This article was downloaded by: [University of Nebraska, Lincoln]On: 17 October 2014, At: 06:38Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH,UK

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Metabolismo Degli AcidiNucleinici Nell'Ovogenesi diAnilocra Physodes (Crust.Isopod.)Silvia MontefoschiPublished online: 31 Jan 2014.

To cite this article: Silvia Montefoschi (1952) Metabolismo Degli Acidi NucleiniciNell'Ovogenesi di Anilocra Physodes (Crust. Isopod.), Caryologia: InternationalJournal of Cytology, Cytosystematics and Cytogenetics, 4:2, 145-172, DOI:10.1080/00087114.1952.10797538

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SILVIA MONTEFOSCHI

METABOLISMO DEOLI ACIDI NUCLEINICI NELL' OVOOENESI

D1 ANILOCRA PHYSODES (Crust. Isopod.)

(con Tavole XII-XIII e 5 figure nel testo) (*)

In redazione: il 10 dicemb1·e 1951.

SOMMARIO

I - Introduzione

II - Materiale e Teonica

III - Struttura dell' Ovario

1) Ovario molto giot•ane

2) Ovario durante la p1•ima fase dell' auxooitosi

3) Ovar·io durante la vitellogenesi .

4) Ovario all'inizio della seconda ovulazione

IV - Esame citologico e comportamento degli acidi nucleinici durante le

varie fasi della ovogenesi e vitellogenesi

1) Cellule foUioolari

2) Ovogoni

31 Ovociti

a) Nucleo

b) Nucleolo

c) Oitoplasma .

4) lnclusioni citoplasmatiche e p1·imi stadi della vitellogenesi

V - Discussione .

1) Comportamento delle cellule follicolm·i

2) Comportamento del nucleo e sua importanza nella vitellogenesi

3) Oompo!·tamento dell'aoido RN nel citoplasma e sua importanza nella

sintesi proteica

VI - Considerazioni generali e conclusioni

VII - Bibliografia .

VIII - Spiegazione delle Tavole XII e XIII

IX- Summary

X- Riassunto

( *) Centro di Biologia del C. N. R. presso Ia Stazione Zoologica di Napoli.

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145] [Oaryologla, vol. IV, n. 2, 1952.

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J. - lNTRODUZIONE.

In seguito allo studio da me compiuto sulla funzione delle cellule fol~ licolari nella spermatogenesi di Anilacra physodes e sui loro ciclo di secre~ zione di granuli, contooenti acido ribonucleinico (RN), in rapporto alia meiosi, ho voluto indagar.e se, anche nell' ovario, le cellule follicolari ab~ biano un comportamento analogo. Ho cosi avuto occasione di notare che durante I' ovogrenesi avvengono a carico del nucleo, del nucleolo e del cit~ plasma dregli ovociti fenomeni che, cons;derati comparativamente ad altri analoghi, osservati da altri autori in altri animali, mi sono apparsi di un in~ teresse tale da farmi ritenere utile studiarli alia luce delle recenti conoscenze circa l'importanza degli acidi nucleinici nella sintesi proteica.

I fenomeni osservati sono i seguenti: Madificaz;oni della struttura nucleare dell' ovocite contemporanee alla

comparsa di zollette basofile e F eulgen~positive al liViello e nell'interno del nucleolo e modificazioni, anch'.esse contemporanee, della basofilia e pironi~ nofilia del citoplasma, che danno luogo alia formazione di una fasc;a ba~ sofila sub corticale che, per il suo comportamento, ho rittenuto omologa aile fascie vitellogenle e strutture consimili, osservate negli ovociti di altri animali.

II mio studio si e cosi rivolto, oltre che al comportamento delle cellule follicolari, anche a quello degli ovoc;ti nel periodo dell' ovogenesi che pre~ cede la vitellogrenesi, fino alia formazione delle prime gocce di vitello nel citoplasma dell' ovo~ite.

II. - MATERIALE E TECNICA

La struttura della gonade di Anilocra physodes, che come tutti i Ci~ motoidi e un ermafrodita proterandro, e stata gia descritta dal MoNT ALENT I ( 1941) e da me brevemente delineata nel lavoro sulla spermatogenesi della stessa specie ( 1951 ). Non ritengo quindi utile ritornare su tale descrizione, e ricordo semplic~mrente che I' ovario, duplice, si sviluppa, gia negE indivi~ dui ancora in fase maschile, lungo la parete interna dei due canali deferenti.

Sono stati studiati individui in fase maschile, il oui ovario e all'inizio del suo sviluppo, individui in .fase femminile, ad ovogrenesi e vitellogenesi avan~ zata ed individui all'inizio della seconda ovoluzione, con il marsupio pieno di uova fecondate.

Su materiale fissato in liquido di Helly sono state eseguite le seguenti colorazioni: ematossilina ferrica di Heidenhain, emallume di Meyer~eosina, blu di toluidina e eritrosina, secondo il metodo del Dominici e la reazione di Feulgen. Su materiale fissato con liquidi osmici (liquido di Maximow~Levi

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e liquido di Bensley) e stata eseguita Ia colorazione con l'ematossilina ferrica di Heidenhain (metoda lungo per il condrioma), e Ia colorazione con Ia fuc­sina acida di Altmann, secondo il metoda di Altmann-Kull. Alcuni prepa­rati di materiale fissato in liquidi osmici sono stati osservali senza alcuna co­lorazione.

Per lo studio del comportamento degli ac~di nucleinici e stata usata la miscela di Unna-Pappenheim ed e stato eseguito il controllo con la ribonu­cleasi, secondo il metoda di Brachet, grazie al quale ho potuto constatare che Ia pironinofilia e sempre dovuta ad acido RN.

III. - STRUTIURA DELL'OVARIO

La struttura dell' ovario e cEversa a seconda del grado di sviluppo in cui esso si trova e cio perche I' ovogenesi non procede in maniera graduale, cosi che si possono trovare in uno stesso individuo tutti gli stadi dall' ovogonio al­l'ovocite maturo, rna si svolge in maniera sincrona, nel sensa che tutti gli ovo­citi di un individuo si trovano, press' a poco, ad uno stesso stadia del loro svi­luppo, eccetto un piccolo gruppo di ovogoni e di ovociti molto g;ovani, che non procedono nel loro sviluppo, fino a che Ia maggior parte degli ovociti, raggiunta Ia maturita e fecondati, vengono espulsi tutti insieme nel marsupia attraverso I' ovidutto.

Quindi Ia disposizione e Ia struttura ~egli elementi citologici e diversa in individui a d~verso grado di sviluppo e sebbene questa variazione avvenga nel tempo in maniera continua, si possono distinguere quattro tipi principali di struttura ovarica.

1 - Ovario molto giovane.

In esso I' auxocitosi degli ovociti e an cora alrinizio e sono pres·enh m gran quant!ta ovogoni e ovociti in profase meiot:ica. L' ovario, a questa sta­dia, ha una forma cilindrica e, sviluppandosi sulla parete del deferente pa­raovarico, sparge ndl'interno del deferente s.tesso, occludendone il lume.

Le cellule follicolari, Ia cui struttura verra descritta in seguito, sono di­sposte lungo le pareti dell' ovario.

Cli ovogoni e gli ovociti in stadia di leptotene, zigotene, pachitene e di­plotene, si succedono in sensa latero-mediale e dalle due estremita ( cefalica e caudale) verso l'interno dell' ovario.

2 - Ovario durante la prima fase dell' auxocitO'si.

L' ovario presenta ancora una forma, cilindrica, gli ovociti in auxocitosi, fino aile dimensioni di 70-80 p. circa, si susseguono da una estremita all' altra

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dell' ovario, con andamento tortuoso, determinato dalle pieghe della membra· na 'elastica che li avvolge. Le cellule follicolari si insinuano &a gli ovociti, per formare, successivamente, attorno a ciascuno di essi, un follicolo mono­stratificato. Gli ovogoni e gli ovociti piu giovani sono disposti nella parte piu laterale dell' ovario, cioe piu prossima al deferente, ed aile due estremita.

3 - Ovario durante la vitellogenesi.

Le dimensioni dell' ovario sono notevolmente aumentate ed esso assume una forma ovale. Gli ovociti, di dimensioni notevoli, sono muniti di un folli­colo monostratificato; al di fuori dei follicoli vi sono gruppetti di cellule della stessa natura delle follicolari e cellule ematiche.

La zona degli elementi giovani e limitata aile due estremita dell' ovario e nella parte piu lateral~ di esso. In questa zona sono presenti ovogoni, ovo­citi non ancora in auxocitosi e ovociti durante la prima fase di essa, che io chiamo stadio di previtellogenesi.

