Non solo il Gradiente Morfogenetico (una molecola diffusibile agisce secondo un gradiente di...

Non solo il Gradiente Morfogenetico (una molecola diffusibile agisce secondo un

gradiente di concentrazione) può spiegare il differenziamento cellulare a seguito

dell’esposizione alla fonte di activina.

1.Cascata di reazioni di amplificazione: l’activina agisce solo a concentrazioni

elevate, inducendo il differenziamento SOLO delle cellule immediatamente adiacenti alla

fonte. Tali cellule emettono un secondo segnale, che induce il differenziamento delle

cellule adiacenti, e così via. Tale ipotesi è stata verificata (ed esclusa) interponendo uno

strato di cellule insensibili all’activina tra l’emisfero animale (in grado di rispondere) e la

fonte di activina.

2.Migrazione cellulare: l’activina induce nelle cellule immediatamente adiacenti, oltre

al differenziamento, anche migrazione cellulare; le cellule differenziate si ritrovano quindi

a grande distanza dalla fonte di activina dalla quale son partite. Tale ipotesi è stata

verificata (ed esclusa) colorando in modo differente le cellule:

Le cellule competenti per la risposta

all’activina hanno circa 500 recettori activina-

specifici sulla loro superficie cellulare.

Se i recettori complessati dall’activina sono

tra 100 e 300, viene trascritto il gene bra, e

le cellule differenziano verso un destino

mesodermico ventrale. Se il numero di

recettori complessati è più alto, allora viene

attivato gsc, che porta a differenziamento in

senso mesodermico dorsale.

Specificazione sinciziale (insetti). Segmentazione superficiale. Blastoderma

sinciziale

specificazione

Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO

Specificazione sinciziale (insetti).

specific. sinciziale

Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO

Gradienti morfogeneticidelle proteine bcd e nos

mRNA localizzatiasimmetricamente

Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

© 2005

mRNA bicoid

proteina bicoid

mRNA bicoid anterioremRNA nanos posterioremRNA hunchback e caudal distribuiti uniformemente.

Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli

editore S.p.A. Copyright © 2005

Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

(NRE)

(pum)

(pum)

equivalenza del genoma

Tutte le cellule dell’organismo hanno

effettivamente lo stesso identico genoma?

Oppure il patrimonio genetico della cellula

ormai differenziata ha subito delle

modificazioni funzionali irreversibili?

Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli

editore S.p.A. Copyright © 2005


Hans Spemann e la Teoria del Trasferimento Nucleare

1938: una cellula già terminalmente differenziata è in grado

di riprogrammare l'informazione in termini di espressione

genica e di controllare lo sviluppo embrionale? Spemann

propose di prelevare il nucleo da una cellula di un embrione in

avanzata fase di sviluppo e trasferirlo nel citoplasma di una

cellula uovo enucleata. Spemann non pote' condurre

l'esperimento per la mancanza di strumenti adatti alla

manipolazione e dissezione delle cellule somatiche e

germinali.

equivalenza del genomaexp. Robert Briggs e Tom J. King, 1952

Rana pipiens

Briggs e King pongono le basi sperimentali (creano quegli strumenti

che erano mancati a Spemann 14 anni prima quando elaborava la

teoria del Trasferimento Nucleare) per fornire le risposte ai quesiti

di quegli anni:

(?) Il nucleo di una cellula differenziata conserva ancora tutte le

informazioni originarie; inoltre, tale nucleo risulta riprogrammabile ed

in grado di originare un nuovo individuo.

(?) La sinergia tra il citoplasma ospite dell’uovo e il nucleo che in esso

viene rilocato è sufficiente a riattivare il nucleo a dirigere lo sviluppo

del nuovo individuo.


equivalenza del genoma1962: J. Gurdon ritenta l'esperimento di

Briggs e King, usando nuclei di cellule

differenziate d'intestino di girino di

Xeanopus laevis. 1.4 la % di successo a

girino. Utilizzando il trapianto in serie - il

nucleo viene trapiantato nell’uovo che

viene lasciato sviluppare fino a blastula. Il

nucleo della cellula di blastula si

trasferisce in un altro uovo enucleato e

così via - ottenne un successo del 7%

comprendente 7 rane adulte fertili.

Gurdon dimostra che i nuclei di cellule

somatiche differenziate, trasferiti nel

citoplasma di un uovo enucleato,

modificano il proprio programma

genetico.

1997: I. Wilmut e collaboratori clonano il primo

mammifero.

Prelievo cellule somatiche da ghiandola

mammaria di adulto (razza Finn-Dorset).

Coltura cellulare e arresto in G1 (le cellule,

2n, son quindi sincronizzate).

Oociti dalla donatrice (razza Scottish blackface)

in seconda metafase meiotica enucleati.

Fusione cellulare somatica/oocito e attivazione

dell’oocito stesso mediante impulsi elettrici.

Trasferimento in utero di pecora gravida.

% di successo: 1/434 oociti impiantati = Dolly.

Dimostrazione della totipotenza del nucleo dei

mammiferi: il genoma rimane inalterato e

capace di differenziare in tutti i tipi cellulari.



