Poliomavirus umani

Famiglia Polyomaviridae comprende il solo genere

POLIOMAVIRUS (BK, JC, SV40)

La famiglia Papovaviridae non esiste più!

� 40-60 nm (45 nm in media) di diametro

� Capside icosaedrico

� Privi di envelope

� Genoma a DNA circolare a doppio filamento associato a

istoni cellulari in grado di codificare proteine precoci e tardive

� Replicazione nucleare

Antonella Caputo

Microscopia

elettronica:

Minicromosomi di

SV40

Rappresentazione grafica al

computer del caspide

icosaedrico di SV40

Microscopia elettronica:

Capsidi icosaedrici di BKV

Antonella Caputo

Principali poliomavirus

• SV40 (scimmia)

• BK, JC, KI, WU, Merckel (uomo)

• Poliomavirus murino

Il genoma virale

• Il genoma contiene regioni precoci e tardive

• La regione precoce codifica proteine necessarie alla replicazione

• La regione tardiva codifica proteine strutturali

• 6 geni in 5 kbp (utilizzo di entrambi i filamenti e geni overlappanti)

• La regione precoce è su un filamento, la tardiva sull’altra

Poliomavirus

umani

BKV

Antonella Caputo

BKV e JCV

Isolati dalle urine (BKV e JCV) o tessuto cerebrale (JCV) in pazienti con

deficit immunitari:

sindrome di Wiskott-Aldrich

terapie farmacologiche

malattie croniche intercorrenti (PML, neoplasie)

AIDS

Virus ubiquitari nella popolazione umana:

� Sieroprevalenza JCV

- 5-40% della popolazione adulta normale

- 70-85% [pazienti con leucoencefalopatia multifocale progressiva

(PML)]

� Sieroprevalenza BKV

- 80% della popolazione adulta

L’infezione si contrae nella prima infanzia (Infezioni latenti)

Identificati in linfociti, rene, cervello e CSF (JCV), cuore, milza, polmoni,

fegatoAntonella Caputo

Colorazione negativa

BKV nelle urine ultracentrifugate

Microscopia elettronica

JCV nel nucleo di oligodendrociti

di un paziente con PML

Antonella Caputo

Ciclo replicativo

• Il ciclo è strettamente

dipendente dalla

cellula

• Nelle cellule non

permissive sono

espressi solo i

trascritti precoci:

trasformazione

Origine di replicazione e promotori

Antonella Caputo

• T Ag di BKV, JCV ed SV40: 80% omologia di sequenza e

cross-reagiscono

• 97 kD

• Localizzazione nucleare (95%) (libero, associato al DNA

cellulare, in membrana)

• Modificazioni post-traduzionali (es. fosforilazione,

acilazione, glicosilazione, adenilazione etc.)

Antigene T (trasformazione)

immunofluorescenza

Antonella Caputo

Funzioni dell’antigene T

E’ necessario per il ciclo litico e la

trasformazione cellulare:

E’ una DNA-binding protein

Presenta Attività DNA-elicasica,

ATPasica

Omologia con il dominio J della famiglia

proteica DnaJ (Hsp40) (molecular

chaperons)

Forma complessi con proteine

importanti per la replicazione virale (es.

DNA-primasi, topoisomerasi I)

Forma complessi con proteine che

regolano il ciclo cellulare [es. p53, Rb,

p300 e p400 (CBP)]

Forma complessi con fattori

trascrizionali (TBP, TFIIA)

Modula espressione promotori cellulari

Antigene t piccolo

• 19 kD

• Localizzazione nucleare e citoplasmatica

• Potenzia l’azione dell’antigene T:

aumenta l’efficienza della trasformazione dell’antigene T

lega e inibisce PP2A (che inibisce cdk)

Agnoproteina

• 17 kD

• Necessaria per l’assemblaggio (trasporta VP1 al nucleo)

Antonella Caputo

BKV e JCV

Tropismo cellulare

- Recettore: glicoproteine O-linked (BKV) e N-linked (JCV)

- Regione regolatrice promotore-enhancers (ceppo dipendente)

promotore di JCV :

TATA box, siti di legame per Sp1, AP-1, or c-jun/c-fos,

YB1, pura, NF-1

Antonella Caputo

Ciclo litico in cellule permissive:

BKV

� umane renali embrionali, cerebrali, fibroblasti, linfociti, e di scimmia

� T Ag compare dopo 24 ore

� elevata progenie virale dopo qualche giorno (effetto citopatico e lisi

cellulare)

JCV

� umane cerebrali fetali embrionali (astrociti, neuroni,

precursori), linee di neuroblastoma, linfociti, precursori ematopoietici,

cellule renali, cellule stromali delle tonsille e di scimmia

� T Ag compare dopo 48 ore

� scarsa progenie virale dopo qualche settimana

� solo poche cellule replicano DNA e producono virioni

(assenza di vero effetto citopatico e di lisi cellulare)

