Non solo danni: l'ozono come strumento prezioso per lo studiodelle risposte agli stress nelle piante

R. Bernardi, M. Durante, L. Guidi,G. Lorenzini, C. Nali, S. Pasqualini, C. Pugliesi,

A. Ranieri, A. Saviozzi, L. Sebastiani, M. Badiani

Rete Informativa su Ozono e Vegetazione

Ozono e vegetazione: il contributo della ricerca italiana24 Novembre 2006

Centro Interdipartimentale Ricerche Agro-Ambientali "Enrico Avanzi"San Piero a Grado, Pisa

La Bel-W3 e la Bel-B di tabacco

(da Lorenzini, 1999)

Perché “non solo danni”?

Perché il danno visibile non è sempre correlato all’effetto biologico globale

Perché danno visibile ed “effetti subliminali” (sensu Lorenzini) mostrano spesso percorsi molecolari distinti

Perché l’ozono evoca risposte di difesa comuni anche ad altri fattori di stress, biotici ed abiotici

(da Buchanan, Gruissem e Jones, 2001)

(Zhang e Klessig, TIPS, 6, 520-527, 2001)

Risposte molecolari di difesa dall’ozono

Fitoalessine & fenilpropanoidi

Barriere fisiche

(lignina, estensine, callosio)

Proteine PR

Ormoni & molecole segnale

(ET, SA, JA)

Sistemi antiossidanti

Flussi di Ca

Morte cellulare programmata (HR/PCD)

L’ozono come strumento preciso, riproducibile, potente ma finemente modulabile da impiegare come elicitore

abiotico di risposte di difesa

MIUR-PRIN 1998, 2000, 2002, 2003, 2005

UniPG

UniPI

SSSUPUniMRC

S. Pasqualini & Coll.

L. GuidiA. RanieriA. Saviozzi+ Coll.

L. Sebastiani & Coll.

R. BernardiM. DuranteC. Pugliesi+ Coll.

UR-UniMRC, PRIN 2003 & 2005

Uso di linee di pomodoro mutanti o transgeniche per uno o più componenti coinvolti nei networks di elicitazione e difesa

UniPI – G. Lorenzini & Coll

Trattamenti & patologia

UniTuscia – G.P. Soressi, M. Ciaffi & Coll

Materiale vegetale

Supervisione bioinformatica & geneticaUniPG– S. Pasqualini & Coll

Ormoni (SA, JA)SSSUP – L. Sebastiani & Coll

ROS (H2O2) & NOS (NO)UniMRC – M. Badiani & Coll

ET, antiox, espressione

genica, ROS (.O2-), morte

cellulare (Evans’ Blue), HCN

PRIN-MIUR 2003-2005

Meccanismi molecolari coinvolti nella risposta delle piante all’ozono e ad altri stress abiotici

Obbiettivi:

caratterizzare le risposte allo stress da ozono e/o altri stress;

seguire l’induzione di stress ossidativo extra- ed intracellulare;

determinarne gli effetti specifici nei vari compartimenti cellulari;

caratterizzare i trasduttori di segnali;

studiare l’espressione di geni coinvolti nelle risposte ai vari livelli.

Cofinanziamento totale

203.800 Euro

Pathway di trasduzione del segnale nella risposta delle piante all'ozono: ruolo dell'acido jasmonico e del processo di morte celulare programmata

Meccanismi molecolari di induzione genica coinvolti nella risposta delle piante all'ozono (Bernardi-Durante-Pugliesi)

Meccanismi molecolari coinvolti nella risposta delle piante all’ozono e ad altri stress abiotici: aspetti fisiologici e biochimici (Guidi-Ranieri)

Il ruolo dei secondi messaggeri nei meccanismi di trasduzione dello stress da ozono in specie d’interesse agrario

Ruolo di H2O2, etilene e cistein-proteasi nella risposta all’ozono ed a stress da alta temperatura in pomodoro

PRIN-MIUR 2003-2005

PRIN-MIUR 2005-2007

L'ozono come strumento per lo studio dello stress biotico ed abiotico nelle piante: analogie e divergenze nelle risposte di compensazione e difesa,

inducibilità crociata e protezione crociata

Obbiettivi:

caratterizzare e monitorare degli effetti mediati dal suolo ed interazioni pianta/suolo in presenza di stress combinato da ozono e metalli pesanti;

analogie e differenze nei meccanismi di risposta allo stress da ozono e/o da metalli pesanti;

analogie e differenze nei meccanismi di risposta allo stress da ozono e/o da elevata irradianza, elevata temperatura o sostanze chimiche;

ruolo di recettori di membrana, proteina chinasi e fattori di trascrizione ed interazioni tra molecole segnale nella percezione e trasduzione dello stimolo e nell'orchestrazione di risposte di difesa in condizioni di stress da ozono e/o infezione da patogeno.

