MODELLI ANIMALI DI LESIONE SPINALE E

TERAPIE SPERIMENTALI

Rosario Gulino

IL MIDOLLO SPINALE

CAUSE DI LESIONE SPINALE NELL’UOMO

ETA’ MEDIA DELLE PERSONE COLPITE DA LESIONE TRAUMATICA

CONSEGUENZE DELLA LESIONE SPINALE

• Perdita della motricità: paraplegia, tetraplegia;

• Spasticità muscolare;

• Dolore cronico;

• Perdita/alterazione sensoriale;

• Disriflessia autonomica: alterata risposta del sistema nervoso autonomo;

• Disfunzioni sessuali;

• Problemi vescicali e intestinali;

• Problemi circolatori e respiratori;

• Ipersensibilità a caldo e freddo.

Dipendono dal livello e dall’entità della lesione spinale

MIGLIORAMENTI AUSPICATI DAI PAZIENTI

• Ridurre il danno in fase acuta (rimozione di coaguli, riduzione dell’infiammazione ecc..);

• Ridurre i fattori che impediscono la rigenerazione (cicatrice gliale, fattori biochimici che impediscono la crescita delle fibre nervose ecc..);

• Favorire attivamente la rigenerazione (esercizio, riabilitazione, farmaci, trapianti);

• Protesi e altri ausili tecnici (stimolatori muscolari ecc..);

• Cure sintomatiche (dolore, piaghe, infezioni, problemi psicologici ecc..);

APPROCCI TERAPEUTICI REALI E POSSIBILI

COME VENGONO SCOPERTE LE NUOVE CURE?

COME VENGONO TESTATE?

• Innanzitutto è necessario aumentare le conoscenze di base sulla fisiologia del midollo spinale (ricerca di base);

• Non tutte le ricerche si possono effettuare direttamente sull’uomo;

• Alcune si possono effettuare con l’utilizzo di cellule provenienti da biopsie oppure da animali;

• Altre ricerche richiedono modelli animali.

I MODELLI ANIMALI DI LESIONE SPINALECreare situazioni sperimentali simili alle varie condizioni cliniche per:

Studiare gli effetti della lesione, dal punto di vista:

a) istologico (taglio delle fibre nervose, necrosi tissutale, infiammazione, gliosi ecc..);

b) cellulare (morte cellulare, stress, cambiamenti biochimici, alterazioni sinaptiche ecc..);

c) biochimico (alterazioni metaboliche, enzimi, recettori ecc..);

d) funzionale (attività motoria, autonomica, dolore cronico ecc..).

Studiare il possibile recupero spontaneo, dal punto di vista:

a) istologico (sprouting delle fibre nervose risparmiate dalla lesione, cicatrizzazione, neurogenesi);

b) cellulare (plasticità sinaptica);

c) biochimico (cambiamenti dell’espressione di proteine, enzimi, ecc..);

d) funzionale (recupero dell’attività motoria, ripristino delle funzioni viscerali ecc..).

Studiare strategie di riparazione, utilizzando:

a) esercizio fisico (ginnastica passiva, locomozione);

b) somministrazione di fattori neurotrofici (con mezzi fisici o tramite cellule che li producono);

c) protesi robottizzate;

d) trapianti neurali (di tessuto, di cellule mature, di cellule staminali, di cellule producenti molecole farmacologicamente attive).

MODELLI ANIMALI DI LESIONE SPINALE

• Contusione;• Transezione incompleta (emisezione spinale);• Transezione totale;• Taglio di specifiche vie nervose;• Deafferentazione;• Nerve crush;• Lesioni neurotossiche selettive: eliminazione selettiva dei

motoneuroni, demielinizzazione (con tossine retrograde o con iniezione diretta nel midollo).

