Nanotecnologie a DNA: analisi di espressione genica tramite microarray e sue applicazioni in ambito...

Nanotecnologie a DNA: Nanotecnologie a DNA: analisi di espressione genica analisi di espressione genica

tramite microarray e tramite microarray e sue applicazioni in ambito biomedicosue applicazioni in ambito biomedico

La tecnica dei microarray utilizzata nel monitoraggio La tecnica dei microarray utilizzata nel monitoraggio dell’espressione genica, è stata descritta per la prima volta nel dell’espressione genica, è stata descritta per la prima volta nel 1994 da Drmanac 1994 da Drmanac et al. et al. che utilizzò target radioattivi ibridizzati a che utilizzò target radioattivi ibridizzati a probe di cDNA immobilizzati su filtro.probe di cDNA immobilizzati su filtro.

Nel 1995 Schena Nel 1995 Schena et al.et al. per primo descrisse l’ibridizzazione di per primo descrisse l’ibridizzazione di target marcati con due fluorescenti diversi a probe di cDNA target marcati con due fluorescenti diversi a probe di cDNA stampati su una superficie di vetro. stampati su una superficie di vetro.

Cenni storiciCenni storici

LL’impiego di una superficie di vetro in sostituzione alla membrana di ’impiego di una superficie di vetro in sostituzione alla membrana di nylon (comunemente utilizzata per Northern e Southern Blot), nylon (comunemente utilizzata per Northern e Southern Blot), presentava infatti una serie di vantaggi:presentava infatti una serie di vantaggi:• il vetro è uil vetro è un materiale duraturo, stabile ad alte temperature e a n materiale duraturo, stabile ad alte temperature e a lavaggi ad alta concentrazione ionicalavaggi ad alta concentrazione ionica• è un materiale non poroso e consente di ridurre al minimo il volume è un materiale non poroso e consente di ridurre al minimo il volume di ibridizzazionedi ibridizzazione• non contribuisce significativamente al background essendo non contribuisce significativamente al background essendo materiale scarsamente fluorescentemateriale scarsamente fluorescente• consente l’ibridizzazione simultanea con due diversi fluorocromi (gli consente l’ibridizzazione simultanea con due diversi fluorocromi (gli array su nylon venivano utilizzati con un fluorocromo per array su nylon venivano utilizzati con un fluorocromo per ibridizzazione)ibridizzazione)

Cenni storiciCenni storici

La tecnologia Microarray permette l’analisi simultanea di migliaia di La tecnologia Microarray permette l’analisi simultanea di migliaia di

geni, in seguito a ibridizzazione di cDNA o cRNA marcati ad un geni, in seguito a ibridizzazione di cDNA o cRNA marcati ad un

substrato contenente migliaia di cDNA o oligonucleotidisubstrato contenente migliaia di cDNA o oligonucleotidi

L’intensità di fluorescenza rilevata per ogni spot gene-specifico, è L’intensità di fluorescenza rilevata per ogni spot gene-specifico, è

correlata all’ammontare di mRNA presente nel campione originariocorrelata all’ammontare di mRNA presente nel campione originario

Studio dell’Espressione Genica Studio dell’Espressione Genica ad Alta Risoluzionead Alta Risoluzione

Il disegno sperimentale di esperimenti di microarray richiede speciale attenzione, Il disegno sperimentale di esperimenti di microarray richiede speciale attenzione, perché piccole variazioni delle condizioni possono indurre cambiamenti perché piccole variazioni delle condizioni possono indurre cambiamenti significativi nell’espressione genica.significativi nell’espressione genica.

