MODULO GENETICAMODULO GENETICAMODULO GENETICAMODULO GENETICA

METODI PER LA RICERCA DI METODI PER LA RICERCA DI MUTAZIONI NEL DNAMUTAZIONI NEL DNA

Lezione IIILezione III

Relazione tra condizioni patologiche umane ed elementi genetici

Linee Guida per I test genetici ISS

DIAGNOSTICI

•consentono di stabilire una diagnosi o di confermare un consentono di stabilire una diagnosi o di confermare un sospetto clinico in un individuo già affettosospetto clinico in un individuo già affetto

•permettono di stabilire un’associazione tra Malattia, permettono di stabilire un’associazione tra Malattia, Gene, Mutazione EreditariaGene, Mutazione Ereditaria

Validità Clinica: Validità Clinica: Sensibilità Sensibilità probabilità che il test sia positivo in probabilità che il test sia positivo in

soggetti con soggetti con la malattia, la malattia, SpecificitàSpecificità la probabilità che il test sia negativo la probabilità che il test sia negativo

in in soggetti senza la malattiasoggetti senza la malattia

PRECLINICI o PRESINTOMATICI

consentono di valutare se un soggetto asintomatico possa sviluppare in

futuro la malattia

VALUTAZIONE DELLA SUSCETTIBILITA’ GENETICA

consentono l’individuazione di genotipi che comportano un

aumento di rischio a sviluppare una determinata patologia in seguito

all’esposizione a fattori ambientali favorenti o alla presenza di altri

fattori genetici scatenanti Linee Guida per I test genetici ISS

INDIVIDUAZIONE DEGLI ETEROZIGOTI in caso di patologie autosomiche

recessive, finalizzate alla prevenzione della nascita degli

omozigoti

Linee Guida per I test genetici ISS

INDAGINI MEDICO-LEGALIconsentono l’accertamento o

l’esclusione di paternità e l’attribuzione di tracce biologiche a determinati individui, con un grado

di probabilità molto elevato

ITER PER UN TEST GENETICOITER PER UN TEST GENETICO

Fase preanalitica   ACCETTAZIONE del CAMPIONE:

  Consulenza genetica   Consenso informato

Nome del paziente, Data di nascita, Luogo di nascita del paziente, dei genitori e dei nonni, Origine etnica, Storia familiare (raccomandata in tutti i casi)

Conoscenza dei test genetici da parte di chi richiede l’esame

Relazione tra condizioni patologiche umane ed elementi genetici

MUTAZIONI E MALATTIE GENETICHE MUTAZIONI E MALATTIE GENETICHE EREDITARIEEREDITARIE

Le mutazioni sono responsabili di un gran numero di Le mutazioni sono responsabili di un gran numero di malattie ereditarie (emofilia, fibrosi cistica, distrofia malattie ereditarie (emofilia, fibrosi cistica, distrofia muscolare, degenerazioni retiniche…)muscolare, degenerazioni retiniche…)

Isolare dall’intero genoma il tratto di DNA che si Isolare dall’intero genoma il tratto di DNA che si desidera studiaredesidera studiare

Ottenere molteplici copie (amplificazione) della Ottenere molteplici copie (amplificazione) della sequenza di interessesequenza di interesse

Presupposti necessari per lo studio di geni Presupposti necessari per lo studio di geni o di sequenze di interesseo di sequenze di interesse

Tecniche utilizzate nella diagnostica molecolare

Sequenziamento diretto

PCR CSGEDGGE

DHPLC

Mediante tecniche di biologia molecolare ogni Mediante tecniche di biologia molecolare ogni “segmento” di genoma di interesse può essere “segmento” di genoma di interesse può essere amplificato sufficientemente per analizzarne in amplificato sufficientemente per analizzarne in

dettaglio la sequenzadettaglio la sequenza

AMPLIFICAZIONE DEL GENE DI AMPLIFICAZIONE DEL GENE DI

INTERESSEINTERESSE

POLYMERASE CHAIN REACTIONPOLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)(PCR)

1983 1983 Kary Mullis scopre la reazione a catena Kary Mullis scopre la reazione a catena

mediata dalla polimerasimediata dalla polimerasi

1985 1985 Anno della pubblicazione del primo Anno della pubblicazione del primo

esperimentoesperimento

La PCR rivoluziona la biologia La PCR rivoluziona la biologia molecolaremolecolare

Il processo, ad alta efficienza, permette di Il processo, ad alta efficienza, permette di amplificare milioni di volte una sequenza specifica amplificare milioni di volte una sequenza specifica in 2-4 ore.in 2-4 ore.