Gli ovociti in vitellogenesi sono tutti della stessa dimensione; cosi che in un ovario dove gli ovociti. in vitellogenesi hanno raggiunto dimensioni di circa 200-250 (-L, gli ovociti piu giovani che si trovano in prossimita della zona germigena, non superano gli 80-90 (-L e non vi sono tra gli uni e gli altri stadi intermedi.

4 - Ovario all'inizio della seconda ovulazione.

Questa struttura ovarica si rinviene negli individui contenenti nel mar­supio uova appena fecondate.

E' evidente la presenza di due membrane: una estern a connettivale ed una interna elastica, spessa e contratta, molto distanziata dalla precedente. Questa membrana elast;ca forma un lungo cilindro, con andamento piu o meno tortuoso, alia cui parete interna aderiscono numerosi.ssime cellule folli­colari, che formano UIJO strato piuttosto spesso cosi che il lume di tale cilin­dro e notevolmente piccolo. Aile due estremita ( cefalica e caudale) di tale cilindro, si trovano gli ovogoni ed i g:ovani ovociti che si avanzano nell'inter· nodi esso.

IV. - ESAME CITOLOGICO E COMPORTAMENTO DEGLI ACIDI NUCLEINICI

DURANTE LE VARIE FASI DELLA OVOGENESI E VITELLOGENESI.

- Cellule follicolari.

La struttura delle cellule follicolari varia in rapporto alia loro funzio­nalita e quind! all a posizione che esse assumono nell' ova rio ed al progressivo sviluppo di quest'ultimo.

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La loro struttura nucleare, indipendentemente dalle modificazioni sud­dette, e Ia seguente: un cromocentro in posizione centrale, cromatina a strut­lura di filamenti raggiati aderenti al cromocentro, nucleoli in numero di due o tre. Il numero e Ia pironinofilia dei nucleoli, come anche Ia pironinofilia del citoplasma e della cromatina stessa, variano nei diversi momenti dell' attivita cellulare.

Nella zona dell' ovario prossima al deferente dove si trovano numerosi ovogoni, le cellule follicolari presentano le seguenti caratteristiche. Il loro vo-

Fig. 1. - Cellule follicolari secernenti granuli contenenti acido ribonucleinico. Due ovogoni II0 con numerosi nucleoli, alcuni dei quali addossati alla parete del nucleo.

lume nucleare e maggore di quello delle cellule in prossimita degli OVOCltl; il nucleo presenta un cromocentro centrale, che con la colorazione di Unna­Pappenheim assume un colore blu, i filamenti cromosomici sono molto sottili e la loro adesione al cromocentro e poco evidente; sono presenti uno o due nucleoli spostati alia periferia del nucleo. Questi elementi secemono una gran quantita di granu.Ii fortemente pironinofili, presenti nel loro citoplasma ed al di fuori di esso, che raggiungono e circondano gli ovogoni (fig. 1 ).

Man mano che le cellule follicolari si inoltrano nella zona degli ovociti, Ia secrezione di granuli piron~nofili cessa, i nuclei delle cellule si fanno piu piccoli e piu appiattiti ed i filamenti cromosomici appaiono piu spessi; si in-

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travedono due 0 tre nucleoli pironinofili, rna il citoplasrna non e pironinofilo. Con il crescere degli ovociti le cellule follicolari si dispongono attorno

a ciascuno di essi e £ormano un follicolo rnonostratificato, che e cornpleto, quando I' ovocite ha ragg~unto i 70~ 1 00 p. di diametro. Questo periodo coin~ cide con l'inizio della vitellogenesi.

Le cellule follicolari, dopo che hanno costituito il foll!colo, ·subiscono delle nuove modificazioni. II nucelo perde Ia sua caratteristica struttura a cr~ matina raggiata attomo al cromocentro, numerose zollette di crornatina ap­paiono invece disperse nel succo nucleare. I nucleoli diventano piu pironin~ fili ed il citoplasma e pironinofilo.

La pironinofilia del citoplasma, e dei nucleoli delle cellule follicolari si conserva durante tutto il periodo di vitellogenesi.

2 ~ Ovogoni.

Negli ovari molto giovani appartenenti agli individui ancora in fase rna~ schile, gli ovogoni occupano quasi tutto I' ovario. Mentre le cellule foll!colari si trovano sulle pareti di esso, gli ovogoni ne occupano Ia parte centrale. Vi sono anche dei giovani ovooiti in profase meiotica che si trovano medialmente agli ovogoni. Questa posizione laterale della zona dei goni si conserva du­rante tutta la vitellogenesi rna viene sernpre piu spostata verso le due estre­mita dell' ovario.

Gli ovogoni si trovano sempre in prossimita delle cellule follicolari se~ cernenti. Sono presenti due tipi di goni che distinguo in ovogon! Io e ovogoni II0

• Nei goni Io il citoplasma non e evidente, il nucleo che presenta un cr~ rnocentro centrale, che si colora in blu con l'Unna Pappenheirn, ha sottili fi~ lamenti cromatici ed un nucleolo pironinofilo e acidofilo, non sempre presente, aderente al cronometro. Nei goni no il citoplasma e evidente e pironinofilo; nel nucleo Ia cromatina appare condensata in numerose zollette, di cui alcune di dimensioni rnaggiori e piu intensarnente colorabili con i coloranti ba.sici, e che considero zone eterocromafche; in prossimita di esse si trovano i nucleoli intensamente pironinofili ed acidofili. lntomo agli ovogoni si trovano nume~ rosi granuli pironinofili secreti dalle cellule folEcolari. Questi granuli scorn­paiono Ia dove si trovano le pr-ofasi rneiotiche. Cio appare molto evidente ne~ .gli ovari molto giovan!, dove si puo seguire faoilmente la successione degli elementi gerrninali in sviluppo, dalle due estremita dell' ovario verso Ia parte piu rnediale di esso.

3 ~ Ovociti.

L' auxocitosi degli ovociti inizia quando questi hanna raggiunto lo sta~ dio di diplotene. Sia durante i primi stadi della meiosi che durante l'auxoci~

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tosi, anche il nucleolo ed il citoplasma, oltre al nucleo, subiscono modifica­ZIODI.

T rattero separatamente i diversi costituenti cellulari. a) Nucl-eo. Nella zona immediatamente successiva a quella degli ovo­

goni, dove sono presenti abbondanti granuli di secrezione delle cellule folli­colari, compaiono le profasi meiotiche. Si susseguono in senso latero-mediale e dalle estremita dell' ovario verso l'interno gli stadi di preleptotene, leptotene, zigotene, pachitene e diplotene.

Defin~sco stadio di preleptotene quello in cui appaiono nel nucleo, pre­cedentemente a struttura granulare, dei filamenti cromatici che congiungono le zollette eterocromatiche, di cui ho parlato. Con Ia colorazione di Unna­Pappenheim Ia cromatina si colora in verde azzurrastro.

AI leptotene i filamenti cromosomici sono bene evidenti, ed occupano tutto il nucleo, Le numerose zolle eterocromatiche si sono riunite in un solo cromocentro che ha una posizione cenllrale o eccentrica. La colorazione dei cromosomi con il verde di metile si fa sempre piu evidente, si che negli stadi successivi essi si coloraoo in verde molto netto, perdendo quella lieve aflinita per Ia pironina che dava ai nuclei degli ovogoni una tinta bluastra.

Allo zigotene sia il cromocentro sia i aromosomi assumono una posi­zione eccentrica ed il succo nucleare ~ppare incolore. Lo appaiamento dei cromosomi e evidente nei preparati colorati con ematossilina ferrica di Hei­denhain.

AI pachitJene i cromosomi, che tornano a riempire tutto il nucleo, ap­paiono spessi e, con I' ematossilina ferrica, presentano una evidente struttura a cromomen.

Ailo stadio di diplotene il diametro nucleare e lievemente aumentato; siamo all'inizio deii'auxoc~tosi, Nei preparati colorati con l'ematossilina fer­rica e bene evidente la separazione dei due elementi del bivalente.

Durante tutti gli stadi della profase i cromosomi sono F eulgen-positivi e si colorano intensamente con i coloranti basici, verde di metile, blu di tolui­&na ed anche con ematossilina ferrica di Heidenhain ed emallume di Mayer.

Quando Ia profase meiotica ha raggiunoo lo stadio di diplotene ed ini­zia I' auxocitosi il volume nucleare aumenta, proporzionalmente al volume di tutto l'ovocite, fino a che quest'ultimo ha raggiunto d!mensioni di 70-80 1.1.

CirCa.

AI diplotene i cromiOSomi si fanno piumosi e rimane evidente Ia loro aderenza al cromocentro; perdono progressivamente la I oro colorabilita con Ia Feulgen ed il verde di metile mentre si colorano ancora con l'ematossilina ferrica. Con I' emailume ed eosina e con Ia colorazione del Dominici presen­tano, man mano che I' auxocitosi prosegue, una certa acidofilia, localizzata

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sopratutto in piccoli granuli lungo i filamenti aromosomici. 11 cromocentl"o ri­mane sempre F eulgen positivo e si oolora con il ver~e di metile.