SISTEMI DI STEREOTASSIA E CHIRURGIA SPINALE

Sono sistemi che servono a fissare l’animale anestetizzato per poi raggiungere le varie strutture nervose tramite l’utilizzo di coordinate

cartesiane riportate in appositi atlanti di anatomia.

Si possono utilizzare sia per strutture cerebrali (A) che per la chirurgia spinale (B).

AB

ATLANTE STEREOTASSICO DEL SNC DEL RATTO

ALCUNI TEST PER VALUTARE IL DEFICIT MOTORIOA

B C

A) Basso, Beattie, Bresnahan rating scale: è un criterio di valutazione qualitativa della funzionalità motoria degli arti, che si basa sull’attribuzione di punteggi arbitrari sulla base delle capacità di movimento e coordinazione motoria.

B) Grid walk test: è una specie di scala orizzontale all’interno di un corridoio, sulla quale gli animali devono camminare. L’abilità motoria viene valutata in base al numero di inforcamenti degli arti tra i pioli.

C) Rota-rod test: gli animali devono aggrapparsi a un tubo rotante e mantenersi in equilibrio camminando su di esso. Si misura il tempo dall’inizio del test alla caduta. Il test prevede una durata massima e può essere effettuato a velocità costante o in accelerazione.

CONTUSIONE SPINALE

• Si anestetizza l’animale;

• Dopo aver fissato la colonna vertebrale, si pratica un foro sulla vertebra;

• Con l’utilizzo di uno strumento (Spinal Impactor) si applica, sulla superficie del midollo, una pressione di entità e durata regolabile, in base all’entità del danno che si vuole sperimentalmente provocare.

• Questo tipo di lesione determina trauma locale, con infiammazione e degenerazione del tessuto.

Impactor: consiste in un braccio

recante l’applicatore di

pressione, che va montato sul sistema di

stereotassia.

EMISEZIONE SPINALE

• Si anestetizza l’animale;

• Dopo aver fissato la colonna vertebrale, si pratica un foro sulla vertebra;

• Si incide la dura madre e, con l’utilizzo di una microlama, si taglia metà del midollo spinale.

L’emisezione determina:• Trauma locale, con

necrosi e infiammazione;

• Taglio delle vie spinali ascendenti e discendenti di un lato del midollo.

TRANSEZIONE SPINALE COMPLETA

• Consiste nel taglio completo del midollo spinale, e quindi nella totale interruzione delle vie nervose che corrono lungo il midollo stesso;

• Si può utilizzare, oltre che come modello di lesione su cui testare nuove terapie, anche come modello per ricerche di base in cui si studiano gli automatismi del midollo spinale e i meccanismi compensatori.

NERVE CRUSH• Consiste nel

danneggiamento di un nervo periferico, ad esempio il nervo sciatico;

• La lesione periferica determina, oltre ai problemi di conduzione dei segnali motori e sensoriali, anche la degenerazione dei neuroni spinali le cui fibre vengono danneggiate dalla lesione;

• Questi modelli possono servire come ricerca di base, o anche per sperimentare terapie mirate alla prevenzione della morte cellulare o a favorire la reinnervazione.

LESIONI NEUROTOSSICHE SELETTIVE

• Si avvalgono dell’utilizzo di sostanze citotossiche, cioè in grado di uccidere le cellule una volta al loro interno.

• Alcune di queste tossine possono essere coniugate con molecole che riconoscono selettivamente soltanto alcuni tipi di cellule. Esistono così tossine selettive per i neuroni che producono dopamina, o tossine selettive per i motoneuroni, ecc…

• Iniettando queste tossine in prossimità delle cellule, queste penetrano selettivamente all’interno dello specifico tipo cellulare e ne provocano la morte.

• Alcune tossine, come la volkensina o la Cholera Toxin B-saporin, sono selettive per i motoneuroni, e possono ucciderli se iniettate nel muscolo, in quanto vengono captate dalle terminazioni nervose dei motoneuroni che innervano il muscolo, vengono trasportate lungo l’assone, arrivano al corpo cellulare e uccidono la cellula.

