MICROBIOLOGIA AMBIENTALE in ACQUACOLTURA · Adattamento della temperatura corporea a quella ......
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MICROBIOLOGIA AMBIENTALE in ACQUACOLTURA
Dott.ssa Piera Anna Martino
DIMEVET – Università degli Studi di Milano
Corso di Perfezionamento
«Benessere dell’animale da laboratorio ed Animal Care (Roditori-Lagomorfi-Specie Acquatiche)»
6 aprile 2018
QUALITA’ DELL’ACQUA
La qualità dell’acqua rappresenta l’elemento più importante per mantenere in salute gli animali
•I pesci sono in grado di adattarsi a cambiamenti nella qualità dell’acqua senza eccessivo stress
•NO cambiamenti rapidi
•Principali parametri dell’acqua, i cui cambiamenti possono causare fluttuazioni ambientali:
– Temperatura, ossigeno, composti dell’N, pH, salinità, durezza
L’ACQUARIO: parametri
TEMPERATURA Adattamento della temperatura corporea a quella
dell’ambiente circostante
Temperatura ottimale per avere la massima efficienza
Temperature molto alte o basse sono pericolose
La temperatura deve essere più costante possibile, con variazioni minime e molto lente
Uso di termoriscaldatori
L’ACQUARIO: parametri
FILTRAZIONE
Acquario sistema biologico isolato
Necessità di un sistema di filtrazione per depurare l’habitat ed evitare l’accumulo di sostanze di rifiuto
Impianti sempre in funzione e con adeguata manutenzione
I filtri devono essere puliti e cambiati o rigenerati
L’ACQUARIO: qualità dell’acqua
DUREZZA
Somma totale delle concentrazioni di calcio e magnesio
Gradi di durezza con definizione non universale
Se la concentrazione di Ca2+ è bassa si ha: Tossicità dell’ammoniaca
Tossicità dei metalli
Mortalità e minore resistenza degli avannotti alle infezioni
SALINITA’
Concentrazione di NaCl
Acque dolci: 0.01 -1 ppt
FATTORI AMBIENTALI
COMPOSTI DELL’AZOTO AMMONIACA
Valore “safe” di ammoniaca non ionizzata: 0.02 mg/L
Aumenta ed è molto tossica in caso di Sovraffollamento
Sovra-alimentazione
FATTORI AMBIENTALI
NITRITI [< 0.1 mg/L]**
Sono il prodotto intermedio di due processi mediati da batteri
1. Nitrificazione (aerobi Nitrosomonas)
2. Denitrificazione (Nitrobacter)
NITRATI [< 1g/L]
Meno tossici
**Aumentano in caso di sovraffollamento, dieta iperproteica, aumento di Nitrosomonas
OSSIGENO
6-15 mg/L
Forte stress immunitario se la concentrazione di O2 diminuisce; morte per ipossia
“Malattia delle bolle di gas” se la concentrazione di O2 aumenta
L’ACQUARIO: qualità dell’acqua
In natura vivono in acqua dolce, poco mosse, con pH ≈ 8
Vivono in piccoli gruppi di 5-20 individui; non hanno cure
parentali; durata della vita di circa 5 anni
Tollerano bene le diverse condizioni ambientali, poiché in
natura vivono in habitat che possono variare in modo
significativo (aree monsoniche)
Se il range non è ottimale però
Necessità di più energia per l’omeostasi, per la crescita, per la
produzione di gameti, per la sopravvivenza e per il
funzionamento del Sistema Immunitario PROBLEMI
Zebrafish
Temperatura
Poichilotermi euritermi con ampio range di tolleranza
termica da 6.7 a 41.7 °C (risposta naturale)
T = 28,5 °C (24-30 °C)
Temperature più elevate possono compromettere il
differenziamento sessuale o la funzionalità cellulare
pH
7-8 come per i pesci di acqua dolce
Durezza
Si tratta di «hard water species» che preferiscono valori > 100 mg/L di CaCO3
Salinità
Tollerano diverse concentrazioni saline
Variabilità tra facilities, ma il range ottimale da
mantenere stabile è 0,25 -0,75 ppt
Ossigeno disciolto
I pesci tropicali come Zebrafish consumano più O2 per unità di peso rispetto ai pesci più grandi
Livello da mantenere: alla saturazione o poco più sotto
(≈ 7,8 mg/L a 28 °C)
LO STATO SANITARIO
Idealmente i pesci “da esperimento” dovrebbero essere free da agenti infettivi e da qualsiasi tipo di stress
Infezioni sub-cliniche sono abbastanza frequenti ma con effetti sui risultati sperimentali spesso ignoti
Elevata influenza dei fattori ambientali
PESCE
PATOGENO AMBIENTE
MALATTIA
PATOLOGIE BATTERICHE
Un management inadeguato dei parametri chimico-fisici ed igienico-sanitari può portare allo sviluppo di infezioni a varia eziologia
I batteri possono essere Patogeni primari Opportunisti
I batteri possono causare lesioni cutanee Direttamente Indirettamente dopo invasione sistemica
I batteri si possono riscontrare nell’acqua
SETTICEMIA EMORRAGICA BATTERICA
È anche conosciuta come “setticemia da Aeromonas mobile”, “bocca rossa”, “peste rossa”, “ulcer disease”
È causata da Aeromonas hydrophila e colpisce tutte le specie di pesci
Batterio Gram-negativo, mobile, con un singolo flagello polare, in grado di crescere anche a 37 °C
Alcuni ceppi possono produrre pigmenti marroni
La diagnosi si basa sulla coltura e l’identificazione del microrganismo
A. hydrophila è stato associato ad un’ampia varietà di condizioni cliniche e può essere isolato anche in presenza di altri patogeni
Patogeno primario o un semplice “invasore” secondario?