N ei primi stadi dell' auxocitosi, i filamenti cromosomici rimangono ade­renti alia parete nucleare, quindi si staccano da essa ed occupano soltanto una parte del nucleo {fig. 2).

Quando I' ovocite ha raggiunto il diametro di 50-70 ·ll circa avvengono nel nucleo, che ha ragg!unto dimensioni di circa 25-30 p., modificazioni con· temporanee ad altre che sono a carico del nucleolo e del citoplasma, delle quali parlero in seguito.

II volume nucleare subisce una notevole contrazione, i aromosomi a struttura piumosa, fino ad allora evident!, scompaiono, e nella zona del nu· cleo prima 'occupata dalla rete cromosomica, compare una struttura finemen·

Fig. 2. - Ovociti allo stadio di diplotene.

te reticolata o addirittura vacuolosa, lievemente p~roninofila. In alcuni casi questa pironinofilia e notevole e Ia struttura del nucleolo non e piu evidente se non come una zona p!u intensamente pironinofila.

N el nucleo sono presenti numerose Z:ollette sferiche, che si colorano con tutti i coloranti basici, con Ia F eulgen ed in seguito allo colorazione di Unna· Pappenheim prendono il verde di metile.

Successivamente, quando I' ovoc!te ha raggiunto dimensioni di 70-1 00 p. circa, Ia pil"oninofilia del nucleo scompare, pur permanendo Ia struttura sud­detta, ed un anello pironinofilo si forma attorno ad esso. Tale anello si tra­sforma poi in un alone e va successivamente sfumando nel citoplasma circa­stante, mentre nel nucleo ricompaiono i filamenti cr·omosom!ci a struttura piu­mosa.

b) Nucleolo. I nucleoli incominciano .ad essere bene evidenti negli ovogoni, il cui nucleo presenta numerose zollette cromatiche, intensamente co­lorate con i coloranti basici, cui attribuisco il vaiore di zone eterocromatiche.

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E' proprio al livello di queste zolle che appaiono i nucleoli, ad esse aderenti, e circondati da un anello di cromatina. Sono in numero di tre o quattro per nucleo, intensamente pironinofil;, e eosinofili (si colorano in rosa con l'eosina e in rosa aranciato con Ia colorazione del Dominici). Hanna dimensioni di due o tre [.1. circa di diametro. Alcuni di essi hanna una posizione periferica.

Durante Ia profase me:otica i nucleoli di ciascun ovocite si riducono di numero. Allo stadia di preleptotene, leptotene e zigotene, se ne vedono an­cora due o tre, e mentre uno di essi conserva una posizione centrale, gli altri sono aderenti alia membrana nucleare. Ailo stadia di pachitene il nucleolo e gia unico, non piu circondatc dall' an ella di cromatina, ne aderente al cro­mocentro, tuttavia rimane sempre a contatto con Ia cromatina. Quando il nu­cleolo appare unico, allo stadia di pachitene, ha dimensioni di circa 3-4 f1 di diametro.

Sembra quindi evidente una riduzione della massa nucleolare durante Ia profase meiotica degli ovociti, periodo in cu: la pironinofilia del loro cito­plasma aumenta. Questa fatto, e lo spostarsi dei nucleoli alia periferia del nucleo; sl da apparire aderenti alia membrana nucleare, fa pens are che una parte del materiale nucleolare passi dal nucleo al citoplasma dell' ovoc!te.

E' da notare inoltre che Ia formazione dei nucleoli pironinofili precede, sebbene di poco, Ia pironinofilia del citoplasma, e che durante Ia meiosi vi e una progressiva perdita della pironinofilia della cromatina, quindi del suo contenuto in acido ribonucleico ..

Durante il primo tempo dell'auxocitosi le dimensioni nucleolari aumen­tano proporzionalmente a queUe del nucleo e dell' ovocite in toto, fino a che quest'ultimo ha raggiunto dimens=oni di 50-70 [.I., il nucleo dimensioni di 25-30 [.1. ed il nucleolo dimensioni di 1 0-12 [.1. di diametro.

In questa periodo Ia pironinofilia del nucleolo aumenta progressivamen­te, cosi che Ia sua acidofilia viene sempre piu mascherata dalla basofilia del­I' acido RN. lnfatti si colora sempre piu con i color anti basici quando ven­gono usat! anche coloranti acidi di contrasto, come eosina ed eritrosina.

Sempre durante questo prima periodo si notano, nei preparati colorati con I' ematossilina ferrica, delle goccioline intensamente colorate in nero nel­l'interno del nucleo, in pross;mita del nucleolo e addossate alla parete nuclea­re. Zollettine nere sono anche presenti nel citoplasma, sia presso Ia membra­na nucleare, sia distanti da essa.

Non credo che vi siano tra queste formazioni siderofile all'interno ed all'esterno del nucleo, dei rapporti di dipendenza. La loro forma e diversa; queUe nell'interno del nudeo sono perfettamente sferiche e ritengo si t-ratti di z6Ilette eterocromatiche, perche sono F eulgen-positive e perche queUe in prossimita del nucleolo sembrano, a volte, continuarsi con un filamento cromo-

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somico; quelle nel citoplasma hanno una forma irregolare e appaiono nell'in­terno di un vacuolo.

Quando I' ovocite ha raggiunto dimensioni di 50-70 [.1. circa di diametro ed il nucleo, che ha raggiunto dimensioni di 25-30 [.1. subisce le modificazioni su descritte, il nucleolo che ha raggiunto a questo stadio dimensioni di 1 0-12 [.1. circa si presenta molto vacuoloso, ed appaiono addossate ad esso ed a volte nell'interno della membrana nucleolare, zollette di diverse dimensio­ni, F eulgen-positive. II nucleolo perde la sua regolare forma sferica, appare spesso allungato, loboso, ed il materiale pironinofilo e, a volte, ridotto nel­l'interno della membrana nucleolare ( v. T av. XII, fig. 1 e 2). Spesso la strut­lura del nucleolo non e piu evidente ed al posto di essa vi e una gran quan­tita di materiale pironinofilo. Non so se si tratti di un fenomeno normal e. cioe di una esplosione nucleolare con fuoriuscita del materiale basofilo, o si tratti piuttosto di un artefatto di tecnica. II fenomeno, comunque, e piuttosto fre­quente.

Nei preparati colorati con emallume ed eosina o con blu di toluidina ed eritr<>sina, il nucleolo si presenta spesso acidofilo.

Si tenga presente che contemporaneamente alia formazione di queste zollette di acido DN addossate al nucleolo, che interpreto come secrezione nucleolare, la struttura cromosomica scompare ed il nucleo, contratto, presen­ta una lieve pironinofilia, (T av. XII, fig. 4 e 5).

Progressivamente le zollette basofile si allontanano dal nucleolo e si por­tano alia peri feria del nude<> e divengono piu piccole; nei preparati colorati con il metodo di Unna-Pappenheim esse assum<>no un colore piuttosto vio­laceo, ed in quelli colorati col metodo del Dominici appaiono piuttosto aci­dofile; quindi scompaiono.

II nucleolo si fa di nuovo ben individuabile, assume un aspetto loboso ed a struttura reticolata, quindi ritoma normalmente sferico ed a struttura compatta, rna rimane vacuoloso. Nel frattempo non e aumentato di dimen­sioni, come ha fatto invece I' ovocite che ha raggiunto dimensioni di 1 00 [.1. circa. (Tav. XII, fig. 3 e 6; Tav. XIII (fig. 7 e 9).

La pironinofih del nucleo scompare mentre si forma intorno ad esso un anello intensamente pironinofilo che successivamente sfuma nel citoplasma circostante.

Nei preparati colorati con emato:;silina ferrica, la presenza di granuli si­derofili nel citoplasma perinucleare ed aderenti alia membrana del nudeo, puo far pensare ad un passaggio delle zollette nucleolari dal nucleo al cito­plasma. Ma anche in questo caso n<>n credo che vi siano rapporti di dipen­denza tra le zollette nell'interno del nucleo, che interpreto come secrezione

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nucleolare, e quelle nel citoplasma, che sono le stesse precedentemente de­scritte, che rimangano nella zona piu centrale dell' ovocite.

c) Citoplasma. II citoplaJSma si mette in evidenza per Ia prima vol11a a causa della sua basofilia -e pironinofilia negli ovogoni subito dopo Ia com­parsa dei nucleoli. All'inizio e rappresentato da uno strato piuttosto Sottile, ed e meno p:roninofilo dei nucleoli, rna piu basofilo di essi, perche i nucleoli, come ho gia detto, presentano all'inizio, una certa acidofilia, assente nel cito­plasma.