� trasmissione cellula-cellula

Antonella Caputo

Ciclo replicativo in cellule permissive

Infezione di BK virus in HEK (human

embryonic kidney cells): nuclei

picnotici, allungamento del citoplasma,

rigonfiamento cellualare

Infezione di JC virus in HFB (human

fetal brain) principalemente astrociti

rigonfiamento cellulare, e diminuzione

del citopalsma

Antonella Caputo

Meccanismo di diffusione dei poliomavirus nell’organismo

JCV/BKVMoltiplicazione

nel tratto

respiratorio

Moltiplicazione

a livello renale

Deficit immunitario

Riattivazione

SNC

Viruria e

possibile

cistite

emorragica

Ingresso nel tratto

respiratorio

Viremia

primaria

Risposta

immuneSeconda

viremia

transitoria

Immunocompetente

Virus latenti

indefinitamente nel

rene (linfociti)

DNA episomiale

[meccanismi ??]

JCV viremia

PML: leucoencefalopatia multifocale progressiva

Riattivazione di

BKV nel tratto

urinario

Lieve sintomatologia o

Infezioni silenti

Poliomavirus umani e malattie

ad essi associate in individui

immunocompromessi

VIRUS MALATTIA

– BKV nefropatia, cistite

emorragica, polmoniti, encefaliti

– JCV leucoencefalopatia multifocale

progressiva

- BKV, JCV Tumori?

Antonella Caputo

Leucoencefalopatia multifocale progressiva

� Riattivazione JCV e infezione virale nel cervello

�Malattia subacuta demielinizzante

� Lesioni multifocali a placche (oligodendrociti, astrociti, macrofagi)

tra materia grigia e bianca

� Aspettative di vita: qualche mese-1 anno (dipende dallo stato del sistema

immunitario)

� Può svilupparsi a qualunque età

� I pazienti presentano svariati sintomi neurologici che vanno dalla

compromissione della parola, della vista, della coordinazione, delle facoltà

mentali

Antonella Caputo

Leucoencefalopatia multifocale

progressiva

Istopatologia di una lesione

demielinizzante nel cervello di un

paziente con PML

Colorazione (Luxol fast blue stain) della

materia bianca che dimostra le placche di

demielinizzazione

Immagine di risonanza magnetica

lesioni cerebrali PML

JCV e AIDS

Alta incidenza di PML in pazienti con AIDS:

80% PML in pazienti con AIDS è associata a JCV

1-3% diagnosi AIDS si basa sulla comparsa di PML

Deficienza risposta immune anti-JCV?

Interazione tra JCV e HIV-1?

JCV TAg transattiva LTR di HIV

HIV-1 Tat transattiva promotore tardivo di JCV

Co-infezione di HIV-1 e JCV in vitro

Diagnosi

JCV (PML)

Clinica

Ibridazione in situ

PCR (biopsie, CSF)

BKV

PCR

Ricerca anticorpi (boost da riattivazione)

Antonella Caputo

BKV e JCV

Trasfomazione cellulare e oncogenesi

Antonella Caputo

Ciclo “abortivo” in cellule semipermissive/non

permissive

→ Trasformazione cellulare

� Blocco trascrizione mRNA precoci (specificità cellulare)

� Restrizione di replicazione del DNA virale: DNA

polimerasi cellulare non lega antigene T) (specie-specificità)

Antonella Caputo

La cellula trasformata possiede due caratteristiche

principali:

� Capacità di moltiplicarsi illimitatamente in coltura

(immortalizzazione)

�Causare tumore in animale da esperimento

singenico o immunodepresso

Antonella Caputo

La proliferazione cellulare è normalmente

controllata da fattori inducenti o inibenti denominati

rispettivamente:

Oncogeni

Promuovono la proliferazione, sopravvivenza, crescita e

differenziamento cellulare (es. fattori di crescita, recettori per

fattori di crescita, messaggeri secondari, fattori di trascrizione,

inibitori dell’apoptosi)

Geni oncosoppressori

Controllano negativamente la proliferazione cellulare (es. p53 e

Rb) promuovendo in molti casi l’apoptosi

Antonella Caputo

Le proteine virali devono promuovere uno stato

proliferativo della cellula per permettere la sintesi degli

acidi nucleici e la replicazione virali

Per fare ciò utilizzano diverse strategie:

Disregolazione ciclo cellulare

Inibizione apoptosi cellulare

Interferenza con risposta immunitaria

In questo modo un virus può inavvertitamente iniziare il

processo di trasformazione cellulare

Antonella Caputo

Evidenze sperimentali

� Trasformazione di cellule semi permissive e non

permissive:

� DNA integrato stabilmente nel DNA cellulare

� Oligomeri, integrazioni a tandem e DNA episomiale

�Espressione antigeni T e t

� Regione precoce integra necessaria per la trasformazione

� Cooperazione con c-rasA

� Inoculazione endovenosa o intracerebrale (virus o DNA) induce tumori

(80%) (sia in animali immunocompetenti che immunodepressi)

� ependimomi, papillomi dei plessi corioidei

� carcinomi delle isole pancreatiche

� osteosarcomi

� linfomi, carcinomi renali (negli animali immunodepressi)

� DNA integrato stabilmente, espressione T, t

� Topi transgenici BKV sviluppano tumori (principalmente renali)

Antonella Caputo

BKV e oncogenesi

JCV e oncogenesi

Evidenze sperimentali� Trasformazione maligna di cellule di roditore

� DNA integrato casualmente nel DNA cellulare

� espressione antigeni T e t

� Inoculazione intracerebrale e sottocutanea nel criceto induce:

� medulloblastomi, glioblastomi, pineocitomi

� Inoculazione intracerebrale nelle scimmie (New World owl, squirrel monkeys)

induce con una frequenza del 50% (no BKV o SV40):

� glioblastoma multiforme e astrocitoma maligno e metastasi

� linee derivate dai tumori contengono:

DNA di JCV integrato e episomiale

espressione T, t

complessi T-p53

infezione persistente

� Topi transgenici:

astrocitomi (rari)

ipomielinizzazione (T interagisce con MEF-1/pura e riduce espressione di

mielina)

tumori primitivi neuro-ectodermici (T-p53, T-Rb) Antonella Caputo

Evidenze sperimentali

Immortalizzano cellule umane:

� Regione precoce integra

� Espressione di T Ag

� Cambiamenti cromosomici durante l’infezione

� Alta incidenza di mutazioni in linee cellulari

� Danni cromosomici in fibroblasti umani (traslocazioni, cromosomi

multicentrici)

BKV e JCV oncogenesi

Antonella Caputo

Evidenze cliniche

DNA e T-Ag di BKV e JCV in tumori umani:

BKV (cerebrali, osteosarcomi e meningiomi, insulinomi)

(varianti virali, hit-run)

JCV (astrocitomi, leucemie, linfomi e tumori del colon)

Complessi p53-BKV T-Ag nel citoplasma neuroblastomi

BKV e JCV e oncogenesi

Antonella Caputo

DNA di JCV in aspirato di midollo

osseo di un paziente con PML –

ibridazione in situ

T-Ag di BKV in cellule derivate da

glioma umano

Antonella Caputo

SV40 e tumori umani

� Introdotto nella popolazione con vaccini anti-polio

contaminati

� Tumorigenico nei roditori

� Trasforma cellule umane in colture

� DNA e T-Ag evidenziati in tumori umani:

osteosarcomi, mesosteliomi, ependimoni e papillomi dei

plessi corioidei, tumori della tiroide, linfomi

� Induce loop autocrino-paracrino (es.HGF/MET in cellule

mesoteliali trasformate)

� DNA e complessi T-Ag e p53 o Rb in mesoteliomi umaniAntonella Caputo

Simian virus 40 è presente nella maggior

parte dei mesoteliomi umani

Ibridazione dei prodotti di PCR ottenuti da mesoteliomi

Antonella Caputo

SV40 e trasformazione

cellulare

Antonella Caputo

SV40 e patogenesi

dei mesoteliomi

Antonella Caputo

Merkel cell poliomavirus (MCV)

Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma.

Feng H, Shuda M, Chang Y, Moore PS. Science 2008

Molecular Virology Program, University of Pittsburgh Cancer Institute, University of Pittsburgh, 5117 Centre Avenue, Suite 1.8, Pittsburgh, PA 15213, USA.

Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare but aggressive human skin cancer that typically affects elderly and immunosuppressed individuals, a feature suggestive of an infectious origin. We studied MCC samples by digital transcriptome subtraction and detected a fusion transcript between a previously undescribed virus T antigen and a human receptor tyrosine phosphatase. Further investigation led to identification and sequence analysis of the 5387-base-pair genome of a previously unknown polyomavirus that we call Merkel cell polyomavirus (MCV or MCPyV).

MCV sequences were detected in 8 of 10 (80%) MCC tumors but only 5 of 59 (8%) control tissues from various body sites and 4 of 25 (16%) control skin tissues. In six of eight MCV-positive MCCs, viral DNA was integrated within the tumor genome in a clonal pattern, suggesting that MCV infection and integration preceded clonal expansion of the tumor cells. Thus, MCV may be a contributing factor in the pathogenesis of MCC.

Le evidenze sperimentali e molecolari suggeriscono che

i poliomavirus BK, JC ed SV40 possano essere agenti

favorenti l’insorgenza dei tumori.

Conclusioni

Antonella Caputo