 for cont=1:1:240

269 sample = ziDAQ('getSample', ['/' device '/demods/0/sample']);

270 rcap = rcap+abs(sample.x + j*sample.y);

271 sample = ziDAQ('getSample', ['/' device '/demods/3/sample']);

272 rtmp = rtmp+abs(sample.x + j*sample.y);

273 pause(0.5);

274 %Durata 2 minuti

275 end

276 rcap=rcap/240;

277 rtmp=rtmp/240;

278 if (abs(rtmp25-rtmp)/rtmp25)*1000000 < sogliatermicappm || tentativo==5

279 break

280 else

281 fprintf ('Attesa raggiungimento stabilità termica...\n');

282 end

283 end

284

285 fprintf('Variazione individuata %f ppm. Soglia di detezione %f ppm.\n',

(abs(rcapiniziale-rcap)/rcapiniziale)*1000000, sogliadetezioneppm);→

286 if (abs(rcapiniziale-r)/rcapiniziale)*1000000 > sogliadetezioneppm

287 fprintf ('Esito test positivo!\n');

288 else

289 fprintf ('Esito test negativo!\n');

290 end

291 %Durata complessiva test: circa 90 minuti

163

Bibliograa

[1] EPCOS AG. Datasheet EPCOS NTC B57861. 2015. url: https://en.tdk.eu/

inf/50/db/ntc_13/NTC_Mini_sensors_S861.pdf.

[2] Zurich Instruments AG. Manuale utente Zurich Instruments HF2LI. 2017. url:

https : / / www . zhinst . com / sites / default / files / ziHF2 _ UserManual _

LabOne_42300_0.pdf.

[3] L. Bandieraa et al. A fully electronic sensor for the measurement of cDNA hy-

bridization kinetics. In: Biosensors and Bioelectronics 22.9-10 (2007), pp. 2108

2114.

[4] A.J. Bard e L.R. Faulkner. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applica-

tions, 2nd Edition. John Wiley & Sons, 2001.

[5] H. Bordelon et al. A Magnetic Bead-Based Method for Concentrating DNA from

Human Urine for Downstream Detection. In: PLOS ONE 8.7 (2013), pp. 19.

[6] M. Carminati et al. Note: Dierential congurations for the mitigation of slow

uctuations limiting the resolution of digital lock-in ampliers. In: Review of

Scientic Instruments 87.2 (2016), p. 026102.

[7] S. Carrara. Bio/CMOS Interfaces and Co-Design. Springer, 2013. url: https:

//link.springer.com/book/10.1007/978-1-4614-4690-3.

[8] S. Carrara et al. Label-free cancer markers detection by capacitance biochip.

In: Sensors and Actuators B: Chemical 136.1 (2009), pp. 163172.

[9] S. Carrara et al. Nanoscale lm structure related to capacitive eects in ethylene-

glycol monolayers. In: Surface Science 603.13 (2009), pp. L75L77.

164

[10] Dow Corning Corporation. Datasheet Sylgard 184 Silicone Elastomer. 2014. url:

http://www.dowcorning.com/DataFiles/090276fe80190b08.pdf.

[11] A. Cuervo et al. Direct measurement of the dielectric polarization properties

of DNA. In: Proceedings of the National Academy of Sciences 111.35 (2014),

E3624E3630. url: http://www.pnas.org/content/111/35/E3624.abstract.

[12] Z. Gao et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. In:

Analytical Chemistry 79.9 (2007), pp. 32913297.

[13] L. Garibyan e N. Avashia. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain

Reaction (PCR). In: J Invest Dermatol 133.3 (2014), e6. url: https://www.

ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4102308/.

[14] FEMTOMesstechnik GmbH. Datasheet FEMTO DHPCA-100. 2013. url: http:

//www.femto.de/images/pdf-dokumente/de-dhpca-100_r11.pdf.

[15] Merck Performance Materials GmbH. Datasheet AZ 100 Remover. url: http:

//microchemicals.com/micro/az_100_remover.pdf.

[16] Merck Performance Materials GmbH. Datasheet AZ 5214E Photoresist. url:

http://www.microchemicals.com/micro/az_5214e.pdf.

[17] Merck Performance Materials GmbH. Datasheet AZ MIF Developer. url: http:

//www.microchemicals.com/micro/az_mif_developer.pdf.

[18] R.M. Harman et al. A Comparative Study on the In Vitro Eects of the DNA

Methyltransferase Inhibitor 5-Azacytidine (5-AzaC) in Breast/Mammary Cancer

of Dierent Mammalian Species. In: Journal of Mammary Gland Biology and

Neoplasia 21.1 (2016), pp. 5166.

[19] R. Igreja e C.J. Dias. Analytical evaluation of the interdigital electrodes ca-

pacitance for a multi-layered structure. In: Sensors and Actuators A: Physical

112.2-3 (2004), pp. 291301. url: http://www.sciencedirect.com/science/

article/pii/S0924424704000779.

[20] World Precision Instruments Inc.Manuale World Precision Instruments AL1000.

2010. url: http://www.wpi- europe.com/downloads/content/Aladdin-

IM.pdf.

165

[21] W. Jung. Op Amp Applications Handbook. Newnes - Elsevier, 2005. url: http://

www.analog.com/en/education/education-library/op-amp-applications-

handbook.html.

[22] N. Karachaliou et al. Real-time liquid biopsies become a reality in cancer treat-

ment. In: Annals of Translational Medicine 3.3 (2015), p. 36.

[23] S.H. Kilgore e D.K. Schroder. Electromigration Reliability of Electroplated Gold

Interconnects. In: MRS Proceedings 1692 (2014).

