Il Microscopio

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IL MICROSCOPIO Page 1 of 50

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School Research

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IL MICROSCOPIO

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Lo studio delle cellule iniziò con l’invenzione del microscopio composto (formato da più lenti) per mezzo del quale si poterono osservare strutture molto più piccole di quelle visibili ad occhio nudo.

Le prime lenti furono costruite tra il 1100 e il 1200.

Leonardo da Vinci fu il primo, nel 1508, a proporre l'uso di lenti a contatto per correggere i difetti della vista

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Nel 1590 i fratelli JANSSEN mettendo insieme due lenti all’interno di un tubo,costruirono un rudimentale microscopio composto. All’inizio del XVII secolo, anche GALILEO GALILEI costruì un microscopio inserendo due lenti in un cilindro e con questo strumento riuscì ad osservare prima e descrivere poi la struttura geometrica degli occhi delle mosche

Nel 1674 ANTON VAN LEEUWEHOEK , commerciante olandese, molto abile nella costruzione di lenti, f abbricò un microscopio formato da una lente oculare e da una l ente obiettivo

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Il microscopio ottico

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“Istologia” del microscopioottico o“luce”

condensatore

lampada

preparato

obiettivo

oculare

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Anatomia del microscopioottico o “luce”

oculare

stativo

regolazionefuoco

revolverobiettivi

tavolo e vetrino

lampada e condensatorePage 8 of 50

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Parti componenti

• Sistema di illuminazione = costituito da una lampada al disopra della quale si trova un condensatore che serve per concentrare il fascio luminoso sul preparato. Spesso è presente anche un diaframma a iride che può allargare o restringere il fascio emesso dalla lampada

• Sistema di sostegno = costituito dalla stativo e dal tavolino portaoggetti

• Sistema di osservazione = costituito dal tamburo che porta superiormente l’oculare e inferiormente una serie di obiettivi montati su supporto girevole a revolver che ruotando consente di cambiarli

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Messa a fuoco

• Un oggetto può essere osservato chiaramente solo quando si trova a una certa distanza dall’obiettivo.

• Tale distanza non è costante ma decresce all’aumentare dell’ingrandimento

• La sua regolazione è detta messa a fuoco e si effettua per mezzo di due viti situate ai lati dello stativo: la vite macrometrica e la vite micrometrica

• Quest’ultima si usa spesso durante l’osservazione perché con piccoli spostamenti consente di mettere a fuoco i vari livelli del preparato (fochettatura)

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IMMAGINI AL MICROSCOPIO OTTICO

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Sughero 200x

Sambuco 200x

Sughero 200x

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Mucosa 400x Cipolla 100x

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Questione di dimensioni…

1 Å

1 nm

10 nm

100 nm

1 µm

10 µm

100 µm

1 mm

OcchioOcchio umanoumano

MicroscopioMicroscopio otticoottico

cell. epiteliali

globuli rossibatteri

virus

proteine

aminoacidi

atomi

le frecce indicano ille frecce indicano il

potere risolutivopotere risolutivo

massimo di alcuni massimo di alcuni strumenti di osservazionestrumenti di osservazione

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il potere risolutivo

di uno strumento(e non l’ingrandimento)

determina il massimo livello di dettaglio che si può ottenere

nell’immagine

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il microscopioelettronico a trasmissione

filamento(catodo)

anodo

condensatore

preparato

obiettivo

proiettore

schermofluorescente

B

per fortuna es

iste...

per fortuna es

iste...

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m. ottico em. elettronicoa confronto

filamento(catodo)

anodo

condensatore

preparato

obiettivo

proiettore

schermofluorescente

B

condensatore

lampada

preparato

obiettivo

oculare

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Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

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Negli anni 50 si diffonde un potente strumento per l'analisi delle strutture cellulari: il Microscopio Elettronico a Trasmissione (TEM), ideato da Manfred von Ardenne ed Ernst Ruskaed apparso nel 1931. Il TEM sfrutta la disomogeneità di trasparenza agli elettroni dei materiali biologici opportunamente trattati per produrne immagini ingrandite. Con il TEM diviene possibile studiare in dettaglio anche le strutture interne delle cellule

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Microscopioelettronico a scansione

• Risoluzione piu’ bassa rispetto allaME a trasmissione

• Consente di valutare il rilievo deglioggetti

• Usata per lo studio delle superficicellulari

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Il microscopio elettronico a scansione (SEM)

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Nel microscopio SEM il campione da osservare, disidratato e resoconduttivo, è posto in una camera all'interno della quale viene fatto il vuoto. Un fascio di elettroni primari, opportunamente focalizzato da lenti elettroniche, viene inviato sul campione muovendolo, con un sistema generatore di scansione, così da farlo scorrere sulla superficie dell'oggetto in esame. Il fascio di elettroni durante la scansione del campione colpisce la sua superficie generando degli elettroni secondari. La quantità e l'energia degli elettroni secondari retrodiffusi da ogni punto del campione colpito dal fascio elettronico dipendente dalla morfologia, oltre che dalla natura chimica, del campione in quel punto. Un rivelatore di elettroni secondari retrodiffusi provvede a raccogliere il segnale generato da ogni punto del campione durante la sua scansione con il fascio di elettroni primari. Un sistema di generazione dell'immagine acquisisce il segnale fornito dal rivelatore durante la scansione del campione e lo invia su uno schermo, ove viene così tracciata l'immagine del campione esaminato.