Possibili fonti di variabilità:Possibili fonti di variabilità:• prelievo e conservazione del tessutoprelievo e conservazione del tessuto• estrazione e conservazione dell’RNAestrazione e conservazione dell’RNA• metodo di amplificazione del cDNAmetodo di amplificazione del cDNA• marcaturamarcatura• condizioni di ibridizzazione (ibridizzazione non specifica) e lavaggicondizioni di ibridizzazione (ibridizzazione non specifica) e lavaggi• differenze genetiche tra i campioni differenze genetiche tra i campioni

In generale la variabilità biologica rappresenta la maggiore fonte di variazione In generale la variabilità biologica rappresenta la maggiore fonte di variazione negli esperimenti di espressione genica. L’aumento del numeri di campioni e negli esperimenti di espressione genica. L’aumento del numeri di campioni e l’utilizzo di controlli adeguati possono aiutare ad individuare il grado di variabilità l’utilizzo di controlli adeguati possono aiutare ad individuare il grado di variabilità in un esperimento.in un esperimento.Variazioni dovute a fattori tecnici possono essere monitorate attraverso i replicati Variazioni dovute a fattori tecnici possono essere monitorate attraverso i replicati sperimentali.sperimentali.

Disegno sperimentaleDisegno sperimentaleFonti di variabilitàFonti di variabilità

Disegno sperimentaleDisegno sperimentalemRNA qualità ed omogeneitàmRNA qualità ed omogeneità

La fonte di RNA oggetto di studio dovrebbe essere isolata da unaLa fonte di RNA oggetto di studio dovrebbe essere isolata da unapopolazione popolazione omogeneaomogenea di cellule, trattate in modo da preservarne la di cellule, trattate in modo da preservarne la qualitàqualità

Le linee cellulari soddisfano nel modo migliore questo criterio, poichè siLe linee cellulari soddisfano nel modo migliore questo criterio, poichè sioriginano per espansione clonaleoriginano per espansione clonale

Tessuti umani o animali sono più difficili da studiare per possibile perdita di Tessuti umani o animali sono più difficili da studiare per possibile perdita di omogeneitàomogeneitàIn sezioni di tumore infatti, la popolazione cellulare può essere facilmenteIn sezioni di tumore infatti, la popolazione cellulare può essere facilmenterappresentata da una miscela di cellule tumorali e normali, comprendentirappresentata da una miscela di cellule tumorali e normali, comprendenticellule infiammatorie e del tessuto connettivocellule infiammatorie e del tessuto connettivo

Importante è anche la qualità dell’RNA estratto, che non deve essereImportante è anche la qualità dell’RNA estratto, che non deve esserecontaminato da DNA genomico e proteine e deve essere conservato nel modocontaminato da DNA genomico e proteine e deve essere conservato nel modoadeguato per evitarne la degradazioneadeguato per evitarne la degradazione

1.1. Microarray spottatiMicroarray spottati: DNA a singolo o doppio filamento pre-sintetizzati : DNA a singolo o doppio filamento pre-sintetizzati

sono fissati su vetrini. I geni sono rappresentati da singoli frammenti, sono fissati su vetrini. I geni sono rappresentati da singoli frammenti,

aventi dimensioni tra 50 e diverse centinaia di paia di basiaventi dimensioni tra 50 e diverse centinaia di paia di basi

2.2. Array di oligonucleotidi ad alta densitàArray di oligonucleotidi ad alta densità: set di oligomeri sintetizzati : set di oligomeri sintetizzati

in situ su un supporto di vetro mediante un processo di fotolitografia. I in situ su un supporto di vetro mediante un processo di fotolitografia. I

geni sono rappresentati da 10 - 20 diversi oligonucleotidi di 25 paia di geni sono rappresentati da 10 - 20 diversi oligonucleotidi di 25 paia di

basi (Tecnologia Affymetrix)basi (Tecnologia Affymetrix)

Due tipi diversi di tecnologia microarrayDue tipi diversi di tecnologia microarray

Microarray a DNA spottatoMicroarray a DNA spottatoProduzioneProduzione

Il DNA spottato viene definito “Il DNA spottato viene definito “probeprobe” ”

I probe vengono scelti sia da database (I probe vengono scelti sia da database (GenBank, dbEST and GenBank, dbEST and UniGeneUniGene), sia da librerie di cDNA o EST, e collezioni di cloni), sia da librerie di cDNA o EST, e collezioni di cloni

