ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO.
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ANALISI CITOFLUORIMETRICA
E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO
ANALISI CITOFLUORIMETRICA
E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO
Definizione
CITOFLUORIMETRIA oo CITOMETRIA A FLUSSO
Metodica di laboratorio che permette un’analisi automatica di sospensioni cellulari monodispersesospensioni cellulari monodisperse
misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimichecaratteristiche citologiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare
che interseca una sorgente luminosa, acquisendo e memorizzando piu’ parametri (volume, granulosita’, fluorescenzavolume, granulosita’, fluorescenza) per ogni cellula acquisita
Principi di funzionamento
• Sistema fluidico (focalizzazione idrodinamica)
• Sistema ottico (laser Argon 488nm)
• Sistema elettronico (software CellQuest)
Parametri
• LIGHT SCATTERING
(Forward and Side Scatter)
• FLUORESCENZA
(FITC, PE, PerCP, Cy5.5, Alexa, Biotina, PI, APC, ...)
Fluorescenza
Plot FITC/PE/Per CP
Intensita’ F proporzionale ai siti di legame
IMMUNOFLUORESCENZA
DIRETTA
Marcatori(linfocitari): la nomenclatura CD
Si considera membro di un Cluster differentiation un Marcatore di superficie che:
• identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo
• ha una struttura biochimica definita
• è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi
Informazioni aggiornate
www.courseware.vt.edu/users/kdelgert/ (www.bsi.vt.edu/immunology)
www.ncbi.nlm.nih.gov/prow
Applicazioni
1. determinazione dei marcatori di differenziamento cellulare, di superficie, intracitoplasmatici e intranucleari
2. valutazione del contenuto cellulare di DNA
3. discriminazione tra cellule vive, cellule apoptotiche e necrotiche
4. predisposizione per la separazione cellulare
Immunofenotipo
Permette di IDENTIFICARE,NUMERARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti
in caso di antigenti specifici l’immunofenotipo può rispondere a
domande su diagnosi, prognosi
e malattia residua minima
Gating
CD 45
ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA
INTENSITA’ SU LEUCICITI PERIFERICI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO
SU CELLULE BLASTICHE
Espressione CD45Linfociti Monociti
Cellule immature
Granulociti maturi
Granulociti immaturiEritrociti
Scelta degli antigeni e Criteri di Positività
•ALTA SENSIBILITA’ (es.CD19 nelle ALL-B)
•ALTA SPECIFICITA’ (es.CD34, CD133)
•Positività?
Characteristic phenotype of B-precursor ALL with most common chromosomal aberrations
MLL/AF4 TEL/AML1 Hyperdiploidy BCR/ABL E2A/PBX1
t(4;11) t(12;21) t(9;22) t(1;19) CD45 Dim Dim Neg Neg/dim Dim CD19 Pos Pos Pos Pos Pos CD34 Pos Pos Pos Pos/neg Neg CD22 Neg/dim Dim/pos Pos Dim/pos Pos/dim CD20 Neg Neg Dim/pos Dim/pos Dim/pos CD24 Neg Pos Pos Pos Pos CD10 Neg Pos Bright Bright Neg/dim TDT Pos Pos Pos Pos Pos cyIg Neg Neg Neg Neg Pos CD15 Often dim Neg Neg Neg Neg CD65 Often dim Neg Neg Neg Neg CD13 Mostly neg Often pos
and/or (CD33) Neg pos and/or
(CD33) Neg
CD33 neg Often pos and/or (CD13)
Neg and/or (CD13)
Neg
CD66c Neg Neg Pos Pos Neg CD9 Pos Neg NV NV Pos NG2 Pos Neg Neg Neg Neg
CD135 NV Neg NV NV NV CD25 NV NV NV Pos NV CD38 NV NV NV Dim NV
Derived from ; Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias (Review) O.Hrusak and A.Porwit-MacDonald Leukemia 2002
DATI RICERCA
•Ciclo cellulare e apoptosiPession et al., Targeted inhibition of NMYC by peptide nucleic acid in N-myc amplified human neuroblastoma cells: cell-cycle inhibition with induction of neuronal cell differentiation and apoptosis, Int J Oncol. 2004 Feb;24(2):265-72.
•DifferenziamentoPession et al., MLL-AF9 oncogene expression affects cell growth but not terminal differentiation and is downregulated during monocyte-macrophage maturation in AML-M5 THP-1 cells, Oncogene. 2003 Nov 27;22(54):8671-6.
VANTAGGI dell’ANALISI citofluorimetrica :
• multiparametricità• possibilità di mettere in relazione più caratteristiche
della stessa cellula• analisi di grandi quantità di cellule
• riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni
• grande sensibilità• rapidità di analisi
• possibilità di ulteriori analisi a posteriori