[24] M. Labib et al. Three-Mode Electrochemical Sensing of Ultralow MicroRNA

Levels. In: Journal of the American Chemical Society 135.8 (2013), pp. 3027

3038.

[25] Inc Laird Technologies. Datasheet Laird Technologies CP08-31-06. 2016. url:

https://assets.lairdtech.com/home/brandworld/files/Laird-ETS-CP-

Series-CP08-31-06-Data-Sheet.pdf.

[26] L. Liu et al. Highly sensitive and label-free electrochemical detection of mi-

croRNAs based on triple signal amplication of multifunctional gold nanoparti-

cles, enzymes and redox-cycling reaction. In: Biosensors and Bioelectronics 53

(2014), pp. 399405.

[27] J. Christopher Love et al. Self-Assembled Monolayers of Thiolates on Metals as

a Form of Nanotechnology. In: Chemical Reviews 105.4 (2005), pp. 11031170.

url: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr0300789.

[28] C.G. Malmberg e A.A. Maryott. Dielectric Constant of Water from 0 °C to 100

°C. In: Journal of Research of the National Bureau of Standards 56.1 (1956).

[29] J.E. Mark. Polymer Data Handbook. Oxford University Press, 2009.

[30] E. Mateo-Martí e C.M. Pradier. A Novel Type of Nucleic Acid-based Biosensors:

the Use of PNA Probes, Associated with Surface Science and Electrochemical

Detection Techniques. In: Intelligent and Biosensors. A cura di V.S. Somerset.

InTech, 2004. Cap. 16.

[31] MicroChem. Datasheet SU8-2000. url: http://www.microchem.com/pdf/SU-

82000DataSheet2025thru2075Ver4.pdf.

166

[32] P. Paulasova e F. Pellestor. The peptide nucleic acids (PNAs): a new generation

of probes for genetic and cytogenetic analyses. In: Annales de genetique 47.4

(2004), pp. 349358.

[33] Imabayashi S. et al. Reductive desorption of carboxylic-acid-terminated al-

kanethiol monolayers from Au(111) surfaces. In: Journal of Electroanalytical

Chemistry 428.1 (1997), pp. 3338.

[34] E.K. Sackmann, A.L. Fulton e D.J. Beebe. The present and future role of

microuidics in biomedical research. In: Nature 507.7491 (2014), pp. 1819.

[35] C. Scarcella. Temperature control for Biomedical Applications. Rapp. tecn. Poli-

tecnico di Milano, Dipartimento di Elettronica e Informazione, nov. 2012.

[36] J.H. Scoeld. Frequency-domain description of a lock-in amplier. In: Ameri-

can Journal of Physics 62.2 (1994), pp. 129133.

[37] R.A. Serway e J.R. Gordon. Principles of Physics. v. 2. Saunders College Pub.,

1998, p. 602.

[38] J.L. Shepherd et al. Selective Reductive Desorption of a SAM-Coated Gold

Electrode Revealed Using Fluorescence Microscopy. In: Journal of the American

Chemical Society 126.26 (2004), pp. 83298335.

[39] C. Stagni et al. A Fully Electronic Label-Free DNA Sensor Chip. In: IEEE

Sensors Journal 7.4 (2007), pp. 577585.

[40] C. Stagni et al. CMOS DNA Sensor Array With Integrated A/D Conversion

Based on Label-Free Capacitance Measurement. In: IEEE Journal of Solid-State

Circuits 41.12 (2006), pp. 29562964.

[41] MicroChemicals GmbH Ulm. Datasheet TI Prime Adhesion Promoter. 2002. url:

http://www.microchemicals.com/micro/ti_prime.pdf.

[42] N.N. Watkins et al. Microuidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters

for point-of-care HIV diagnostics using whole blood. In: Science translational

medicine 5.214 (2013), 214ra170.

[43] Inc Wavelength Electronics. Datasheet Wavelength HTC3000. 2011. url: http:

//www.teamwavelength.com/downloads/datasheets/htcseries.pdf.

167

[44] W. Xing e J. Cheng. Biochips: Technology and Applications. Springer Science &

Business Media, 2013.

[45] P. Yager et al. Microuidic diagnostic technologies for global public health. In:

Nature 442.7101 (2006), pp. 412418.

[46] H. Yang et al. Direct, Electronic MicroRNA Detection for the Rapid Determi-

nation of Dierential Expression Proles. In: Angewandte Chemie International

Edition 48.45 (2009), pp. 84618464.

[47] H. Yin et al. An electrochemical signal 'o-on' sensing platform for microRNA

detection. In: Analyst 137.6 (2012), pp. 13891395. url: https://www.ncbi.

nlm.nih.gov/pubmed/22311172.

[48] R.M. Zadegan e M.L. Norton. Structural DNA Nanotechnology: From Design

to Applications. In: International Journal of Molecular Sciences 13.6 (2012),

pp. 71497162. url: https : / / www . ncbi . nlm . nih . gov / pmc / articles /

PMC3397516/.

[49] G. Zhang et al. Label-free direct detection of MiRNAs with silicon nanowire

biosensors. In: Biosensors and Bioelectronics 24.8 (2009), pp. 25042508.

[50] V.P. Zhdanov. Conditions of appreciable inuence of microRNA on a large

number of target mRNAs. In: Molecular bioSystems 5.6 (2009), pp. 63843.

[51] J.G. Ziegler e N.B. Nichols. Optimum Settings for Automatic Controllers. In:

ASME, Journal of Dynamic Systems, Measurement, and Control 115.2B (1993),

pp. 220222.

168