Gli array a DNA possono essere fabbricati usando:Gli array a DNA possono essere fabbricati usando:•Oligonucleotidi (50-120 pb)Oligonucleotidi (50-120 pb)•cDNA amplificatocDNA amplificatoI probe per array di cDNA sono generalmente prodotti di PCR (0.6-2.4 I probe per array di cDNA sono generalmente prodotti di PCR (0.6-2.4 kb), ottenuti amplificando sequenze geniche mediante primers vettore kb), ottenuti amplificando sequenze geniche mediante primers vettore specifici, e successivamente stampati come ds-cDNA su vetrini in specifici, e successivamente stampati come ds-cDNA su vetrini in posizioni predefinite (spot)posizioni predefinite (spot)


Gli spot (sia oligonucleotidi che cDNA) sono di circa Gli spot (sia oligonucleotidi che cDNA) sono di circa 150 150 mm, e sono , e sono tutti alla stessa distanza tra loro. Più di tutti alla stessa distanza tra loro. Più di 30,000 cDNAs30,000 cDNAs possono essere possono essere posizionati sulla superficie di un comune vetrino da microscopioposizionati sulla superficie di un comune vetrino da microscopio

Prima dello spottaggio, il vetrino deve essere trattato in modo che Prima dello spottaggio, il vetrino deve essere trattato in modo che esponga sulla superficie molecole con cariche positive (Es. polilisina)esponga sulla superficie molecole con cariche positive (Es. polilisina)

Le molecole di DNA che vengono depositate sul vetrino durante lo Le molecole di DNA che vengono depositate sul vetrino durante lo spottaggio, vengono successivamente UV-crosslinkate alle cariche spottaggio, vengono successivamente UV-crosslinkate alle cariche positive del vetrinopositive del vetrino

Microarray a DNA spottatoMicroarray a DNA spottatoLegame competitivoLegame competitivo

L’RNA estratto da tessuto o linea cellulare è utilizzato per generare il L’RNA estratto da tessuto o linea cellulare è utilizzato per generare il ““targettarget” marcato, che viene poi ibridizzato con i probe immobilizzati ” marcato, che viene poi ibridizzato con i probe immobilizzati sul vetrinosul vetrino

Questo tipo di tecnologia in genere prevede l’ibridizzazione Questo tipo di tecnologia in genere prevede l’ibridizzazione contemporanea su ogni vetrino di due cDNA marcati, generati da due contemporanea su ogni vetrino di due cDNA marcati, generati da due diversi campioni di RNA (confronto tra campione e controllo)diversi campioni di RNA (confronto tra campione e controllo)

L’utilizzo di diverse molecole fluorescenti (Cy3 e Cy5) permette di L’utilizzo di diverse molecole fluorescenti (Cy3 e Cy5) permette di

marcare i due cDNA con colori diversi; in questo modo è possibile marcare i due cDNA con colori diversi; in questo modo è possibile

miscelarli e ibridizzarli sullo stesso vetrino. Si parla di “miscelarli e ibridizzarli sullo stesso vetrino. Si parla di “ legame legame

competitivocompetitivo” dei target ai probe” dei target ai probe

Microarray a DNA spottatoMicroarray a DNA spottato Disegno sperimentale: scelta dell’RNA di controlloDisegno sperimentale: scelta dell’RNA di controllo

I diversi campioni di un set sperimentale devono essere ibridizzati conI diversi campioni di un set sperimentale devono essere ibridizzati conlo stesso controllolo stesso controllo

L’RNA di controllo deve essere correlato al campione sperimentaleL’RNA di controllo deve essere correlato al campione sperimentale

Per esperimenti Per esperimenti in vitroin vitro il controllo può essere RNA estratto da cellule il controllo può essere RNA estratto da cellulenon trattate, ecc…non trattate, ecc…

Per campioni di pazienti, si può utilizzare l’RNA del tessuto normalePer campioni di pazienti, si può utilizzare l’RNA del tessuto normalecorrispondentecorrispondente

