MicroscopiaMicroscopia

Esercitazione di Microbiologia generale

I microrganismiI microrganismi

Le cellule più primitive viventi attualmente sono i batteri questi appartengono a un gruppo di organismi chiamati procarioti (letteralmente "prima del nucleo").

Tuttavia, la maggioranza delle forme di vita (compresi alghe, funghi, piante e animali) è caratterizzata dalla presenza del nucleo e si definisce eucariota(letteralmente "con un vero nucleo").

Il microrganismiIl microrganismi

Le manifestazioni della crescita su substrato solido possono consentire di distinguerli in grandi gruppi.

Le cellule dei microrganismi sono troppo piccole per essere distinte ad occhio nudo. Ciò dipende sia dalle dimensioni delle cellule che dal potere di risoluzione dell’occhio umano, che nelle migliori condizioni è di 0,2 mm. Un altro aspetto importante è il contrasto dell’oggetto da visualizzare: la maggior parte delle cellule sono troppo trasparenti per essere distinte dallo sfondo.

Il microrganismiIl microrganismi

Il microscopioIl microscopio

stativo

fonte di illuminazione

fotocamera o telecamera

oculari

diaframma di campo

revolver con obiettivi

tavolino traslatore

vite macrometrica e micrometrica

condensatore

tubo

Il microscopioIl microscopio

ingrandimentoingrandimentoingrandimentoingrandimento

Valore oculare ( generalmente 10 x)

x

valore obiettivo (10x;40x;100;)

x

fattore di tubo (generalmente 1)

Il microscopioIl microscopio

Incisioni sull’ obiettivo

40x = ingrandimento

0,6 = apertura numerica

160 = lunghezza del tubo

0,17 = spessore vetrini

Il limite di risoluzione dei microscopiIl limite di risoluzione dei microscopi

Il limite di risoluzione di un microscopio, cioè la minima distanza alla quale due punti possono essere visti come separati può essere calcolato con la formula:

d =0,5λ

NsenαDove λλλλ è la lunghezza d’onda della sorgente di luce utilizzata, N è l’indice di rifrazione del mezzo interposto fra lente e preparato e αααα è il semiangolo della lente dell’obiettivo

Il limite di risoluzione dei microscopiIl limite di risoluzione dei microscopi

Il limite di risoluzione può essere aumentato interponendo tra l’obiettivo e il preparato una sostanza che abbia un indice di rifrazione maggiore dell’ aria

100 X100 X100 X100 X

100 X100 X100 X100 X

portaogettoportaogettoportaogettoportaogetto

copriogettocopriogettocopriogettocopriogettoOlio di legno Olio di legno Olio di legno Olio di legno di cedrodi cedrodi cedrodi cedro

Obiettivo 100 XObiettivo 100 XObiettivo 100 XObiettivo 100 X

Il PreparatoIl Preparato

Il PreparatoIl Preparato

Preparato Preparato Preparato Preparato schiacciatoschiacciatoschiacciatoschiacciato

Preparato a goccia Preparato a goccia Preparato a goccia Preparato a goccia pendentependentependentependente

Osservazione in campo chiaroOsservazione in campo chiaro

C. versatilis in campo chiaro,1000x

Un particolare tipo di condensatore nell’osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato. Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro. In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico, come fasci di flagelli

Osservazione in campo scuroOsservazione in campo scuro

Osservazione in campo scuroOsservazione in campo scuro

Microscopio elettronico a trasmissioneMicroscopio elettronico a trasmissione

Batteri al microscopio elettronico a trasmissioneBatteri al microscopio elettronico a trasmissioneBatteri al microscopio elettronico a trasmissioneBatteri al microscopio elettronico a trasmissione

la risoluzione di un microscopio è legata principalmente alla lunghezza d’onda della radiazione utilizzata per l’osservazione. Ciò limita la risoluzione dei microscopi ottici, anche nelle condizioni migliori, a 0,20,20,20,2micronmicronmicronmicron. Utilizzando un fascio di elettroni in un sistema ad alto vuoto, focalizzato e controllato mediante lenti elettromagnetiche è possibile portare la risoluzione a dimensioni molecolari perché gli elettroni hanno una lunghezza d’onda di 0,4 0,4 0,4 0,4 nmnmnmnm. La risoluzione quindi può essere dell’ordine di 0,2 0,2 0,2 0,2 nmnmnmnm. Gli ingrandimenti possibili superano di molto 10000x10000x10000x10000x

Microscopio elettronico a trasmissioneMicroscopio elettronico a trasmissione

Batteri al microscopio elettronico a trasmissioneBatteri al microscopio elettronico a trasmissioneBatteri al microscopio elettronico a trasmissioneBatteri al microscopio elettronico a trasmissione

Il limite principalelimite principalelimite principalelimite principale è legato alla necessità di ottenere sezioni sottili (<100 nm) dei preparati fissati (disidratati, fissati con glutaraldeideo tetrossido di osmio ed immersi in una resina) a causa dello scarso potere di penetrazione degli elettroni.

Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico a scansione SEMSEM

Nel microscopio elettronico a scansione si ottengono immagini tridimensionali; il preparato viene rivestito di un sottile film metallico (oro) e un fascio di elettroni compie una scansione del preparato; gli elettroni secondari che partono dall’oggetto vengono raccolti da uno schermo che fornisce un’immagine tridimensionale. Gli ingrandimenti vanno da 20x a 100000x.

