pH10pH10pH3pH3

Parma , 8 Novembre 2001

step1step1

proteine acideproteine acide

proteine proteine basichebasiche

++

anodanodoo

3500 V

La prima dimensione : Isoelectric La prima dimensione : Isoelectric focusing (IEF)focusing (IEF)

v=Ev=E··zz··ff-1-1 v = velocità di migrazione della proteina in un campo elettricoE = forza del campo elettricoz = carica netta della proteinaf = coefficiente frizionale = 6r = viscosità del mezzo

pI, punto isoelettrico pI, punto isoelettrico Z= Z=Ø Ø v= v= ØØ

--

catodcatodoo

Sample preparationFirst dimensionSecond dimensionDetectionImage AnalysisMALDI-TOF MSESI MS/MS

Tot 76 kVhTot 76 kVh

-- step2step2 ++

--step3step3 ++ ++

La I° dimensione : IPG stripsLa I° dimensione : IPG strips

Una Una I° dimensioneI° dimensione eccellente assicura che gli spots eccellente assicura che gli spots (peptidi) siano ben separati (= risolti) nella (peptidi) siano ben separati (= risolti) nella II° II° dimensionedimensione, anche quando una grande quantità di , anche quando una grande quantità di proteine viene analizzataproteine viene analizzata

Perché la I° dimensione è così Perché la I° dimensione è così importante nella 2-DE ?importante nella 2-DE ?

I° dimensione : l’importanzaI° dimensione : l’importanza Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001

Sample preparationFirst First dimensiondimensionSecond dimensionDetectionImage AnalysisMS analysis

IImmobilized mmobilized PPH H GGradient radient stripstrip = =

IPG stripIPG strip

Perché le IPG strips sono così importanti nella Perché le IPG strips sono così importanti nella I° dimensione ?I° dimensione ?1.1. il il gradiente di pH immobilizzatogradiente di pH immobilizzato è stabile ed evita il è stabile ed evita il fenomento della “catodic drift” ;fenomento della “catodic drift” ;

2.2. se sono noti i valori di pI delle proteine d’interesse, se sono noti i valori di pI delle proteine d’interesse, l’intervallo di separazione IEF viene ristretto e ne l’intervallo di separazione IEF viene ristretto e ne consegue un’consegue un’analisi estremamente mirataanalisi estremamente mirata (> (>accuratezzaaccuratezza e e precisioneprecisione) ;) ;

3.3. elevata elevata risoluzione proteicarisoluzione proteica ; ;

4.4. alta alta riproducibilitàriproducibilità dei risultati ; dei risultati ;

5.5. le proteine estremamente acide o basiche sono più le proteine estremamente acide o basiche sono più facilmente separabili ;facilmente separabili ;

6.6. IPG buffersIPG buffers con stesso intervallo di pH delle IPG strips con stesso intervallo di pH delle IPG strips sono disponibili e il loro utilizzo fa notevolmente ridurre sono disponibili e il loro utilizzo fa notevolmente ridurre o elimina il background nella colorazione del gel ….o elimina il background nella colorazione del gel ….

La seconda dimensione : 2D SDS-La seconda dimensione : 2D SDS-PAGEPAGENella II° dimensione in condizioni denaturanti

(“elettroforesi monodimensionale SDS-PAGE”) le proteine sono separate in un gel di poliacrilamide in base alla loro massa molecolare (MM)

HH33C-(CHC-(CH22))1010-CH-CH22OSOOSO33--NaNa++

Sodio dodecil solfato (SDS)Sodio dodecil solfato (SDS)

= detergente anionico = detergente anionico che spezza tutte le che spezza tutte le interazioni non covalenti interazioni non covalenti delle proteine nativedelle proteine native++

Mercaptoetanolo e Mercaptoetanolo e ditiotreitoloditiotreitolo

= riducono i ponti = riducono i ponti disolfurodisolfuro

Sottoposte ad un C.E. le proteine migrano dal Sottoposte ad un C.E. le proteine migrano dal catodocatodo- - all’anodoall’anodo++ in base alla loro MM in base alla loro MM

I° dimensione : l’importanzaI° dimensione : l’importanza Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001

La miscela proteica è sottoposta a :La miscela proteica è sottoposta a :1.1.