Lesione neurotossica selettiva per i motoneuroni spinali: ottenuta tramite l’iniezione di volkensina nel muscolo gastrocnemio mediale di ratti neonati

Trapianto di motoneuroni di origine embrionale nel midollo spinale lesionato: il trapianto sopravvive ed è funzionalmente attivo

COSA PUO' FAVORIRE LA RIPARAZIONE?

1) Plasticità sinaptica

2) Ripristino spontaneo dell'innervazione tramite “sprouting”

3) “Cell replacement” spontaneo tramite neurogenesi

4) “Cell replacement” tramite trapianti di cellule staminali o neuroni

5) Uso dei trapianti per veicolare farmaci e per trasferire geni all'interno del tessuto nervoso

NEUROPLASTICITA’

PLASTICITA' SINAPTICAConsiste nel cambiamento a lungo termine della risposta sinaptica agli impulsi in arrivo. A parità di impulsi, aumentano o diminuiscono il rilascio di neurotrasmettitori e/o la risposta post-sinaptica.

La plasticità sinaptica è attività-dipendente, è mediata da neuromodulatori come il BDNF, e dipende dalla sintesi di nuove proteine.

PLASTICITA' SINAPTICA (a livello presinaptico)

ESERCIZIO FISICO

NEUROGENESI NELLA ZONA SUBVENTRICOLARE (SVZ)

NEUROGENESI NELL'IPPOCAMPO

NEUROGENESI NEL MIDOLLO SPINALE

NEUROGENESI E RIGENERAZIONE

Tuttavia, la neurogenesi spontaneo nel midollo spinale è molto scarsa e porta alla produzione di glia. Sono in studio metodi sperimentali per stimolarla

MECCANISMI MOLECOLARI DELLA NEUROGENESI

MECCANISMI MOLECOLARI DELLA NEUROGENESI: FATTORI MORFOGENETICI

GLI STESSI FATTORI POSSONO REGOLARE ANCHE ALTRI FENOMENI PLASTICI COME LA PLASTICITA’

SINAPTICA

TRAPIANTI DI CELLULE STAMINALI NEURALI

IMPORTANTE!! I trapianti neurali sono ancora allo stadio di sperimentazione sui modelli animali. Non esistono protocolli validati di trapianto nella lesione spinale dell’uomo. Si tratta di approcci terapeutici promettenti ma ancora da verificare.

TIPI DI CELLULE DA TRAPIANTARE NEL SISTEMA NERVOSO

• tessuto nervoso;

• cellule staminali embrionali (ES);

• cellule staminali neurali;

• neuroni ottenuti da tessuto fetale o da ES o da altre cellule staminali;

• olfactory ensheating cells;

• cellule staminali ematopoietiche;

• cellule stromali del midollo osseo;

• cellule staminali del cordone ombelicale.

Le cellule vengono raccolte dalle fiasche, centrifugate e risospese in una soluzione fisiologica

iniettabile. Poi vengono iniettate nel Sistema Nervoso Centrale utilizzando delle microsiringhe.

TRAPIANTO

APPLICAZIONI DEI TRAPIANTI NEURALI

Diseases with progressive cell degeneration

• myelin disorders

• Parkinson’s disease

• Alzheimer’s disease

• Amyotrophic lateral sclerosis

• Huntington’s disease

Acute diseases

• stroke

• spinal cord injury

Lysosomal storage diseases

• Krabbe disease or globoid cell leukodystrophy

• Batten disease or S-acylated proteins ceroid lipofuscinosis

• Gaucher disease, …

DOPO IL TRAPIANTO, LE CELLULE POSSONO INDURRE MIGLIORAMENTI DOVUTI A …

Meccanismo Meccanismo d’azione

Limitazione del danno tissutale • risposte plastiche compensatorie indotte dall’infiammazione• interferenza con i circuiti residenti