Se viene analizzato un largo numero di campioni, il controllo puòSe viene analizzato un largo numero di campioni, il controllo puòconsistere in una miscela di tutti i campioni usaticonsistere in una miscela di tutti i campioni usati

Microarray a DNA spottatoMicroarray a DNA spottatoDisegno sperimentale: numero di replicati e ibridizzazione Disegno sperimentale: numero di replicati e ibridizzazione

La marcatura dei target con diverse molecole fluorescenti può produrre una La marcatura dei target con diverse molecole fluorescenti può produrre una differente efficienza di incorporazione. Quindi è importante avere:differente efficienza di incorporazione. Quindi è importante avere:

• La marcatura reciproca dello stesso campione con entrambi i fluorescentiLa marcatura reciproca dello stesso campione con entrambi i fluorescenti

• Repliche dei campioni di esperimenti diversi, da utilizzare come controllo Repliche dei campioni di esperimenti diversi, da utilizzare come controllo per la variabilità sperimentaleper la variabilità sperimentale

• Più di una ibridizzazione: replicati su vetrini diversiPiù di una ibridizzazione: replicati su vetrini diversi

Cy3- Cy3- Cy3- Cy3- Cy3- Cy3- Cy3- Cy3- Cy5- Cy5- Cy5- Cy5- Cy5- Cy5- Cy5- Cy5-

Microarray a DNA spottatoMicroarray a DNA spottato Marcatura del target e ibridizzazioneMarcatura del target e ibridizzazione

Hybridisation

SampleRNA

ControlRNA

Wash

Scan 1 Scan 2

Image 1 Image 2

Combined image in software

• L’RNA totale (circa 20 L’RNA totale (circa 20 g) dei due g) dei due campioni da ibridizzare viene campioni da ibridizzare viene retrotrascritto e il cDNA marcato retrotrascritto e il cDNA marcato rispettivamente con rispettivamente con Cy3 (verde)Cy3 (verde) e e Cy5 Cy5 (rosso)(rosso)

• Controllo e campione vengono uniti in Controllo e campione vengono uniti in un’unica miscela di ibridizzazione e il un’unica miscela di ibridizzazione e il vetrino posto in camera di ibridazione vetrino posto in camera di ibridazione overnightovernight

• Il vetrino viene lavato e la fluorescenza Il vetrino viene lavato e la fluorescenza emessa da ogni target è rilevata dallo emessa da ogni target è rilevata dallo scannerscanner

• Il rapporto tra le intensità dei segnali Il rapporto tra le intensità dei segnali rilevati nei due canali (rilevati nei due canali (RR//VV) rappresenta ) rappresenta una misura dell’ammontare relativo di una misura dell’ammontare relativo di specifici mRNA in ogni campionespecifici mRNA in ogni campione

Microarray a DNA spottatoMicroarray a DNA spottato Marcatura del target e ibridizzazioneMarcatura del target e ibridizzazione

Problemi relativi all’ibridizzazioneProblemi relativi all’ibridizzazione::

• diversa incorporazione dei nucleotidi marcati nei vari campioni con la diversa incorporazione dei nucleotidi marcati nei vari campioni con la marcatura diretta marcatura diretta la la marcatura indirettamarcatura indiretta separa la fase di separa la fase di retrotrascrizione da quella di marcatura, consentendo retrotrascrizione da quella di marcatura, consentendo un’incorporazione più omogenea degli uracili che legano i fluorocromiun’incorporazione più omogenea degli uracili che legano i fluorocromi

• carenza di RNA di partenza carenza di RNA di partenza è possibile introdurre uno step iniziale è possibile introdurre uno step iniziale che consente di che consente di amplificare l’RNAamplificare l’RNA mediante l’utilizzo di un enzima mediante l’utilizzo di un enzima specificospecifico