Durante Ia profase meiotica ed i primi stadi dell'auxocitosi, Ia bosofilia e Ia piron:nofilia del citoplasma aumentano, quindi cominciano a diminuire. Ritengo che tale diminuzione sia dovuta ad una maggiore diffusione dell'a­cido RN nella massa citoplasmatica, che aumenta progressivamente, e non ad una utilizzazione e scomparsa dello stesso acido RN.

Quando I' ovoc:te ha raggiunto dimensioni di 50.. 70 p. circa di diametro, momento in cui avvengono i fatti su descritti a carico del nucleo e del nu­cleolo, anche nel citoplasma hanno luogo delle modificazioni.

La pironinofilia, prima uniformemente distribuita in utta Ia massa cito­plasmatica, si sposta alia periferia dell' ovocite formando uno spesso anello subcorticale. La zona perinucleare del citoplasma perde la pironinofilia e si presenta lievemente vacuolosa; e presente un limite ben netto tra le due diffe­renti zone citoplasmatiche {fig. 3; e T av. XII, fig. 1 ).

Man mano che I' ovocite cresce, Ia zona pironinofila subcorticale co­mincia a disgregarsi, presentandosi sotto forma di numerose zolle sempre for­temente pironinofile {fig. 4).

Quindi Ia loro pironinofilia scompare gradualmente andando dalla par­te piu centrale alia piu periferica e si riduce ad un sottilissimo anello su.bcor­ticale.

Nei preparati colorati con il metodo del Dominici, si segue egualmente lo svolgersi di tali modificazioni. La basofilia citoplasmatica, prima uniforme, si sposta alia peri feria dell' ovocite, quindi si disgrega in numerose zollette basofile ; il citoplasma perinucleare si presenta acidofilo e lievemente vacuo­loso. Le zollette basofile del citoplasma periferico in disgregazione si ridu­cono sempre piu alla periferia dell' ovocite, mentre internamente a questa zo­na suboorticale compaiono delle gocce fortemente acidofile, (T av. XIII, fig. 8). Quesre aumentano di numero e di &.mensfoni e finiscono con I' occupare tutta la zona periferica dell' ovocite, eccetto un sottile stmto subcortica1e che rimane basofilo e si confonde oon ~I citoplasma delle ,oellul•e follicolari.

lntanto nella zona perinucleare del citoplasma i vacuoli sono aumentati di dimensioni e si spostano verso l'esterno. Ci troviamo gia nel primo periodo

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della vitellogenesi e 1' ovocite ha raggiunto dimensioni di 200 1..1. circa di dia­merto.

Fig. 3. - Spostamento della basofilia nella zona subcorticale dell'ovocite. Presenza di zolle di acido timonucleinico nell'interno del nucleo.

Fig. 4. - Disgregazione della fascia basofila subcorticale. - Spostamento delle zollette di acido timonucleinico alia· periferia del nucleo. - Formazione dell'anello basofilo perinucleare.

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4 - lnclusioni citoplasmatiche e primi stadi della vitellogenesi.

Nelle sezioni di ovar~o fissate in Helly e colorate con ematossilina fer­rica, sono presenti nel citoplasma degli ovociti, sin dai primissimi stadi della loro auxocitosi {25-30 p. circa di diametro), delle zollettine intensamente siderofile di forma irregolare e con una disposizione piuttosto perinucleare, alcune delle quali aderenti alia parete estern a del nucleo. Man mano che I' o­vocite cresce queste zollettine aumentano di numero e quando Ia basofii;a del citoplasma si sposta nella zona subcorticale dell' ovocite, esse rimangono nel citoplasma perinudeare. Quando I' ovocite ha raggiunto dimensioni di 150-200 p. circa di diametro, compaiono nella zona delle suddette zollette side­rofile dei grossi vacuoli vuoti; alcune zollette sembrano aderire ad essi.

Nei preparati di ovario fissato in liquidi osmici e non colorati, si notano nella zona perinucleare. degli ovociti di circa 150 p. di diametro, numero&e goc­ce osmiofile e vacuoli dai contorni osmiofili. Si tratta probabilmente, di gocce di vitello grasso, le piu grandi delle quaE appaiono vuote in seguito all' azio­ne solvente dello xilolo.

N egli ovociti piu piccoli non si notano gocce osmiofile, rna sono bensi presenti le z.ollette siderofile.

E' probabile che queste formazioni siderofile siano in una qualche rela­zione, diretta o indiretta, con Ia formazione dei grassi che ha inizio nella par­te centrale dell' ovocite.

Nei preparati colorati con emallume di Mayer ed eosina, si notano, nel citoplasma degli ovociti, delle zollettine eosinofile nell'interno di piccoli va­cuoli. Queste zollettine si colorano con I' er!trosina nei preparati colorati con il metodo del Dominici. Esse hanno una distribuzione irregolare, piu perinu­cleare negli ovociti piu g;ovani e piu periferica negli ovociti in stadio piu avan­zato. Non so quale sia il I oro significato, rna non credo che lli tratti delle stesse zollette che si colorano con I' ematossilina ferrica di Heidenhain, per­che d:verse nella forma e nel comportamento. Sono piu grosse di quelle side­rofile, di forma piu allungata e meno numerose. Non aumentano durante Ia crescita dell' ovocite ed assumono una posizione periferica, quindi scompaiono perche si confondono con le numerose gocce di vitello acidofilo, probabil­mente prote;co, che si forma alia peri feria dell' ovocite.

Non mi e stato possibile mettere in evidenza il condrioma, ne con ema­tossilina ferrica di Heidenhain su materiale fissato con liquidi osmici, ne con il metodo di Altmann. Probabilmente le dimenisoni dei m;tocondri sono al di sotto del potere di risoluzione del microscopio.

Le dimensioni mass!me degli ovociti da me osservati sono di 300-350 p. di diametro. II citoplasma di questi ovociti e pieno di grosse gocce di vitello

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acidofilo, probabilmente proteico, e gross! vacuoli vuoti, probabilmente gras­si disciolti dallo xilolo, con distribuzione irregolare. Nei preparati colorati con il metodo di Unna-Pappenheim, si intravede, tra le grosse gocce di vi­tello, una sottile rete citoplasmatica lievemente pironinofila. N otevolmente pi­roninofilo, invece, e il citoplasma delle cellule follicolari.

V. - DISCUSSIONE

1 - C omportamento delle cellule follicolari.

Le cellule follicolari della zona germigena hanno una attivita secernen­te, che presenta una stretta somiglianza con quella da me studiata preceden· temente ( 1951) nel testicolo di Anilocra physodes. Nel testicolo Ia secre­zione e ciclica e si ripete tre volte durante lo svolgersi di tutto il processo me­iotico e precisamente quando le cellule germinali si trovano allo stadio di spermatogoni, immediatamente prima dell'inizio della meiosi, allo stadio di leptotene e allo stadio di pachitene.

Nell'ovario Ia secrezione da parte delle cellule follicolari avviene solo nella zona occupata dai goni, immediatamente prima che essi entrino in me­iosi; Ia dove sono presenti le profasi meiotiche, non vi sono piu granuli di se­creziOne.

II fatto che Ia divisione meiotica degli ovociti si arresta a1lo stadio di di­plotene, puo essere in rapporto con Ia mancanza di successive secrezioni, da parte delle cellule follicolari, durante i1 processo meiotico stesso, come sup­pone .Ia VITAGLIANO nel suo lavoro sulla gametogenesi di Cavolinia triden­tata ( 1950).

Appare dunque molto probabile che anche nell' ovario, come nel testi­colo, Ia secrezione di gr-anuli contenenti acido RN da parte delle cellule fol­licolari sia strettamente in rapporto con l'inizio e lo svolgersi della meios·;. Si puo dire che I' osservazione dello stesso fenomeno a carico dell' ovario, av­valora l'ipotesi avanzata circa il significato di tale secrezione nel testicolo.

Come si e deuo le cellule follicolari si dispongono poi attorno ad ogni ovocite formando attorno ad esso un follicolo monostratificato. La pironino­filia del I oro citoplasma rimane costante; non e evidente pero passaggio di acido RN dal citoplasma delle cellule follicolari all' ovocite. Che le cellule follicolari svolgano una funzione nutritizia nei riguardi dell' ovocite e piu che probabile, rna di che natura sia i1 materiale da esse fornito e difficile dire. E' probabile, data Ia ricchezza di acido RN del citoplasma de11e cellule fo11i­colari e Ia presenza in esse di fosfatasi alcaline (DE NICOLA 1949), che tali cell~le sintetizzino proteine, destinate a passare successivamente nell' ovocite,

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come ritiene il MuLNARD ( 1948) in seguito ad un suo studio sull' ovogenesi di Acantoscelides obtectus.