Risorse umane 2005-2007

Numero Mesi uomo

1° anno

Mesi uomo

2° anno

Totale mesi uomo

Personale universitario dell'Università sede dell'Unità di Ricerca

11 59 59 118

Personale universitario di altre Università 7 19 21 40 Titolari di assegni di ricerca 3 15 3 18 Dottorato 5 22 18 40

Assegnisti 1 0 11 11 Borsisti 3 28 16 44

Altre tipologie 2 11 11 22 Personale extrauniversitario 5 7 7 14 TOTALE 37 161 146 307

Cofinanziamento totale

142.656 Euro

PRIN-MIUR 2005-2007

La risposta delle piante allo stress da ozono e da patogeno: percezione e pathway di trasduzione del segnale

Meccanismi molecolari coinvolti nell'attivazione di geni differenzialmente espressi in seguito a stress da ozono in ibridi di pioppo sensibili e tolleranti (Bernardi-Durante-Pugliesi).

Ozono e metalli pesanti: analogie e differenze tra le risposte del sistema suolo-pianta ai due fattori di stress (Guidi-Ranieri-Saviozzi)

Il ruolo del glutatione e del perossido di idrogeno nella risposta delle piante allo stress da ozono e metalli pesanti: sistemi di difesaantiossidativi e fitochelatine

Interazioni nell'induzione di risposte di difesa all'ozono e ad agenti fisici e chimici di stress in mutanti di pomodoro per lasintesi di pigmenti fotosintetici e/o fotoprotettivi o per l'espressione di geni coinvolti nel meccanismo di PCD

PRIN-MIUR 2005-2007

Specie vegetali

Specie Accessioni

S. lycopersicum (pomodoro) linee differenzialmente suscettibili a virus o tracheomicosi; mutanti per la percezione/biosintesi di etilene; mutanti “lesion mimic”; mutanti per il colore; transgeni (resistenza al patogeno/ PCD)

Ph. vulgaris (fagiolo) cultivar differenzialmente suscettibili

H. annuum (girasole) cultivar differenzialmente suscettibili

N. tabacum (tabacco) Bel-W3/Bel-B

L. albus (lupino)

A. thaliana ecotipo Col-0 e linee mutanti “loss of function”

P. deltoides x P. maximowiczii - P. x euramericana (pioppo)

cloni differenzialmente suscettibili

Trattamenti con ozono

acuto: 100 – 300 ppb per ore cronico 60 -100 ppb per giorni

Combinazione di stress

metalli pesanti alta irradianza ipertermia infezione da batteri o funghi fitopatogeni

Effetti & funzioni

Danno visibile Fitochelatine

Accrescimento Proteine correlate alla patogenesi

Assorbimento ed utilizzazione dell’energia luminosa: assimilazione netta di CO2

pigmenti (fotosintetici, fotoprotettivi, antiossidanti e dissipazione dell’energia fluorescenza della clorofilla a in vivo carbossilasi primarie e ciclo di Calvin

Metabolismo secondario (fenilpropanoidi, antocianine)

ROS (perossido d’idrogeno, superossido, ossido nitrico) quali pro-ossidanti (burst ossidativo) o messaggeri

Ormoni (ET, JA, SA) e loro metabolismo (metodi originali di dosaggio ad hoc; approccio “farmacologico”)

Geni ed enzimi ROS-generanti Recettori e cascate di segnalazione (MAPK)

Geni ed enzimi ROS-scavenging Espressione genica e regolazione della trascrizione (isolamento ed analisi del promotore e fattori di trascrizione)

Antiossidanti e loro metabolismo Senescenza

Geni della biosintesi di antiossidanti Morte cellulare/HR/PCD (differenziazione / lancio ed esecuzione / contenimento)

Attrezzature, strumentazione & tecniche

Fumigazione in ambiente controllato Scambi gassosi mediante IRGA

Microscopia ottica ed elettronica Microestrazione in fase solida

Analisi d’immagine Cromatografia liquida ed in fase gassosa interfacciate a spettrometria di massa

Analisi chimica e biochimica del suolo Enzimologia

Frazionamento cellulare e purificazione di organuli

Immunoquantificazione di proteine (analisi Western)

Infiltrazione sottovuoto di tessuti Estrazione e purificazione di acidi nucleici

Spettroscopia UV/VIS e di fluorescenza Studio espressione genica [analisi Northern, RT-PCR, cDNA-AFLP, ibridazione sottrattiva soppressiva (SSH), analisi globale del trascrittoma (arraying), studio dei patterns di espressione, ibridazione “in situ” ]

Spettroscopia atomica Metodologie bioinformatiche & biostatistiche (disegno di primers, esplorazione di banche dati, espressione genica comparata)

Analisi della dinamica stomatica Tecniche di ibridazione e trasformazione genica

Pubblicazioni 2003-2006

PRIN-MIUR 2003-2005 / 2005-2007

Analysis of gene expression induced by chronic ozone exposure in the Mediterranean shrub Phillyrea latifolia L. by cDNA-AFLP

A.R. Paolacci, C. Miraldi, O. A. Tanzarella, M. Badiani, E. Porceddu, C. Nali, G. Lorenzini and M. Ciaffi

(submitted)

Progetto FIRB-PlantSTRESSCaratterizzazione genetica e molecolare della risposta allo stress da ozono in frumento

(Marabottini et al., 2005)

Progetto FIRB-PlantSTRESSCaratterizzazione genetica e molecolare della risposta allo stress da ozono in frumento

(Paolacci et al., 2004)