Streptococcus thermophilus

Microscopio elettronico a scansioneMicroscopio elettronico a scansione

Penicillium roquefortii

Il microscopio laser a scansione Il microscopio laser a scansione confocaleconfocale

Il microscopio laser a scansione microscopio laser a scansione microscopio laser a scansione microscopio laser a scansione confocaleconfocaleconfocaleconfocale (CLSM)(CLSM)(CLSM)(CLSM) è un normale microscopio ottico in cui la fonte di illuminazione è un fascio laser che viene messo a fuoco con estrema precisione in un piano dell’oggetto: la luce proveniente dagli strati circostanti è minimizzata e siccome il fascio esegue scansioni verticali ed orizzontali il risultato sono immagini tridimensionali del preparato.

Immagini al microscopio laser a scansione Immagini al microscopio laser a scansione confocaleconfocale

Immagine di un biofilm Immagine di una comunità colorata con sonde fluorescenti specifiche per diversi gruppi di

microrganismi

La possibilità di applicare sonde fluorescentisonde fluorescentisonde fluorescentisonde fluorescenti specifiche per microrganismi vivi o morti, per diversi taxa, per diverse strutture cellulari e la possibilità di ottenere immagini con un minimo di preparazione rende questa tecnica estremamente potente per visualizzare i microrganismi in situ.

La micrometriaLa micrometriaServe per la misurazione dei MO. Si Serve per la misurazione dei MO. Si Serve per la misurazione dei MO. Si Serve per la misurazione dei MO. Si

hanno l’oculare micrometrico hanno l’oculare micrometrico hanno l’oculare micrometrico hanno l’oculare micrometrico che ha una scala graduata (100 che ha una scala graduata (100 che ha una scala graduata (100 che ha una scala graduata (100 tacche) ed un vetrino tacche) ed un vetrino tacche) ed un vetrino tacche) ed un vetrino micrometrico della lunghezza di micrometrico della lunghezza di micrometrico della lunghezza di micrometrico della lunghezza di un mm e ogni divisione è di 10 un mm e ogni divisione è di 10 un mm e ogni divisione è di 10 un mm e ogni divisione è di 10 µµµµm.m.m.m.

1.1.1.1. Osservando mediante il Osservando mediante il Osservando mediante il Osservando mediante il microscopio (a) con l’oculare microscopio (a) con l’oculare microscopio (a) con l’oculare microscopio (a) con l’oculare micrometrico (b), si allineano gli micrometrico (b), si allineano gli micrometrico (b), si allineano gli micrometrico (b), si allineano gli zeri con il vetrino micrometrico zeri con il vetrino micrometrico zeri con il vetrino micrometrico zeri con il vetrino micrometrico (c). In questo modo si potrà (c). In questo modo si potrà (c). In questo modo si potrà (c). In questo modo si potrà stabilire quanti stabilire quanti stabilire quanti stabilire quanti µµµµm misurerm misurerm misurerm misureràààà la la la la scala ignota dellscala ignota dellscala ignota dellscala ignota dell’’’’oculare*oculare*oculare*oculare*....

2.2.2.2. Una volta tarato lUna volta tarato lUna volta tarato lUna volta tarato l’’’’oculare, si oculare, si oculare, si oculare, si toglie il vetrino micrometrico e e toglie il vetrino micrometrico e e toglie il vetrino micrometrico e e toglie il vetrino micrometrico e e si posiziona il vetrino con il si posiziona il vetrino con il si posiziona il vetrino con il si posiziona il vetrino con il preparato cellulare. In questo preparato cellulare. In questo preparato cellulare. In questo preparato cellulare. In questo modo modo modo modo èèèè possibile determinare la possibile determinare la possibile determinare la possibile determinare la dimensione dei MO (d).dimensione dei MO (d).dimensione dei MO (d).dimensione dei MO (d).

****lalalala taratura cambia a seconda taratura cambia a seconda taratura cambia a seconda taratura cambia a seconda

delldelldelldell’’’’ingrandimantoingrandimantoingrandimantoingrandimanto

ddddcccc

aaaa bbbb

La conta cellulareLa conta cellulare

Il numero di cellule presenti in una sospensione può essere calcIl numero di cellule presenti in una sospensione può essere calcIl numero di cellule presenti in una sospensione può essere calcIl numero di cellule presenti in una sospensione può essere calcolato olato olato olato contando le cellule contenute in un volume accuratamente contando le cellule contenute in un volume accuratamente contando le cellule contenute in un volume accuratamente contando le cellule contenute in un volume accuratamente determinato e molto piccolo.determinato e molto piccolo.determinato e molto piccolo.determinato e molto piccolo.

Questa conta prevede l’utilizzo Questa conta prevede l’utilizzo Questa conta prevede l’utilizzo Questa conta prevede l’utilizzo di speciali vetrini portaoggetti di speciali vetrini portaoggetti di speciali vetrini portaoggetti di speciali vetrini portaoggetti noti col nome di camere noti col nome di camere noti col nome di camere noti col nome di camere contacellulecontacellulecontacellulecontacellule o camera di o camera di o camera di o camera di ThomaThomaThomaThomache presentano una zona che presentano una zona che presentano una zona che presentano una zona centrale più bassa di 0,1 mmcentrale più bassa di 0,1 mmcentrale più bassa di 0,1 mmcentrale più bassa di 0,1 mm

Ogni quadratino del reticolo misura 1/400 di mmOgni quadratino del reticolo misura 1/400 di mmOgni quadratino del reticolo misura 1/400 di mmOgni quadratino del reticolo misura 1/400 di mm2 2 2 2 per cui il volume per cui il volume per cui il volume per cui il volume sovrastante è 1/4.000.000 di cmsovrastante è 1/4.000.000 di cmsovrastante è 1/4.000.000 di cmsovrastante è 1/4.000.000 di cm2222