2 ~ C omportamento del nucleo e sua importanZia nella vitellogenesi.

II sincronismo dei fenomeni, che si verificano nel nucleo e nel citopla~ sma, rende molto probabile Ia partecipazione del primo ai processi di sintesi che avvengono nel secondo, durante I' ovogenesi; tali .fenomeni sono sopra~ tutto a carico degli acidi nucleinici.

Riassumendo i fenomeni su descritti, si possono distinguere nell' attivita nucleare dell' ovocite due fas!, aile quali corrispondono due diversi aspetti della struttura citoplasmatica.

La prima fase si svolge durante il primo periodo dell' ovogenesi, dal m~ mento in cui i goni si avviano alia meiosi, fino a che hanno raggiunto lo sta~ dio di diplotene. I nucleoli, che si formano al livello delle zolle eterocr~ matiche del nucleo dei goni, si spostano alia periferia del nucleo stesso e du~ rante la profase meiotica vi e una diminuzione della massa nucleolare dovu~ ta alia scomparsa di alcuni nucleoli, contemporaneamente ad un aumento del~ la pironinofilia citoplasmatica. I nuceloli sono anche acidofili, il che pu0 in~ dicare un contenuto in proteine basiche, assente o inferiore nel citoplasma. Inoltre, sempre durante la meiosi, il contenuto in acido RN dei cromosomi si riduce fino a scomparire, Tale impoverimento e contemporaneo all' aumen~ to delle dimensioni e della pironinofilia dei nucleoli. Queste modificazioni che avvengono nell'interno del nucleo, contemporanee all' arricchimento in acido RN del citoplasma, possono far pensare che tale acido, s;ntetizzato al livello delle zolle eterocromatiche, ed in parte ceduto dai cromosomi, si ac~ cumuli nei nucleoli e, tramite questi, passi nel citoplasma. E.' probabile che altro acido RN venga sintetizzato nel citoplasma stesso grazie al materiale proteico, porta to dai nucleoli, secondo la teoria del CAS PERSSON ( 1941). La seconda fase si svolge ad uno stadio piu avanzato dell' ovogenesi, nel pe~ riodo che precede immediatamente l'inizio della vitellogenesi e contempora~ neamente allo spostarsi dell'ac;do RN citoplasmatico alia periferia dell'ov~ cite. II nucleo dell' ovocite si contrae, scompaiono i cromosomi fino ad all ora evidenti e aM:orno al nucleolo e nell'interno di esso, appaiono numerose gocce di acido DN. Queste ultime si spostano verso la membrana nucleare, vi ade~ riscono e scompaiono poi mentre attorno al nucleo si forma un anello e quindi un alone fortemente pironinofilo. II nudeolo riprende la sua struttura normale. Che le zollette che si formano attorno al nucleolo e, come sembra, nell'inter~ no di esso, siano costituite da acido DN e reso evidente dalla loro decisa Feulgen~positivita. (Tav. XIII, fig. 9). E' diffi.cile dire se queste zolle ven~

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gano dai cromosomi o si formino nel nucleolo, e quale sia il lora significato funzionale.

Per d> che riguarda il prima problema, cioe I' origine delle zolle di aci­do DN, il M ULNARD ( 1949), in un suo lavoro sulla struttura dei nucleoli nei nuclei gig anti dei ditteri, avanza l'ipotesi che i granuli F eulgen-posit!vi da lui visti nell'interno di questi nucleoli vengano sintetizzati dai nucleoli stes­si, che siano di natura eterocromatica, perche le lora proprieta tintoriali sono simili a queUe delle zone eteropicnotiche dei cromosomi, e che rappresentino un aspetto dell'attivita sintetica del nudeolo, che, secondo l'ipotesi del WHI­TE ( 1948), potrebbe avere una funzione nella nucleinizzazione dei cromo­somi.

KAUFMANN (1934), come CASPERSSON e ScHULTZE (1940), con­s:derano invece questi granuli F eulgen-positivi come residui di quelle zone cromosomiali incluse nel nucleolo al momenta della sua formazione. A me sembra che il problema dell' origine dei granuli nucleolari F eulgen-positivi per­da il suo significato se, superat: i limiti strutturali, si consideri il nucleo come una un:ta funzionale, il cui contenuto nei due diversi acidi nucleinici non sia strettamente localizzato su determ=nate strutture, rna vari nelle proporzioni e nella localizzazione, in rapporo alia sua attivita funzionale.

La F eulgen-positivita del nucleolo, come espress= one della sua funzio­nalita nell' ovogenesi e stata osservata da F AUTHREZ ( 1950) nel Pholcus phalangioides, nel momenta in cui la fascia vitellogena si porta alia perife­ria dell' ovocite. T uttavia l' aut ore non ritiene che si tratti di acido DN, per­che il reattivo di Schiff colora ugualmente i nucleoli anche senza Ia prece­dente idrolisi.

II BRIEN ( 1950), che ha osservato, nell' ovogenesi dell'idra, la forma­zione di pi ecole sferule F eulgen-positive intorno al nucleolo ( che diviene an­ch' esso F eulgen-positivo) ritiene che tutto l' apparato nucleolare (nucleolo e sferule da esso secrete) contenga sia acido RN che acido DN.

Nell'ovogenesi dei Poliplacofori (Gasteropodi Prosobranchi), CABE e PRENANT ( 1949) hanna nota to, tra le modificazioni nucleolari che accompa­gnano l'in;zio della vitellogenesi, la formazione di una zona F eulgen positiva e che si colora con il verde di metile, nell'interno del nucleolo; quest'ultimo si pone in vicinanza della membrana nucleare in corrispondenza di quella zona citoplasmatica dove si condensa la sostanza del Colg! e dove la sintesi del vi­tello e piu intensa. II FRANC ( 1951 ), riprendendo lo studio dell' ovogenesi da un punta di vista comparative in numerose spec=e di Casteropodi Prosobranchi, conclude sostenen·do che, in questa gruppo di molluschi, la partecipazione del nucleolo ai processi di sintesi del vitello e notevole e che nel nudeolo: « .. .les techniques de detection des acides nucleiques semblent indiquer, en plus d'a-

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cide ribonucleique, Ia presence., dans certains cas, d' acide thymonucleique >>. Tornando all'Anilocra il significato funzionale delle z.ollette di acido ON, che formatesi al hello o all'interno del nucleolo, si portano alia periferia del nucleo per poi scomparire, credo si possa bene inquadrare nell' attivita com­plessiva del nucleo durante I' ovogenesi, che e considerata, gia da molto tem­po quella di fornire, al citoplasma materiale necessaria alia s;ntesi del vitello, materiale che, secondo Ie piu recenti vedute, si ritiene ess·ere acido RN o pro­reine basiche necessarie alia sintes~ di tale acido.

E' probabile che le zollette di acido DN siano di natura eterocroma­tica e che, portatesi alia peri feria del nucleo, sintetizzino acido RN, che ap­pare come un anello fortemente p:roninofilo dalla parte esterna della mem­brana nucleare. E' anche possibile che I' acido DN passi come tale attraver­so Ia membrana nucleare e venga al di fuori di essa trasformato in acido RN come suppone Ia DE NICOLA in base alia presenza delle difosfatasi specifi­che dell' acido DN, situate lungo Ia parete esterna del nudeo.

Un analogo riforn;mento di acido RN al citoplasma degli ovociti, e stato osservato da PAINTER e TAYLOR ( 1942) nell' ovogenesi del rospo, dove si vedono z.ollette eterocromatiche che, dando luogo alia formazione di piccoli nucleoli, si portano con questi alia periferia del nucleo. Gli autori ri­tengono che la magg;ore parte della sintesi di acido RN o della trasforma­zione dell'acido DN in acido RN, avvenga al livello della membrana nu­cleare, dove e utilizzabile una grande quantita di energia di superficie. A ri­sultati analoghi sembrano giungere gli studi del V ANNINI ( 1950), che ha ini­ziato una serie di interessanti ricerche sui comportamento degli acidi nuclei­nici nell' ovogenesi, in vertebrat; e invertebrati, con criteri comparativi. Daile osservazioni fino ad ora fatte e tuttora in corso sull' ovogenesi dei T eleostei e degli Anfibi, risulta che nel momento in cui i cromosomi degli ovociti, arri­vati allo stadio di diplotene, perdono la I oro F eulgen positivita, divengono piumosi e prat:camente invisibili, i nucleoli si ingrandiscono,· aumentano di numero e si spostano gradualmente verso Ia periferia del nucleo. Frattanto il citop.lasma si arricchisce di ribonucleoproteine. Durante Ia vitellogenesi, periodo in cui il contenuto in acido RN citoplasmatico diminu;sce contempo­raneamente alia sintesi del vitello proteico, i nucleoli si fanno p~u piccoli e piu abbondanti e si vanno sempre piu addossando alia parete interna del nu­cleo. L'autore ha anche notato un'attenuazione della membrana nudeare, nel per:odo in cui i nucleoli sono a piu stretto contatto con essa.