Correzione di deficit biochimici Rilascio di trasmettitori mancanti (“mini-pump”)

Secrezione di fattori trofici Stimolazione di fenomeni plastici e aumentata capacità di sopravvivenza e mantenimento funzionale delle cellule

Reinnervazione locale Ripristino del rilascio sinaptico di neurotrasmettitore

Ricostruzione dei circuiti nervosi Ripristino delle connessioni nervose afferenti ed efferenti

CELLULE STAMINALI NEURALI SI POSSONO OTTENERE DA TESSUTO FETALE

MitogensNeural stem cells

Mitogens

Ventricular system

Embryonic brain

NeurosfereLive

Live

eGFP

eGFP

eGFP

eGFP

Bone marrow stromal cells (BMSCs)

• Transplantation of either human or rat BMSCs into the 6-OHDA-treated rat striatum induces improvement in rotational behavior.

• Some surviving tyrosine hydroxylase-positive immunoreactive cells extend processes into the striatum.

• To date, no evidence of tumor formation or unanticipated side effects in these models.

• problem: difficult to derive large numbers of dopamine neurons from BMSCs or to induce survival of meaningful numbers of cells followingtransplantation.

Other stem cells

Umbilical stem cells

• The umbilical cord matrix contains primitive stem cells.

Medicetty et al. demonstrated that transplanted porcine umbilical stem cells survive and proliferate in the striatum of 6-OHDA-lesioned rats. By 8 weeks post-surgery 6% had spontaneously differentiated into tyrosine hydroxylase-positive cells. Rejection was not observed. (Medicetty S, Bledsoe AR, Fahrenholtz CB, et al. Transplantation of pig stem cells into rat brain: proliferation during the first 8 weeks. Exp Neurol 2004;190:32–41)

• It is far from clear that these cells can be induced to readily differentiateinto dopamine neurons and provide sufficient benefits in laboratory models of parkinsonism to warrant consideration of trials in Parkinson’s disease patients.

Transplantation of neural stem cells in animal models of spinal cord injury

Differentiation of engrafted cells and positive effects on locomotor behaviour

Bimodal mechanism of action:- direct anatomical and functional re-ensheathing of myelin at the lesion site

- inhibition of astrogliosis, with positive effects on remyelination and reducing axonal loss

Pluchino et al. and Martino, 2003

Transplantation of neurospheres in animal models of multiple sclerosis

Conti et al., 2005

trapianto

NS cells

Ippocampo

Striato

Siti di iniezione del trapianto

Corteccia

Overlay (eGFP+NeuN)

eGFP

NeuN

Predifferentiated Cor1-eGFP in the Hippocampus

Overlay (eGFP+NeuN)

eGFP

NeuN

Predifferentiated Cor1-eGFP in the Striatum

Overlay (eGFP+NeuN)

eGFP

NeuN

Predifferentiated Cor1-eGFP in the Cortex

Fattori che influenzano il differenziamento in vivo

• Tipo di cellule staminali• Numero di cellule trapiantate• Trattamento in vitro (numero di passaggi, modifiche genetiche, differenziamento)• Sede del trapianto (neurogenicità)• Presenza di lesioni e loro effetti tissutali• Sfasamento tra lo stato differenziativo del trapianto e gli stimoli ricevuti dal tessuto

Applicabilità alla terapia

Requisiti richiesti:

• Quantità di cellule sufficiente• Sufficiente varietà di fonti• Compatibilità istologica• Sicurezza sanitaria accertata

Fonti di staminali umane adulte:

• Midollo osseo• Sangue periferico• Cordone ombelicale• Biopsie di vari tessuti

Problemi:

• Scarsa disponibilità e varietà di fonti• Problemi di istocompatibilità in caso di

donazione (rigetto)• Cellule non pluripotenti – controversie sul

transdifferenziamento

Transplantation of stem cells in humans (1)