• instabilità delle cianine in funzione dei livelli di ozono instabilità delle cianine in funzione dei livelli di ozono esistono in esistono in commercio dei commercio dei dye-saverdye-saver che proteggono i fluorocromi che proteggono i fluorocromi

Microarray a DNA spottatoMicroarray a DNA spottato Scannerizzazione del vetrinoScannerizzazione del vetrino

Microarray a DNA spottatoMicroarray a DNA spottato BackgroundBackground

Una buona ibridizzazione deve essere caratterizzata da Una buona ibridizzazione deve essere caratterizzata da alta specificitàalta specificità e e basso backgroundbasso background. Purtroppo è molto facile in ogni step della procedura . Purtroppo è molto facile in ogni step della procedura introdurre segnale aspecifico (lo stesso vetrino può avere fluorescenza introdurre segnale aspecifico (lo stesso vetrino può avere fluorescenza intrinseca aspecifica). intrinseca aspecifica).

Per migliorare il segnale:Per migliorare il segnale:

• lavorare con lavorare con materiali pulitimateriali puliti e privi di fluorescenza intrinseca e privi di fluorescenza intrinseca

• ridurre i legami aspecifici del target al probe utilizzando (ridurre i legami aspecifici del target al probe utilizzando (bloccaggiobloccaggio con con anidride succinica del vetrino spottato, anidride succinica del vetrino spottato, preibridizzazionepreibridizzazione con BSA) con BSA)

• introdurre durante l’ibridizzazione introdurre durante l’ibridizzazione molecole che competonomolecole che competono con il target per con il target per rendere i legami più specificirendere i legami più specifici

• fare fare lavaggi accuratilavaggi accurati del vetrino prima della scannerizzazione, per evitare il del vetrino prima della scannerizzazione, per evitare il deposito di sali sulla superficiedeposito di sali sulla superficie

Array di oligonucleotidi ad alta densitàArray di oligonucleotidi ad alta densitàFotolitografiaFotolitografia

AArray di oligonucleotidirray di oligonucleotidi

GeneChip (GeneChip (AffymetrixAffymetrix) sono ) sono

costruiti utilizzando un processo di costruiti utilizzando un processo di

sintesi di luce-diretta chiamato sintesi di luce-diretta chiamato

fotolitografiafotolitografia

Linker sintetici modificati con Linker sintetici modificati con

gruppi protettivi rimuovibili gruppi protettivi rimuovibili

mediante la luce, sono attaccati alla mediante la luce, sono attaccati alla

superficie del vetrino. La luce viene superficie del vetrino. La luce viene

diretta attraverso una maschera per diretta attraverso una maschera per

deproteggere e attivare i gruppi deproteggere e attivare i gruppi

selezionati. Nucleotidi protetti selezionati. Nucleotidi protetti

possono così accoppiarsi ai siti possono così accoppiarsi ai siti

attivatiattivati

Array di oligonucleotidi ad altaArray di oligonucleotidi ad alta densitàdensitàGeneChipGeneChip

La fotolitografia permette la costruzione di array con alto contenuto diLa fotolitografia permette la costruzione di array con alto contenuto diInformazioneInformazione

E’ possibile avere 500,000 probe in uno spazio di 1.28 cmE’ possibile avere 500,000 probe in uno spazio di 1.28 cm22

Ogni singolo probe è costituito da milioni di oligonucleotidi identiciOgni singolo probe è costituito da milioni di oligonucleotidi identici

Un singolo array di Un singolo array di 1.28 cm1.28 cm2 2 contiene probe set per circa contiene probe set per circa 40,000 geni40,000 geniumani e EST umani e EST

Array di oligonucleotidi ad alta densitàArray di oligonucleotidi ad alta densitàDimensioni dell’arrayDimensioni dell’array

Dimensioni probe Geni/array*

50 m 1,600 – 6,400

20 m 10,000 – 50,000

2 m > 1 million

* Assumendo 4 – 20 probe pairs per gene

Array di oligonucleotidi ad alta densitàArray di oligonucleotidi ad alta densitàScelta dei probe e disegno degli arrayScelta dei probe e disegno degli array