Anche I' attivita del nucleolo degli ovociti di diverse specie di Mollu­schi Gasteropodi, sembra essere in rapporto con Ia sintesi del vitello e viene in appoggio delle recenti vedute c=rca I'importanza degli acidi nucleinici. SER­RA e QuEIROZ LoPES ( 1945) han no nota to, nell' ovogenesi di Helix aspersa

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e di T achea nemoralis, un processo di emissione nucleolare, che si svolge in tre clicli, alternati con degli stadi di riposo relativo. I nucleoli fi.gli, cosi for~ matisi, ricchi in acido RN, si allontanano dal nucleolo e, spostatisi verso la periferia, del nucleo, si dissolvono, liberando nucleoproteine che, secondo gli autori, passano successivamente nel citoplasma. Gli autori non ritengono, tuttavia, che l'eterocromatina prenda parte attiva nei processi di sintesi che avvengono nel nucleolo, rna suppongono che quest'ultimo, ricevendo dal ci~ toplasma aminoacidi, polipeptidi semplici e ribonucleotidi, sintetizzi comples~ si ribonucleoproteici, che passano di nuovo al citoplasma.

La ARVY ha osservato nell' ovogenesi della Limnea stagnalis ( 1949) e del Dentalium dentale ( 1950) emissioni nucleolari pironinofi.le che, almena nella Limnea, I' au trice ritiene passino nel citoplasma dell' ovocite, attraverso la membrana nucleare.

T ornando al caso di Anilocra, la formazione di nurnerose zollette ete~ r·ocromatiche ed il loro spostamento alia periferia del nucleo, rappresent~ rebbero un altro aspetto del meccanismo citologico deputato al riforn:mento di acido RN al citoplasma dell' ovocite, meccanismo che, negli ovogoni e ne~ gli ovociti p:u giovani, viene esplicato dai nucleoli formatisi al livello delle zolle eterocromatiche presenti nel nucleo degli ovogoni stessi (fig. 5).

3 ~ Comportamento dell'acido RN nel citoplasma e sua importanza nella sin~ tesi proteica.

I fenomeni che si svolgono nel citoplasma, in stretto rap porto con I' atti~ vita nucleare, sono i seguenti: 1) Arricchimento del contenuto in acido RN contemporaneamente alia riduzione della massa nucleolare nei giovani ov~ citi in profase meiotica. 2) Spostamento dell' acido RN nella zona subcorti~ cale dell' ovocite e successiva disgregazione della fascia pironinofi.la cos:i for~ matasi. 3) Seconda invasione di acido RN a partire dall' anello pironino~ filo perinucleare, che si forma contemporaneamente allo spostarsi delle zol~ lette cromatiche alla pederia del nucleo.

Il primo arricchimento del contenuto ribonucleinico citoplasmatico lo considero, come ho gia detto, in rapporto alia scomparsa dei nucleoli che possono ritenersi, come giustamente si esprime il V ANNINI : « ... i regolatori principali dei processi di accrescimento oellulare e dii s.intesi di proteine e ri~ bonucleoproteine nel seno del citoplasma )) .

In quanto alia formaz!one della fascia citoplasmatica subcorticale, d~ vuta alio spostamento del materiale pironinofi.lo alia periferia dell' ovocite, non trovo difficolta a considerarla una formazione omologa ai corpi di Bal~ biani e fascie viteliogene che, da circa 80 anni, hanno attirato !'interesse di

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numerosi studiosi. L'omologia va intesa dal punto di vista funzionale, rna credo sia questa l'unica punta di vista che abbia interesse nella studio della fisialogia cellulare.

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c

" D . . . . . · " '

Fig. 5. - Schema del ciclo ribonucleinico.

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a) Secrezione di granuli contenenti acido ribonucleinico da parte delle cellule follicolari. b) Spostamento dei nucleoli pironinofili all a periferia degli ovagoni e arricchimento del

citoplasma in acido ribonucleinico. c) Spostamento della pironinofilia del citoplasma nella zona subcorticale dell'ovocite. d) Nuova invasione di acido ribonucleinico nel citoplasma a par tire dall' anello pironi­

nofilo perinudeare, e disgregazione della fascia pironinofila corticale.

Consideranda brevemente le formaziani citoplasmatiche che caratte­rizzano la cellula-uova in malti animali, ci troviamo di fronte ad alcuni ca­ratteri generali e ad una certa identi~a di compartamento: si farm ana in pros­simita del nuclea, sono fortemente basofile, e portatesi alia peri feria dell' ova­cite si frammentano, risalvendasi in granuli basofili che scampaiona, mentre ha luoga Ia formazione delle prime placchette di tuorlo.

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Quasi tutti gli autori sono d' accordo circa l'importanza di queste tran­sitorie formazioni basofile nella sintesi del vitello; alcun! ritengono che il condrioma entri nella costituzione di esse, altri non ammettono invece che il condrioma prenda parte alia formazione del vitello, altri ancora parlano di un' origine nucleare e nucleolare delle suddette formazioni.

II COTRONEI ( 1912), che considera queste formazioni basofile come « un semplice modo di integraz!one di sostanze diffuse >>, cosi si esprime circa la loro omologia: « il prodursi di complesse formazioni basofile {fa­scie vitellogene considerate come nuclei vitellini) e dovuto a cond!zioni spe­ciali di grandezze e ci spiega perche Ia sostanza basofila dell' ooplasma nel­l' oocite in crescita, mentre sta a rappresentare un medesimo processo me­tabolico, puo non integrarsi in identiche formazioni morfologiche )).

Da questa punto di vista non trovo alcuna difficolta a considerare la fascia basofila subcorticale nell' ovocite di Anilocra come « prodotto di una piu complessa integrazione >> di materiale presente nel citoplasma allo stato d=ffuso. La sola differenza di comportamento che essa presenta, rispetto aile formazion! basofile suddette, e la mancanza di un corpo basofilo gia dif­ferenziato in prossimita del nucleo; rna se si consider a che Ia basofilia del citoplasma degli ovociti di A nilocra, ha un' origine nucleare, nel senso sud­detto, questa differenza rientra in quelle particolari condizioni, in cui si e­sprime un medes=mo processo metabolico.

Per quel che riguarda la formazione dell' anello basofilo perinucleare, che poi si diffonde nel citoplasma circostante mentre la fascia pironinofila subcorticale si disgrega, mi sembra probabile, dato anche il sincronismo dei due fenomeni, che, nel momenta in cui I' aci.do ribonucleinico presente nel citoplasma allo stato diffuso, inizia process! di sintesi per dare luogo a for­mazioni molecolari piu complesse, nuovo acido ribonucleico allo stato dif­fuso venga fornito dal nucleo al citoplasma.

F enomeni analoghi sono stati osservati nell' ovogenesi del Pholcus pha­langioides, studiata prima dal VAN BAMBECKE ( 1897) e rivista recentemen­te, alia luce delle attuali conoscenze sugli acidi nucleinici, da URBANI

{ 1949) e da FA UTHREZ { 1950). N egli ovociti del Pholcus phalangioides, contemporaneamente alia disgregazione della fascia vitellogena alia perife­ria dell' ovociti, si forma, attorno al nucleo, un anello basofilo e pironino­filo, che si allarga e si diffonde nel citoplasma circostante. E' la striatura ra­diale perinucleare e basofila del VAN BAMBECKE e su cui FAUTHREZ cosi si esprime: « !'invasion ribonucleique du cytoplasme semble done se faire en deux temps >>.

In quanta aile prime formazioni deutoplasmat!che ho notato, come ho gia descritto, la comparsa di gocce ·eosinofile alia peri feria dell' ovocite, Ia

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dove si d!sgrega e scompare il citoplasma pironinofilo, e Ia comparsa di granuli osmiofili e quindi di vacuoli vuoti circondati da un anello osmiofilo, nella parte piu centrale dell' ovocite, dove rimangono le formazioni sidero-­file di dubbia natura di cui ho parlato. Sia le gocce eosinofile sia i vacuoli confluiscono in formaz!oni piu grandi e si distribuiscono uniformemente nel citoplasma, mediante spostamento delle prime verso l'interno e dei secondi verso I' esterno. Sarebbe suggestiva l'ipotesi che, proprio li dove scompare il materiale pironinofilo, si abb!a Ia formazione del vitello proteico, ipotesi che puo essere verificata mediante I' uso di tecniche specifiche.