I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa negativa MM proteica MM proteica

3.3.

Gli anioni dell’SDS si legano alle catene principali in un Gli anioni dell’SDS si legano alle catene principali in un rapporto di :rapporto di :

~ 1 molecola SDS • 2 residui di amminoacidi~ 1 molecola SDS • 2 residui di amminoacidi

2.2.

La seconda dimensione : 2D SDS-La seconda dimensione : 2D SDS-PAGEPAGE - CATODO

+ ANODO

45 mA45 mA

-- ++

IPG strip

Gel di poliacrilamide

tGiorno Giorno 1116.00 13.0

0 Equilibrazione

9.30Giorno Giorno 22

Reidratazione o.n.

SeparazioSeparazione IEFne IEF

12.00

Giorno Giorno 33

Preparazione 2°dimensione

Equilibrazione

Preparazione 2° dimensione (GELS)

17.00

Separazione Separazione 2D-PAGE2D-PAGE

16.00

Preparazione 2° dimensione

Giorno Giorno 44

Giorno Giorno 55

Fissazione e colorazione

Sistemi di analisi 2DE - strumentiSistemi di analisi 2DE - strumenti

Multiphor II Multiphor II (APB)(APB)

I° DIMENSIONE (IEF)I° DIMENSIONE (IEF) : :

12 IPG strips 12 IPG strips / corsa/ corsa

II° DIMENSIONE (2D-PAGE)II° DIMENSIONE (2D-PAGE) : :

Hoefer DALT Hoefer DALT unit (APB)unit (APB)

10 gels / 15-20 10 gels / 15-20 oreore

Ettan DALT II Ettan DALT II System (APB)System (APB)

12 12 gels / gels / 4-6 4-6 oreore

IPG Phor (APB)IPG Phor (APB)

12 IPG 12 IPG strips / strips / corsacorsa

Analisi 2DE : le apparecchiatureAnalisi 2DE : le apparecchiature Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001

VantaVantaggiggi Grande capacità di separazione e risoluzione di Grande capacità di separazione e risoluzione di miscele proteiche (2.000–3.000 proteine)miscele proteiche (2.000–3.000 proteine) Riproducibiltà e affidabilità dei risultatiRiproducibiltà e affidabilità dei risultati Possibilità di confronto dei dati tra laboratori differentiPossibilità di confronto dei dati tra laboratori differenti Capacità di rilevazione di modificazioni post-Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle proteine traduzionali delle proteine

fosforilazionefosforilazione

glicosilazione, glicosilazione,

tagli proteolitici, tagli proteolitici, Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di riferimento disponibili in reteriferimento disponibili in rete Identificazione MIRATA di uno specifico pattern Identificazione MIRATA di uno specifico pattern proteico cellulareproteico cellulare

2DE2DEVantaVantaggi ggi SvantSvantaggiaggi

2DE : vantaggi vs svantaggi2DE : vantaggi vs svantaggi

Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001Vantaggi vs vantaggiVantaggi vs vantaggi

2DE2DEVantaVantaggi ggi SvantSvantaggiaggi

SvantaggiSvantaggi metodica lungametodica lunga

molto dispendiosa in termini di : tempo, costo, molto dispendiosa in termini di : tempo, costo, fatica fisicafatica fisica

bassa capacità di risoluzione delle bassa capacità di risoluzione delle proteine proteine idrofobicheidrofobiche

difficile separazione delle difficile separazione delle proteine molto acide o proteine molto acide o basichebasiche

scarsa risoluzione di proteine con scarsa risoluzione di proteine con MM > 150 kDaMM > 150 kDa

bassa risoluzione delle bassa risoluzione delle proteine poco proteine poco rappresentativerappresentative nel campione proteico nel campione proteico

mancanza di linearità o sensibilità tra mancanza di linearità o sensibilità tra abbondanza della proteina nel campione proteico abbondanza della proteina nel campione proteico e capacità di risoluzione tramite colorazione sul e capacità di risoluzione tramite colorazione sul gelgel Parma , 8 Novembre 2001Parma , 8 Novembre 2001

2DE : vantaggi vs svantaggi2DE : vantaggi vs svantaggi

Vantaggi vs SvantaggiVantaggi vs Svantaggi