I geni sono rappresentati da 10-20 diversi 25-meri: “I geni sono rappresentati da 10-20 diversi 25-meri: “probe setprobe set” ”

I probe sono scelti dall’estremità 3’ del trascritto in modo che siano unicamenteI probe sono scelti dall’estremità 3’ del trascritto in modo che siano unicamenterappresentativi di quel generappresentativi di quel gene

Per ogni oligo che presenta un match perfetto (Per ogni oligo che presenta un match perfetto (PMPM) con il trascritto, ne è) con il trascritto, ne èpresente uno identico con mismatch per una sola base in posizione centralepresente uno identico con mismatch per una sola base in posizione centrale((MMMM) )

La presenza di un La presenza di un MMMM consente di stimare legami aspecifici e background consente di stimare legami aspecifici e backgroundlocale e di sottrarli dal segnale di locale e di sottrarli dal segnale di PM PM

Array di oligonucleotidi ad alta densitàArray di oligonucleotidi ad alta densitàMarcatura del target e ibridizzazioneMarcatura del target e ibridizzazione

Il sistema Affimetrix Il sistema Affimetrix viene anche definito viene anche definito “chiuso” perché “chiuso” perché prevede l’utilizzo prevede l’utilizzo esclusivo di reagenti esclusivo di reagenti e strumenti messi a e strumenti messi a punto dalla dittapunto dalla ditta

Array di oligonucleotidi ad alta densitàArray di oligonucleotidi ad alta densitàIbridizzazioneIbridizzazione

La scannerizzazione del La scannerizzazione del chip ci fornisce chip ci fornisce un’immagine in cui il un’immagine in cui il grado di ibridizzazione grado di ibridizzazione viene evidenziato da una viene evidenziato da una diversa intensità di diversa intensità di emissione nel rosso. La emissione nel rosso. La rilevazione dell’immagine rilevazione dell’immagine infatti è possibile grazie al infatti è possibile grazie al legame alla biotina di un legame alla biotina di un composto fluorescente composto fluorescente (streptavidina-ficoeritrina)(streptavidina-ficoeritrina)

Array di oligonucleotidi ad alta densitàArray di oligonucleotidi ad alta densitàIbridizzazioneIbridizzazione

A differenza degli A differenza degli array a DNA array a DNA spottato, il sistema spottato, il sistema Affimetrix prevede Affimetrix prevede l’ibridizzazione di un l’ibridizzazione di un singolo campione singolo campione su ogni genechipsu ogni genechip

• Produzione dei vetrini: spottaggio vs. fotolitografiaProduzione dei vetrini: spottaggio vs. fotolitografia

• Lunghezza del DNA target: unica sequenza vs. una serie di frammentiLunghezza del DNA target: unica sequenza vs. una serie di frammenti

• Numero di trascritti per array: 6,000/cmNumero di trascritti per array: 6,000/cm22 vs. 40,000/cm vs. 40,000/cm22

• Gli array spottati possono essere prodotti in laboratorio o acquistati, Gli array spottati possono essere prodotti in laboratorio o acquistati,

mentre gli array ad alta densità di oligonucleotidi sono disponibili solo mentre gli array ad alta densità di oligonucleotidi sono disponibili solo

in commercioin commercio

• Costi diversiCosti diversi

• Ibridizzazione: competitiva vs. assolutaIbridizzazione: competitiva vs. assoluta

• Quantificazione dell’espressione genica: rapporto di segnali vs. Quantificazione dell’espressione genica: rapporto di segnali vs.

segnale assolutosegnale assoluto

Array a cDNA vs. array di oligonucleotidiArray a cDNA vs. array di oligonucleotidiDifferenti aspettiDifferenti aspetti

Tecnologia MicroarrayTecnologia MicroarrayPotenziali applicazioniPotenziali applicazioni

La tecnologia degli array a DNA può essere utilizzata per due La tecnologia degli array a DNA può essere utilizzata per due principali applicazioni:principali applicazioni:

• Profili di espressione genica Profili di espressione genica da mRNA: fornisce i livelli di da mRNA: fornisce i livelli di espressione di determinati geni in un campione biologicoespressione di determinati geni in un campione biologico

• Sequenziamento e genotipizzazione del DNA Sequenziamento e genotipizzazione del DNA da DNA genomico: da DNA genomico: è possibile ottenere sequenze geniche e identificare polimorfismi è possibile ottenere sequenze geniche e identificare polimorfismi (anche SNPs) in specifici geni di sequenza già nota(anche SNPs) in specifici geni di sequenza già nota

La valutazione di profili di espressione genicaLa valutazione di profili di espressione genica, può trovare impiego in , può trovare impiego in

diverse applicazioni, quali:diverse applicazioni, quali:

• Caratterizzazione di marcatori diagnosticiCaratterizzazione di marcatori diagnostici• Classificazione molecolare di differenti sottotipi di malattiaClassificazione molecolare di differenti sottotipi di malattia• Identificazione di specifici target terapeuticiIdentificazione di specifici target terapeutici• Identificazione di vie di segnale regolate da geni chiaveIdentificazione di vie di segnale regolate da geni chiave• Drug discovery e studi tossicologiciDrug discovery e studi tossicologici

Tecnologia MicroarrayTecnologia MicroarrayPotenziali applicazioniPotenziali applicazioni

Tecnologia MicroarrayTecnologia MicroarrayApplicazioni clinicheApplicazioni cliniche

Alcune delle possibili applicazioni cliniche dei microarray:Alcune delle possibili applicazioni cliniche dei microarray:

• Oncologia:Oncologia: in particolare nel settore delle leucemie questa tecnologia ha in particolare nel settore delle leucemie questa tecnologia ha trovato buone possibilità di utilizzo in ambito diagnostico.trovato buone possibilità di utilizzo in ambito diagnostico.

Un lavoro pubblicato nel 2003 su Seminars in Hematology, dimostra l’applicabilità Un lavoro pubblicato nel 2003 su Seminars in Hematology, dimostra l’applicabilità della tecnologia Microarray alla classificazione molecolare di leucemie. Sulla base della tecnologia Microarray alla classificazione molecolare di leucemie. Sulla base dei differenti profili di espressione genica, si prospetta la possibilità di utilizzare gli dei differenti profili di espressione genica, si prospetta la possibilità di utilizzare gli array come strumento sia array come strumento sia diagnosticodiagnostico (identificando anche nuovi sottotipi di (identificando anche nuovi sottotipi di malattia), sia malattia), sia prognosticoprognostico (predizione risposta a terapie, rischi di recidiva, ecc…). (predizione risposta a terapie, rischi di recidiva, ecc…).

La tecnologia microarray può trovare impiego anche nell’identificazione di La tecnologia microarray può trovare impiego anche nell’identificazione di trattamenti individualitrattamenti individuali in accordo con il profilo di espressione genica del paziente e in accordo con il profilo di espressione genica del paziente e di nuovi target malattia-specifici per scopi di di nuovi target malattia-specifici per scopi di drug discoverydrug discovery..


• Microbiologia:Microbiologia: sono stati sviluppati array in grado di rilevare sequenze sono stati sviluppati array in grado di rilevare sequenze geniche di diversi tipi di patogeni.geniche di diversi tipi di patogeni.

Sono stati realizzati array a oligonucleotidi, contenenti sequenze virali di 70 pb Sono stati realizzati array a oligonucleotidi, contenenti sequenze virali di 70 pb altamente conservate all’interno della stessa famiglia, in modo da rilevare anche altamente conservate all’interno della stessa famiglia, in modo da rilevare anche varianti viralivarianti virali non conosciute (PNAS 2002). Lo studio propone l’impiego di non conosciute (PNAS 2002). Lo studio propone l’impiego di questa nuova tecnologia in diagnostica e nell’identificazione di malattie di questa nuova tecnologia in diagnostica e nell’identificazione di malattie di eziologia sconosciuta.eziologia sconosciuta.