VI. - CoNSIDERAZIONI GENERALI E CoNcLUSION!

Sin dalla piu antica letteratura sull' ovogenesi e messa in risalto Ia par~ tecipazione del nucleo ai processi di sintesi che avvengono nel citoplasma dell' ovocite, partecipazione che e quasi sempre intesa come passaggio dal nu~ cleo al citoplasma di materiale utilizzato nella formazione del vitello. Nu~ merosissimi sono i casi, stud!ati nella ovogenesi di diversi animali, di emis~ sione, da parte del nucleolo, di sferule o granuli, basofili o acidofili che, passando attraverso Ia membrana nucleare o in forma granulare, o allo stato diffuso, si ritiene prendano parte direttamente o indirettamente alla sintesi del vitello. Anche il CoTRONE! nel suo lavoro del 1912 sulla fascia vitel~ logena di Ant.edon rosacea parla di « ... perdita di sostanze nudeari, non nel senso di emissione di corpi figurati, ossia di granuli di cromatina, rna di elementi di tali sostanze, dovuti ad una dissociazione, che e caratteristica delle sostanze viventi, e fuoriusciti dal nucleo per osmosi ... ».

Recentemente, dacche lo studio della fisiologia cellulare si e rivolto al comportamento degli acidi nucleinici, Ia partecipazione del nucleo ai processi citoplasmatici di sintesi e stata interpretata come rifornimento, da parte del nucleo al citoplasma, di acido RN o proteine basiche che danno luogo all a formazione di ribonucleoprotidi (CASPERS SON 1941 ), ritenuti questi ultimi necessari alla sintesi proteica, perche sono sempre presenti Ia dove tale sintesi avviene.

Sono state nuovamente studiate, da tale punto di vista, tutte le forma~ zioni nucleari presenti negli ovociti; sono stati accuratamente seguiti I' ori~ gine ed il comportamento dei nucleoli, i cui rapporti con il contenuto in acido RN del citoplasma sono stati interpretati dal CASPERSSON in una sua coerente teoria.

E' stata di nuovo presa in esame quella formazione nucleare indivi~ duata dal GIARDINA ( 1901) nel nucleo dell' ovocite del Dytiscus, che recen~ temente URBANI ( 1950) ha studiato da un pun to di vista citochimico e com~

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parativo in tutte le specie della famiglia dei Dystiscidcte. Questo autore ha dimostrato che la massa di GIARDINA non e soltanto costituita da acido DN, come si riteneva, rna anche d!l acido RN; che quest'ultimo aumenta pro­gressivamente man mano che la massa cromatica va incontro ad un proces­so di disintegrazione; e che il citoplasma nella zona piu aderente all a massa che si disgrega si carica di acido RN.

Appare evidente che ci si trova di fronte ad un meccanismo citologico, avente lo stesso significato funz!onale di quello concepito dal CAsPERSSON circa i rapporti esistenti tra eterocromatina, nucleolo e citoplasma.

Sono state anche studiate, sempre da un punto di vista citochimico, queUe formazioni basofile citoplasmatiche, come corpi vitellini e fascie vi­tellogene, presenti negli ovociti di diversi animali, ed e stato visto che in esse e sempre presente un' alta percentuale di acido RN, che scorn pare, in se­guito alla loro disgregazione, prima o contemporaneamente alla formazione delle prime placchette di tuorlo.

La frequenza dei dati concordanti, circa la presenza e il comportamen­to dell' acido RN nel citoplasma degli ovociti, ha avvalorato l'ipotesi del­l'importanza di tale acido nella sintesi del vitello. T uttavia, quale sia il meccanismo con cui l' acido RN entri nella sintesi delle proteine, e un pro­blema che rimane ancora insoluto, come rimangono insolute molte complesse questioni riguardanti la v:tellogenesi, quale l'importanza del condrioma.

Contemporaneamente a questi studi di carattere citologico, il problema degli acidi nucleinici nella fisiologia della cellula, e stato affront(!.to da un punto di vista chimico.

CLAUDE (1943), BRACHET e ]EENER (1943), CHANTRENNE (1947) dimostrarono che l' acido RN e associato a particelle citoplasmatiche, iso­la hili mediante centrifugazione. Da un esame chimico di tali particelle ri­sulto trattarsi di complessi nucleoproteici e fosfolipid!ci, contenenti enzimi respiratori.

BRACHET e ]EENER distinsero l'acido RN legato a queste complesse formazioni dall'acido RN presente nel citoplasma allo stato diffuso e non centrifugabile, e notarono che, mentre nelle cellule dei tessuti adulti la quasi totalita dell'acido RN e legata alle particelle centri'fugabili, nelle cellule in attiva riproduzione e in attiva sintesi, come gli ovociti, una gran quan­tita di acido RN si trova allo stato diffuso.

CLAUDE isolo, a diverse velocita di centrifugazione, due tipi di gra­nuli, che differiscono tra loro non solo per le dimensioni, rna anche per il I oro contenuto in enzimi e in acido RN. ldentifico i granuli piu grandi, meno ricchi in acido RN e piu ricchi in enzimi, con i mitocondri e i granuli piu piccoli con i microsomi.

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CHANTRENNE, usando una diversa tecnica di centrifugazione, isolo cinque frazioni di granuli, diverse neUe dimensioni, nel loro contenuto rela­tivo in acido RN e in enzimi, e trovo che ii tenore in acido RN, massimo nei granuli piu piccoli, va gradatamente diminuendo. Secondo questo autore esiste tutta una serie di intermediari, tra i granuli piu grossi e i piu piccoli, sia relativamente aile dimensioni, sia alia loro costituzione chimica, che rap· presentano differenti gradi di sviluppo di complessi lipoproteici, i quali via via si accrescono, « comme si des proh~ines et des enzymes s' elaboraient autour d'un germe tres riche en ac;de ribonucleique >>.

Della stessa opinione e il j EENER ( 1948), che consider a i mitocondri e i microsomi come delle categorie particolari di questi numerosi granuli ci­toplasmatici.

Secondo le piu recenti vedute, quindi, i mitocondri rappresentano una tappa nel processo di sintesi di complessi nucleo-proteici e lipidici e, in base a tali vedute, e stabilita Ia loro omologia, anche se Ia loro composizione chi­mica, nelle diverse ceilule dei diversi tessuti, puo differire per le quantita relative dei costituenti e per il diverso contenuto in enzimi, in rapporto, que­st'ultimo, aile diverse attivita della cellula.

E' da tale punto di vista che va affrontato il problema dell'importanza dei mitocondri e deile diverse formazioni basofile (fascie vitellogene, nu­clei viteilini) neila sintesi del viteilo.

0LELAND ( 1951 ), in un suo lavoro suii' architettura enzimatica degli ovociti di ostrica, ha isolato, mediante centrifugazione, quattro frazioni di granuli: granuli L, o lipidici, che egli considera omologhi aii'apparato del Golgi; granuli P, o proteici, che, per Ia loro piu alta percentuale in enzimi che in acido RN, considera, funzionalmente, rna non morfologicamente, omologhi ai mitocondri; granuli M, complessi nudeoproteici con alto con­tenuto enzimatico, che considera, sia funzionalmente che morfologicamente, omologhi ai mitocondri; granuli S, che per il I oro alto contenuto in acido RN, omologa ai microsomi.

L' autore mette in risalto che il contenuto in acido RN aumenta con il diminuire delle dimensioni dei granuli e che Ia piu alta percentuale di tale acido e presente nel citoplasma non differenziato e, quindi, non legato a parti­celle centrifugabili, rna allo stato diffuso, ·e, dopo aver sostenuto che e diffide, se non impossibile, risolvere Ia questione della inconvertibilita delle diverse frazioni di granuli, cosi conclude: « From the chemical side it is not difficult to picture how a nucleoprotein micelle of the ground cytoplasm could, either by its own synthetic activity or by assimilation of form,ed moilecules from the surrounding cytoplasm, yeld a microsome with a h;gher protein and li­pide content, but without any significant accession or production of enzymes.

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The steps from here to mitochondria and, in the case of oyster to P gra~ nules are not difficult logical steps; they require merely an accession of more protein, some of wh;ch is enzymatically active )) .

Da tale punto di vista, le transitorie formazioni basofile che appaiono sotto diversi aspetti nel citoplasma degli ovociti di diversi animali, rna che seguono tutte il medesimo destino, cioe risoluzione in granuli basofiE e lora successiva scomparsa, potrebbero rappresentare un momento particolare in questa continua attivita sintetica, che si svolge nell'interno della cellula, m~ menta in cui questi complessi nucleoproteici, raggiunto un certo grado di in~ tegrazione, si presentano sotto forma di zolle ancora pironinofile, c;:he per~ dono via via il loro contenuto relativo in acido RN, dando luogo a comples~ si molecolari aventi un piu alto contenuto in proteine ed enzimi ed infine alle prime gocce di vitello proteico.