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Questione di dimensioni…

1 Å

1 nm

10 nm

100 nm

1 µm

10 µm

100 µm

1 mm

OcchioOcchio umanoumano

MicroscopioMicroscopio otticoottico

MicroscopioMicroscopio elettronicoelettronico

a a trasmissionetrasmissione

cell. epiteliali

globuli rossibatteri

virus

proteine

aminoacidi

atomi

MicroscopioMicroscopio elettronicoelettronico

a a scansionescansione

ll ’’ osservazione di osservazione di diversi livelli di diversi livelli di organizzazione della organizzazione della materia vivente materia vivente richiede l’uso di richiede l’uso di diversi strumentidiversi strumenti

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Immagini di microrganismi al microscopio elettronico a scansione

Un archebatterio: Methanosarcina barkeri

un eubatterio: Streptococcus thermophilus

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Immagini di microrganismi al microscopio elettronico a scansione

microcolonie di lattobacilliin formaggio

un eubatterio: Lactobacillus delbrueckiissp. bulgaricus

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Immagini di microrganismi al microscopio elettronico a scansione

conidiofori di Penicilliumroquefortii in gorgonzola

un eubatterio: Lactobacillusdelbrueckii ssp. bulgaricuscon filamenti di esopolisaccaridi

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alcuni esempi di microscopia elettronica a scansione…

Questa è una zecca

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GLOBULI ROSSI

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Esempio dimicroscopiaelettronica a trasmissione

Le immagini di Le immagini di microscopia elettronica microscopia elettronica sono “in bianco e nero”.sono “in bianco e nero”.

Le parti Le parti “scure” si “scure” si dicono dicono elettrondenseelettrondense..

L’altissimoL’altissimo poterepotererisolutivorisolutivo del ME del ME consenteconsentedidi distingueredistinguerenumerosenumerosecomponenticomponentisubcellularisubcellulari..

Giunzione neuromuscolare

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sezione di placenta al TEM

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Sezione di cellula –sono visibili molti mitocondri

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BATTERI

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Confronto fra immagini di microrganismi al SEM e al TEM

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Grazie alle tecniche di microscopia elettronica si può studiare il cariotipoumano

CROMOSOMI

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sequenza dei passaggi in unatipica procedura istologica

1. fissazione di un campione di tessuto in formaldeide

2. congelamento o inclusione del pezzo

3. taglio al microtomo

4. montaggio su vetrino

5. “bagni” in soluzioni di coloranti

6. disidratazione e coverslippingPage 38 of 50

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• la maggioranza dei tessuti biologici sono molli

La La preparazionepreparazione deldel materialemateriale istologicoistologico

• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito utilizzando sostanze particolari. Le fasi sono quindi:

– Fissazione con aldeidi

– Inclusione

– Congelamento

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Lo scopo dell’inclusione è di rendere il pezzo di consistenza tale da poter essere tagliato

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• la luce del microscopio può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto

• il tessuto deve essere quindi sezionatomediante speciali apparecchi, detti microtomi

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Lo scopo del taglio è quello di affettare il pezzo allo spessore voluto (5-7 µm di norma) in modo da poter ess ere osservato al microscopio dopo opportuna colorazione

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MONTAGGIO

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• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deveessere colorato perchè i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto

• Si usano coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse che possono essere combinati nella stessa sezione istologica

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Le numerosissime sostanze coloranti impiegate in istologia hanno lo scopo di colorare le varie parti della cellula e le sostanze intercellulari, aumentandone il contrasto e favorendone il riconoscimento. Alcuni dei coloranti più comuni sono i seguenti: ematossina ed eosina, ematossina ferrica, blu di metilene, blu di toluoidina, miscela Mallory –Azan, orceina, fucsina acida e basica, Sudan nero e Sudan rosso. Molte sostanze o miscele coloranti colorano in maniera più o meno elettiva i vari componenti della cellula o dei tessuti

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lo strisciodi sangue

Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo “generico” appena delineato perché, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto.

Lo “striscio”, una delle tecniche istologiche più diffuse, consente lo studio microscopico delle cellule del sangue e si distingue dal protocollo “generico” appena delineato perché, ovviamente, non richiede il taglio del tessuto.

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STRISCIO DI SANGUE

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TECNICA A FRESCO

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Microscopia elettronica

• Preparazione del tessuto– Fissazione in glutaraldeide– Postfissazione in tetrossido di osmio– Disidratazione con alcol– Inclusione in plastiche acriliche o resine

epossidiche• Taglio all’ultramicrotomo

– Sezioni di 20-40 nm• Aumento del contrasto

– Coloranti elettronici come acetato diuranile o citrato di piombo

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