Altri studi hanno portato alla realizzazione di diversi tipi di chip, il cui impiego può Altri studi hanno portato alla realizzazione di diversi tipi di chip, il cui impiego può spaziare dalla spaziare dalla diagnosi di infezioni batterichediagnosi di infezioni batteriche (con rilevazione di geni per la (con rilevazione di geni per la resistenza ad antibiotici), agli studi sulle resistenza ad antibiotici), agli studi sulle relazioni filogeneticherelazioni filogenetiche tra diversi tra diversi microorganismi.microorganismi.

• Farmacogenomica:Farmacogenomica: studio della variazione individuale di risposta ai studio della variazione individuale di risposta ai farmaci sulla base del corredo genetico.farmaci sulla base del corredo genetico.

Alcuni polimorfismi genetici causano risposte differenti nei confronti di Alcuni polimorfismi genetici causano risposte differenti nei confronti di determinati farmaci. La tecnologia microarray può trovare impiego nello determinati farmaci. La tecnologia microarray può trovare impiego nello sviluppo di farmaci paziente-specifici.sviluppo di farmaci paziente-specifici.

• Microarray di SNP sono stati recentemente utilizzati anche per Microarray di SNP sono stati recentemente utilizzati anche per valutare il valutare il chimerismochimerismo dopo trapianti allogenici di cellule staminali dopo trapianti allogenici di cellule staminali (Leukemia 2004).(Leukemia 2004).


Disegno sperimentaleDisegno sperimentale

Linea cellulare: THP-1Linea cellulare: THP-1

Trattamenti: Trattamenti: CtrlCtrl

VPA 2mMVPA 2mM in duplicato in duplicato

ATRA 1ATRA 1MM

VPA+ATRA VPA+ATRA

Time points: 6h, 24h, 48hTime points: 6h, 24h, 48h

Due chips Affimetrix per ogni trattamento, per ogni tempo (24 chips).Due chips Affimetrix per ogni trattamento, per ogni tempo (24 chips).

Monitorato l’andamento temporale di più di 12000 geni per tutti i trattamenti.Monitorato l’andamento temporale di più di 12000 geni per tutti i trattamenti.

Tecnologia MicroarrayTecnologia MicroarrayNostri esperimentiNostri esperimenti

}

Gli esperimenti di microarray consentono di ottenere una grande quantità di Gli esperimenti di microarray consentono di ottenere una grande quantità di

informazioni in poco tempoinformazioni in poco tempo

Nell’ambito della ricerca le analisi microarray non forniscono una risposta finale ad un Nell’ambito della ricerca le analisi microarray non forniscono una risposta finale ad un

problema biologico ma ci consentono di indirizzarci verso nuovi canali di ricerca che problema biologico ma ci consentono di indirizzarci verso nuovi canali di ricerca che

permettono di analizzare il problema da differenti prospettivepermettono di analizzare il problema da differenti prospettive

In ambito clinico sono necessari ulteriori studi che consentano di allargare le In ambito clinico sono necessari ulteriori studi che consentano di allargare le

popolazioni di controllo. I dati fino ad ora disponibili ci rendono confidenti sulla popolazioni di controllo. I dati fino ad ora disponibili ci rendono confidenti sulla

possibile introduzione dei microarray come indagine di routine in diagnostica entro i possibile introduzione dei microarray come indagine di routine in diagnostica entro i

prossimi tre o quattro anniprossimi tre o quattro anni

Un punto chiave di questa tecnologia è rappresentato dalla necessità di individuare Un punto chiave di questa tecnologia è rappresentato dalla necessità di individuare

per ogni tipo di indagine sistemi adeguati e standardizzati per l’analisi dei datiper ogni tipo di indagine sistemi adeguati e standardizzati per l’analisi dei dati

Tecnologia MicroarrayTecnologia MicroarrayConclusioniConclusioni

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