Gia il Co1'RONEI, nel 1912, cosi si esprimeva a proposito dei rapporti esistenti tra nucleo, granuli basofili citoplasmatici e fascia vitellogena « ... si tratta di sostanze, gia trasformate nel nudeo e disciolte, che si diffondono quindi con un processo osmotico. Queste sostanze, combinandosi con gli ele~ menti dell' ooplasma, precipitano sotto forma di granulazioni basofile ... che si vanno aggruppando e allineando, in modo da ricordare carpi descritti con tali caratteri in altri oociti in crescita, e ritenuti come mitocondri, ed io ho ritenuto I' omologia dei granuli di Anted on rosacea con i mitocondri degli oociti in crescita )) . E ancora •« .. . i mitocondri e i corpi cromatici che ne ri­sultano, s'integrano nella fascia vitellogena, come fase ulteriore di un me­des=mo processo formativo ... )) .

Ritornando all' ovogenesi di Anilocra da me studiata, posso immagina~ re che 1' acido RN, fornito dal nucleo allo stato diffuso, o sintetizzato a li~ vello della membrana nucleare, grazie a materiale proveniente dal nucleo, in;zii questo processo di integrazione di granuli sempre piu complessi: micr~ somi, frazioni granulari intermedie, mitocondri, che, portatisi alla periferia dell' ovocite e procedendo nella lora attivita sintetica, diano luogo all a for~ mazione di materiale proteico, mentre nuovo acido ribonucleico, allo stato diffuso, viene fornito dal nucleo o si forma attorno alla membrana nucleare.

Sarebbe interessante, in base a tale punto di vista, studiare il compor~ tamento dei mitocondri, in rapporto a quello dell' acido RN citoplasmatico.

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Splegazione delle Tavole XII e :Z::UI.

TAVOLA XII.

Fig. I - Ovocite 50 J.L circa-Spostamento della pironinofilia alia periferia dell' ovocite ; presenza di

zolle di acido timonucleinico (ADN) intorno al nucleolo ed addossate ad esso. - Colora­

zione Unna Pappenheins.

" 2 Comparsa delle zollette di ADN nell' interno del nucleolo.

» 3 Ovocite 80 J.L circa. • lnizio della disgregazione della fascia pironinofila aubcorticale ; zol­

lette di ADN nel nucleo ; sottile anello pironinofilo perinucleare. - Colorazione Unna­

Pappenhein.

» 4 - 0 vocite 80 J.L circa. Fascia pironinofila subcorticale in disgregazione, nucleo contralto e

lievemente pironinofilo, zollette di ADN nel nucleo, anello intensamente pironinofilo peri·

nucleare. Colorazione Unna-Pappenhein.

• 5 - Ovocite 90- I 00 J.L circa. Fascia basofila corticale in disgregazione • nucleo contralto e

pironinofilo; zolle di ADN nel nucleo; anello basofilo perinucleare. Basofilia citoplasma·

tica perinucleare (seconda ondata di ARN) - ColoriiZione del Dominici.

• 6 - Ovocite 90-1 00 J.L circa. Fascia basofila corticale in disgregazione. Nucleo non piu con­

tralto - zolle di ADN nel nucleo. Anello basofilo perinucleare e basofilia citoplasmatica

perinucleare (seconda ondata di ARN) - Colorazione del Dominici.

T A VOLA XIII.

Fig. 7 - Ovocite ISO J.L circa. - Fascia basofila corticate in disgregazione Citoplasma perinucleare

lievemente basofilo - Nucleo non piu contralto; filamenti cromosomici in ricostituzic.ne •

Numerose zollette di ADN nel nucleo e addossate al nucleolo. Ematossilina ferrica.

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CARYOLOGIA Vol. IV, Tav. XII.

S. MoNTEFOSCHI. - Metabolismo degli acidi nucleinici nell' ovogenesi di Anilocra phJ)sodes (Crust. lsopo.d.).

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CARYOLOGIA Vol. IV, Tav. XIII.

S. MoNTEFOSCHI. - Metabolismo degli acidi nucleinici nell' ovogenesi di

Anilocra physodes (Crust. Isopod.).

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MET ABOLISMO DEGLI ACID! NUCLEINICI 171

• 8 - Ovocite 200-250 J1 circa. Citoplasma basqfilo con grossi vacuoli, gocce acidofile alia peri­

feria - Colorazione del Dominici.

» 9 - Ovociti 60 J1 circa. Zolle F eulgen positive attorno al nucleolo e addossate alia parete m­

terna della membrana nucleare-Feulgen.

SUMMARY

The author studied the oogenesis of Anilocra physodes from the beginning of the meiosis to the

formation of the yolk and observed the following facts :

I) Before the beginning of the meiosis in the oogonia it was observed th'lt the follicolar cells

secrete granules containing RNA.

2) A decrease of the number of nucleoli runs parallel to an increase of RNA in the cytoplasm.

3) Before the formatio11 of the yolk in the oiicytes takes place there appears around the nucleolus

several granules which are Feulgen-positive. At the same tine the whole amount of the RNA which

was distributed in the cytoplasm moves to the periphery of the oiicyte.

4) While these granules shift now to the membrane of the nucleus a ring containing RNA appears

around the nucleus.

5) Then the pyroninophily of the peripheral cytoplasm disaggregates and the ring containing RNA

diffuses into the cytoplasm.

6) Then follows an appearance of acidophilic drops at the periphery of the oiicytes where the

pyroninophily is disaggregating.

7) Osmiophilic granules were observed in the centre of the cytoplasm.

These observations leac;ls the a. to the following hypotheses :

I ) The secretion of the follicolar cells may be related to the beginning of the meiosis.

2) The reduction of the number of the nucleoli in the oogonia and in the young oocytes may be

the means by which the nucleolus takes part in the synthesis of the ribonucleoproteins in the cytoplasm.

3) The gr811ules which are F eulgen-positive may consist of heterocromatin and also may be

responsible for the formation of the pyroninophilic ring. They may represent a cytological mechanism

for the supply of RNA to the cytoplasm of the oocytes.

4) The peripheral zone of the ciicytes containing RNA seems to be homologous to the basiphilic

formation observed in the oocytes of other animals.

5) The presence and the behaviour of this peripheral zone was related with the formation of

the yolk.

RIASSUNTO

E" stata studiata l'ovogenesi di Anilocra physodes nel periodo che va dal memento in cui gli

ovogoni entrano in meiosi, fino alia formazione delle prime gocce di vitello nel citoplasma degli ovociti.

Sono stati notati i seguenti fenomeni :

I) secrezione da parte delle cellule follicolari di granuli contenenti acido ribonucleinico, (ARN)

nella zona degli ovogoni, e prima che questi ultimi entrino in meiosi.

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2) riduzione del numero dei nucleoli ricchi di ARN negli ovogoni e net giovani ovociti m meiosi,

contemporanea all' aumento del suddetto acido nel loro citoplasma.

3) Formazione di zollette Feulgen positive attorno al nucleolo dell'ovocite in previtellogenesi con­

temporanea allo spostamento del contenuto in ARN citoplasmatico nella zona subcorticale di esso.

4) Spostamento delle zollette F eulgen positive alia periferia del nucleo e loro adesione alia mem­

brana nucleare contemporaneamente alia formazione di un anello pironinolilo (ARN) intorno al nucleo.

5) disgregazione della fascia pironinolila subcorticale e nuova diffusione di ARN nel citoplasma

dell'ovocite a partire dall'anello pironinolilo perinucleare.

6) F ormazione di goccie acidolile alia periferia dell' ovocite Ia dove si disgrega Ia fascia pironinolila.

7) formazione di goccie osmiolile e di vacuoli nella parte piit centrale del citoplasma dell'ovocite.

In seguito a tali osservazioni sono state avanzate le seguenti ipotesi :

I) La secrezione delle cellule follicolari puo essere in rapporto coll'inizio e lo svolgersi della meiosi.

2) La riduzione del numero dei nucleoli negli ovogoni e nei giovani ovociti puo rappresentare il

meccamsmo con cui il nucleo partecipa alia sintesi delle ribonucleoproteine citoplasmatiche.

3) Le zollette Feulgen positive che si formano attorno al nucleolo dell'ovocite e successivamente st

spostano alia periferia del nucleo possono essere di natura eterocromatica e dar luogo alia formazione

dell' anello pironinolilo perinucleare. Rappresenterebbero anche esse un meccanismo citologico deputato al

rifornimenlo di ARN al citoplasma dell'ovicite.

4) La fascia pironinolila della zona subcorticale dell' ovocite e stata omologata ad altre formazioni

basolile (fascie vitellogene e nuclei vitellini) studiate negli ovociti di altri animali e Ia sua presenza e il

suo comportamento sono messi in rapporto alia formazione del vitello.

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