CRESCITACRESCITA ESPONENZIALEESPONENZIALE2n n=numero di cicli

SEQUENZIAMENTOSEQUENZIAMENTO

manualemanuale

automaticoautomatico

PCRPCRDGGEDGGE

CSGECSGE

SSCPSSCP

TECNICHE DI

SCREENING

Wild-type

Paziente

Paziente

Wild-type

DHPLCDHPLC

AdeninaGuaninaCitosina

ddTimina

ddAdeninaddGuanina

ddCitosina

+

dNTP ddNTP marcati

LA REAZIONE AVVIENE IN UNA SOLA PROVETTA

SANGER IN AUTOMATICO

Timina

Ogni ddNTP è marcato con un diverso fluorocromo

SANGER IN AUTOMATICO

Denaturazione del prodotto di PCR

5’5’3’

3’

5’

5’

3’

3’

Primer 1

SANGER IN AUTOMATICO

Annealing del primer

Estensione: la DNA polimerasi inizia l’estensione del filamento a partire dall’estremità 3’ del primer in presenza di dNTPS e ddNTPS.

Primer 1

DNA polimerasi

SANGER IN AUTOMATICO

Estensione

Primer 1

DNA polimerasi

SANGER IN AUTOMATICO

L’elica del DNA viene estesa finchè non viene incorporato un ddNTP

Primer 1ddNTP

SANGER IN AUTOMATICO

L’elica neosintetizzata viene rilasciata e l’elica originale è pronta per essere estesa di nuovo.

ddNTP

SANGER IN AUTOMATICO

Si ripete il processo : denaturazione 95°

Primer 1

Annealing

Estensione 60°

25 CICLI

SANGER IN AUTOMATICO

La sintesi procede: grazie alla incorporazione casuale dei ddNTPs vengono sintetizzate centinaia di copie di DNA, ciascuna terminante con una diversa base. Ogni frammento neosintetizzato differisce dagli altri per una base in lunghezza.

27 basi

25 basi

26 basi

24 basi

28 basi

Gruppo di frammenti

SANGER IN AUTOMATICO

SANGER IN AUTOMATICO

PCR

Primer

Annealing

Estensione

A CT G

Taq e dNTPS AACACCACCGACCGTACCGTA

Eliminazione dei ddNTPs non incorporati

Preparazione gel di acrilammide

Elettroforesi

Analisi dei dati

Denaturazione

SANGER IN AUTOMATICO

Elettroforesi su gel di poliacrilammide mediante sequenziatore

Un laser eccita le molecole durante la loro migrazione

SANGER IN AUTOMATICO

Ogni fluorocromo emette ad una determinata lunghezza d’onda

Ognuno dei quattro ddNTPs è coniugato ad un fluorocromo di colore diverso: C, T, A, G

Il colore della banda che passa è registrato: i dati vengono inviati ad un computer che ne permette l’analisi

SANGER IN AUTOMATICO

ANALISI DEI DATI

ATGGCTGAAAATGCACCTG wild-type

ATGGCTGAAAATGCTTCTG paziente*

Wild-type

Paziente

R218C (652CT)

ANALISI DEI DATIANALISI DEI DATI

G>A: G1961EG>A: G1961E

C>A: C1177XC>A: C1177X

Wild-type

Paziente

Wild-type

Paziente

Interpretazione e Interpretazione e nomenclatura delle nomenclatura delle

mutazionimutazioni

ESEMPIO: nomenclatura per mutazioneESEMPIO: nomenclatura per mutazionedi splicing ivs24+1G>Tdi splicing ivs24+1G>T

ESEMPIO: nomenclatura per mutazioneESEMPIO: nomenclatura per mutazionemissense c. 2456G>A (p.Arg869His)missense c. 2456G>A (p.Arg869His)

ESEMPIO: nomenclatura per mutazioneESEMPIO: nomenclatura per mutazioneframeshift insC1065frameshift insC1065