(TATA binding protein)

Fatto

ri bas

ali d

i tra

scriz

ione

variazioni epigeneticheModifica ereditabile (quindi trasmissibile alla progenie), che può riguardare un

cromosoma o l’attività di un gene, che non varia la sequenza nucleotidica.

Es: metilazione del DNA

Nei vertebrati la metilazione interessa solamente la Citosina sul dinucleotide CpG ad

opera di enzimi DNA-metiltransferasi (Dnmt) che aggiungono un gruppo metile al C5

della citosina: il risultato è la 5-metilcitosina. Il 3-5% circa delle C risulta metilato in

cellule eucariotiche

Lo schema di metilazione viene mantenuto ad opera di DNA-metil transferasi di

mantenimento, che hanno particolare affinità per le sequenze emi-metilate:

tendono quindi a metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo

metilato.

metilazione del DNA


© 2005

Globina embrionale gene attivo nell’embrione,

inattivo nel feto

Globina fetale gene inattivo nell’embrione, attivo

nel feto


Istone acetiltransferasi (HAT) trasferiscono gruppi acetile agli istoni del nucleosoma,

che viene così destabilizzato consentendo la trascrizione del gene. I fattori di

trascrizione sono spesso in grado di reclutare le HAT o sono essi stessi delle HAT.

Istone deacetilasi > reazione ‘inversa’ con conseguente stabilizzazione dello stato

trascrizionalmente inattivo del gene. Vengono anche reclutate dalle regioni metilate.

anfibi

• Facili da mantenere

• Iniezione di ormone

• Uova grosse e manipolabili

• Sviluppo embrionale piuttosto rapido

anfibi

solco di segmentazione

gastrulazioneLa gastrulazione in Xenopus ha inizio nella regione della semiluna grigia (futuro

lato dorsale dell’embrione)

Lo spermatozoo è importante nel determinare non il movimento in sé, quanto il

senso della rotazione del citoplasma corticale. Un uovo artificialmente attivato

ruota ancora il suo citoplasma, ma in direzione non prevedibile.

anfibi

Il citoplasma ruota grazie alla presenza di un apparato di microtubuli che si

forma, al polo vegetativo, tra il citoplasma corticale e quello interno. Tale

apparato compare appena prima della rotazione e scompare subito dopo.

anfibi - segmentazioneUova mesolecitiche (quantità modesta di vitello al polo vegetativo), segmentazione

oloblastica (totale) ineguale con simmetria radiale

solco di segmentazione

1. Permette la migrazione cellulare durante i massivi movimenti della gastrulazione

2. Impedisce il contatto – quindi l’interazione – tra le cellule.

emisfero (calotta) animale

Nieuwkoop (1973)

blastocele

anfibi - segmentazione

Morula (16-64 cellule) Blastula (128 cellule)

Blastocele (cavità)

oligonucleotidi antisenso anti-EP-caderina.

Heasman et al, 1994

controllo oligonucleotidi antisenso anti-EP-caderina

Heasman et al, 1994

blastocele

gastrulazione

gastrulazioneLa blastula deve ridistribuire le cellule/aree in modo tale da portare verso l’interno

quelle (cellule/aree) che daranno origine alle strutture endodermiche, verso

l’esterno quelle che origineranno il rivestimento dell’organismo e interporre a

questi due “blocchi“ le cellule/aree con destino mesodermico.

Løvtrup (1975), Landstrom & Løvtrup (1979), Keller (1975, 1976)

anfibi

localizzazione RNA materni

1. l’mRNA deve essere trasportato al polo vegetativo.

2. l’mRNA deve essere ancorato al polo vegetativo.

localizzazione RNA materni

Vg1LE (Vg1 localization element), una sequenza di circa 350 nucleotidi localizzata nella

regione 3´UTR (untranslated region) dell’mRNA di Vg1 mRNA, necessaria affinchè il

messaggero localizzi al polo vegetativo dell’uovo. Vg1LE è una sequenza zipcode

(C.A.P.). Vg1LE viene complessata da almeno 6 proteine, 2 sole delle quali note,

Vg1RBP/Vera e VgRBP60. Omologhi di Vera funzionano come localizzatori di mRNA

anche in altri sistemi (es. pollo).

Piccoli RNA non tradotti (Xlsirt) sono essenziali per l’associazione dell’mRNA Vg1 con

la cell cortex del polo vegetativo, ma non per il trasporto. Essi contengono stretch

complementari al mRNA per Vg1 e ne mediano l’associazione con la corticale.

localizzazione RNA materni Vg1RBP/Vera A

V

Vg1RBP/Vera colocalizza con il mRNA di Vg1 ed è necessario per la sua corretta localizzazione al polo vegetativo dell’uovo

polarità dell’uovoLa prova sperimentale dell’imposizione di una polarità all’uovo di Xenopus da parte

di determinanti citoplasmatici viene dall’ablazione dei mRNA codificanti per tali

determinanti, VegT (Zhang et al, 1998) e Vg1 (Joseph & Melton, 1998).

La mancanza di VegT e Vg1 altera la distribuzione delle cellule nei tre foglietti

embrionali.


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