Metodi per lo studio dell’espressione genica su larga scala:

ESTs SAGE Microarray

MICROARRAYSAGEEST

Computational analysis of data by statistical methods

ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE

• Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico

• L’espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali

• In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo e’ attivo solo un sottoinsieme di geni

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

• Puo’ agire su ciascuno dei livelli che caratterizzano il passare dell’informazione genica dal DNA alle proteine

• Negli Eucarioti superiori la regolazione dell’espressione genica si svolge principalmente come controllo della trascrizione

• Principali tipi di regolazione:Controllo epigeneticoControllo trascrizionaleControllo post-trascrizionale

“One-gene approach”Il gene di interesse e’ espresso in un tessuto o in un dato momento dello sviluppo ? Quanto e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ?

Profilo d’espressione del genoma(TRASCRITTOMA)

Quali geni sono espressi in un tessuto ed in un dato momento dello sviluppo ?Quanto ciascuno di essi e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ?

“Large-scale approach”

Real Time PCRPCR semiquantitativaIbridazione DNA genico o cDNA con RNA

totale o poly(A)+RNA (Northern blot)Ibridazione in situ

METODI PER LO STUDIO SU LARGA SCALA DELL’ESPRESSIONE GENICA

Sequenziamento sistematico di ESTs da librerie di cDNA

SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)

cDNA microarrays

mRNA of different genes

cDNA LIBRARY

EST SEQUENCING EST

ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE

Sample of 12919 ESTs corresponding to 4460 genes/trascripts

eg. Rhodopsin:

65 retina ESTs 65 / 12919 = 0.503%

UniGene Human Release Statistics

Total sequences in clusters: 3115711

Total number of clusters sets: 95928

22094 sets contain at least one known gene

94710 sets contain at least one EST

20876 sets contain both genes and ESTs

EST

EST

EST

SAGE Serial Analysis of Gene Expression

SAGE è un metodo sperimentale ideato per utilizzare i vantaggi del sequenziamento su larga scala per avere informazioni quantitative di espressione genica (Velculescu et al. 1995, Zhang et al, 1997)

Con questa tecnica e’ possibile stimare il livello d’espressione di ciascun gene, attraverso la misura del numero di volte in cui la TAG che lo rappresenta compare in un campione abbastanza grande di TAGs sequenziate a partire dal messaggero del tessuto in analisi

Tag to Gene mapping Gene to Tag mapping

Consiste nel sequenziamento da messaggeri cellulari di brevi oligonucleotidi, che fungono da etichette di sequenza (TAG)

SAGE

Iso lam ento de lle “ tag”

L igaz ione

Sequenziam ento

Q u an tificazione d i c iascuna“tag” e determ inazione del pattern d i esp ressione

Liv

ello

di

esp

ress

ione

Liv

ello

di

esp

ress

ione

G E N E

A lte r a toG E N E

N orm ale

Iso lam ento de lle “ tag”

L igaz ione

Sequenziam ento

Q u an tificazione d i c iascuna“tag” e determ inazione del pattern d i esp ressione

Liv

ello

di

esp

ress

ione

Liv

ello

di

esp

ress

ione

G E N E

A lte r a toG E N E

N orm aleG E N EN o rm a le

G E N EA lter ato

una sequenza di 9 paia di basi permette di identificare 49 (262144) diversi trascritti (una "tag" viene ottenuta da una posizione specifica di ogni trascritto).

le "tag" possono essere unite insieme in serie, a costituire lunghe molecole di DNA, che vengono clonate e sequenziate.

il numero di volte in cui una singola "tag" viene osservata permette di quantificare l'abbondanza del messaggero identificato nella popolazione dei messaggeri e, indirettamente, il livello di espressione del gene corrispondente.

SAGE

Esperimenti di Microarray

Permettono l’analisi dell’espressione di migliaia di geni simultaneamente

MICROARRAY

MICROARRAY

GeneChip Affymetrix

Ibridizzazione della sonda marcata Scansione del GeneChip con scanner laser

Analisi dell’immagine

• Identificazione della posizione degli spot

• Costruzione di un’area locale intorno ad ogni spot

• Calcolo dell’intensità di ogni singolo spot

• Calcolo del background locale

MICROARRAY

Elaborazione dei datiMICROARRAY

MICROARRAYSAGEEST

Matrice dei risultati con più condizioni sperimentali

Cond. 1 Cond. 2 … Cond. m

Gene 1 x11 x12 … x1m

Gene 2 x21 x22 … x2m

… … … … …

Gene n xn1 xn2 … xnm

• Quali geni sono differenzialmente espressi ? • Quali e quanti geni sono coespressi?

Obiettivi dell’analisi saranno…

Identificazione geni differenzialmente espressi

Identificazione pattern di espressione comuni

Identificazione di geni coespressi con geni di funzione nota

CLUSTER ANALISI

Identificazione di gruppi di geni con profili di espressione similisimili

Simili rispetto a cosa ?

Definizione di distanzadistanza

I geni sono punti nello spazio:

punti vicini nello spazio sono raggruppati insieme

DUE STEPS:

Misura di similarita’• Diverse misure• Standardizzazione dei dati

Linking method• criterio per stabilire i gruppi• Metodi gerarchici e non gerarchici

CLUSTER ANALISI