Osservazione di risposte chemiotassiche verso il muco dei pesci in alcuni ceppi
Produzione di prodotti extracellulari con attività proteolitica ed emolitica (correlata alla virulenza); enterotossine
Casi individuali o anche epidemie
SETTICEMIA EMORRAGICA BATTERICA
La setticemia emorragica batterica può essere:
Iperacuta con assenza o presenza di sintomi
Acuta con perdita di squame, emorragie focali anche a livello della bocca
Comparsa di ulcere cutanee sul corpo; anemia e danno renale ed epatico
Cronica (più rara)
SETTICEMIA EMORRAGICA BATTERICA
BACTERIAL TAIL ROT
È anche conosciuta come “bacterial fin rot”, pseudomoniasi, setticemia emorragica
È causata da Pseudomonas fluorescens ed ha diffusione ubiquitaria
Batterio Gram-negativo, in grado di crescere tra 22-28 °C, con colonie pigmentate giallo brillante
La diagnosi si basa sulla coltura e l’identificazione del microrganismo
Pseudomonas fluorescens
BACTERIAL TAIL ROT
•Cause predisponenti: •Stress •Bassa temperatura dell’acqua che rappresenta il
serbatoio primario •P. fluorescens può essere sia patogeno primario sia
secondario •Morbilità e mortalità discrete
Erosione della pinna e/o della coda segno cardinale
Comparsa di setticemia
Morte per infezione peracuta
Sopravvivenza anche in presenza di lesioni estese
Presenza di ulcere cutanee, petecchie ed eritema
Assenza di emorragie attorno alle ulcere ≠ infezione da Aeromonas
BACTERIAL TAIL ROT
Erosione della pinna e/o della coda segno cardinale
Comparsa di setticemia
Morte per infezione peracuta
Sopravvivenza anche in presenza di lesioni estese
Presenza di ulcere cutanee, petecchie ed eritema
Assenza di emorragie attorno alle ulcere ≠ infezione da Aeromonas
BACTERIAL TAIL ROT
EDWARDSIELLOSI
Edwardsiella tarda
Gram-negativo, appartenente alle Enterobacteriaceae, è un patogeno intracellulare che cresce in un range tra 30-37 °C
È causa di setticemia generalizzata associata a scarsa qualità dell’acqua e a stress
Trasmissione attraverso l’acqua contaminata a livello di cute, branchie o per via orale
Zebrafish usati anche come modelli sperimentali di questa patologia
EDWARDSIELLOSI
I segni clinici possono includere:
Piccole lesioni cutanee che possono evolvere in ascessi necrotici
Addome disteso e ano gonfio per l’accumulo di liquido ascitico
Depigmentazione
Rene di dimensioni aumentate
Ascessi in organi interni
BACTERIAL GILL DISEASE (BGD)
È anche chiamata “environmental gill disease” poiché è legata al sovraffollamento e a scarsa qualità dell’acqua
Elevata concentrazione di residui organici
Elevata concentrazione di ammoniaca nell’acqua
Stress da trasporto tipico negli Zebrafish
Vari agenti causali appartenenti al gruppo dei gliding bacteria
Flavobacterium columnare, F. branchiophilum
BACTERIAL GILL DISEASE
Eccessiva produzione di muco ed iperplasia dell’epitelio delle branchie
Cute infetta
perdita dello strato epidermico esterno ed esposizione del derma
Infezioni della pinna e coda (fin and tail rot)
AEROCISTITE BATTERICA o INFEZIONI BATTERICHE DELLA VESCICA NATATORIA
Infezione cronica grave sostenuta da più batteri:
Aeromonas hydrophila, Aeromonas spp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas spp., Flexibacter, Flavobacterium
Cause sottostanti ignote
Colonizzazione da parte di batteri intestinali?
Microsporidiosi?
Immunocompromissione?
Stress?
Scarsa qualità dell’acqua?
STREPTOCOCCOSI
Le infezioni da Streptococcus spp. sono ubiquitarie e possono causare elevate mortalità (>50%) in 3-7 gg Anche cronicizzazione con mortalità entro parecchi giorni in
pochi animali
Streptococcus iniae
Stress importante fattore predisponente
Altri stressori: Elevate temperature dell’acqua
Sovraffollamento
Manipolazione
Scarsa qualità dell’acqua
Elevata concentrazione di ammoniaca
Zebrafish usati anche come modelli sperimentali di questa patologia
I pesci colpiti possono presentare diversi segni clinici che progrediscono rapidamente, oltre a mortalità: Emorragie nell’occhio o attorno, a livello branchiale o alla
base delle pinne
Esoftalmia (“pop-eye”)
Alterazioni nel nuoto
Ulcerazioni
Identificazione: mediante colorazione di Gram di impronte con
l’osservazione di tipiche catenelle Gram-positive
coltura e identificazione di streptococchi
STREPTOCOCCOSI
Forte iperemia alla base delle pinne pettorali
Tipiche catenelle di streptococchi da liquido peritoneale dopo colorazione di Gram
MICOBATTERIOSI
Infezioni croniche sistemiche sostenute da Mycobacterium spp.
M. marinum, M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum, M. peregrinum, M. haemophilum
Forme croniche con bassi livelli di mortalità ma anche infezioni acute con gravi epizoozie
perché queste diverse manifestazioni?
elevata virulenza dei ceppi
immunodepressione
M. chelonae
Struttura della parete dei micobatteri
Lo strato degli acidi micolici (cere) rappresenta il 60% del peso secco
MICOBATTERIOSI
I cambiamenti clinici e macroscopici sono variabili ma il segno tipico è la comparsa di noduli bianchi multipli = granulomi negli organi viscerali
Negli Zebrafish si ha anche un calo delle performances riproduttive accompagnato da edema generalizzato con addome rigonfio e ulcere cutanee
Micobatteri in macrofagi. Colorazione di Ziehl-Neelsen
Granulomi multipli a livello renale
(macchie biancastre)
Macrofagi con melanina
MICOBATTERIOSI
DIAGNOSI
Osservazione di macrofagi “ripieni” di batteri colorabili con la colorazione per alcool-acido resistenti (Ziehl-Neelsen)
Difficile crescita in coltura
PCR utile per lo screening di infezioni latenti/subcliniche
Infezione diffusa in Zebrafish. Massiccia proliferazione di fagociti nei visceri con distribuzione diffusa di batteri (frecce).
P = pancreas Colorazione di Ziehl-Neelsen
PROFILASSI E TERAPIA
Attenzione ad un corretto management Mantenimento di una buona qualità dell’acqua, con
ricambi d’acqua al 5-10 %/die;
Immediata rimozione dei pesci morti;
Manipolazione prima dei pesci sani rispetto ai malati;
Uso di cibo pathogen-free quando possibile;
Accurata disinfezione di tutta la strumentazione e dei devices utilizzati ogni volta;
Pulizia dell’ambiente;
Quarantena in apposite vasche per almeno 3 settimane;
Accesso limitato ai soli autorizzati nelle aree «pulite»
PROFILASSI E TERAPIA
• Trattamento antibiotico • Uso appropriato, se possibile, di diversi antibiotici:
• Ossitetraciclina
• Eritromicina
• Fluorchinoloni
• Terapie antibiotiche con dosaggi adeguati e giusta tempistica
• Attenzione ad alcuni parametri dell’acqua: pH, durezza, temperatura
• Attenzione ai batteri del ciclo dell’azoto
PROFILASSI E TERAPIA
• Trattamento con disinfettanti • Verde malachite
• (cancerogeno potenziale e teratogeno/mutageno; no in USA)
• Formaldeide 37% (fungicida registrato negli USA)
• Perossido di idrogeno (con minimo impatto ambientale)
• Cloruro di sodio (NaCl)
• Acqua salata: 29 g/L
• Acqua dolce: 15 g/L
RISCHIO ZOONOSICO
EDWARDSIELLOSI
Edwardsiella tarda
È causa di gravi malattie enteriche (gastroenteriti) ma anche di meningite, ascessi epatici, infezioni di ferite
Il rischio zoonosico legato a Teleostei infetti è piuttosto limitato anche se è indispensabile,
durante la manipolazione, indossare guanti protettivi
RISCHIO ZOONOSICO
STREPTOCOCCOSI
Streptococcus iniae
Primo caso nel 1991 in Texas; secondo caso nel 1994 in Canada
Comparsa di cellulite alle mani con febbre
Rischio minimo nelle persone sane
Rischio elevato in immunocompromessi
Attenzione durante la manipolazione dei pesci
RISCHIO ZOONOSICO
MICOBATTERIOSI
In genere si tratta di infezioni che non mettono a rischio la vita se non in soggetti immunocompromessi
Attenzione durante la manipolazione dei pesci
Infezione localizzata alle estremità dove la temperatura è più bassa
Mycobacterium marinum
swimming pool granuloma