1

Ciclo dell’acido citrico

2

Il metabolismo ossidativo dei Il metabolismo ossidativo dei carburanti metabolicicarburanti metabolici

I gruppi acetili derivati da carboidrati, I gruppi acetili derivati da carboidrati, amminoacidi e acidi grassi entrano nel amminoacidi e acidi grassi entrano nel ciclo dell’acido citrico dove vengono ciclo dell’acido citrico dove vengono ossidati a COossidati a CO22

3

4

Il Il piruvatopiruvato, derivato dal glucosio ad opera , derivato dal glucosio ad opera

della glicolisi, viene ossidato formando della glicolisi, viene ossidato formando

acetil CoA e COacetil CoA e CO22 per azione di per azione di 3 enzimi3 enzimi

organizzati nelorganizzati nel

complesso della piruvato deidrogenasicomplesso della piruvato deidrogenasi, ,

localizzato nei mitocondri delle cellule localizzato nei mitocondri delle cellule

eucariotiche.eucariotiche.

5

Reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi.In questa reazione sono coinvolti cinque coenzimi e tre enzimi.

6

Reazione complessiva catalizzata dal complesso della Reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi:piruvato deidrogenasi:

La decarbossilazione ossidativaLa decarbossilazione ossidativa

processo di ossidazione irreversibile:processo di ossidazione irreversibile: il gruppo carbossilico viene il gruppo carbossilico viene rimosso dal piruvato sotto forma di una molecola di CO2, rimosso dal piruvato sotto forma di una molecola di CO2, e i 2 atomi di carbonio che restano diventano il e i 2 atomi di carbonio che restano diventano il gruppo acetilicogruppo acetilico legato al CoA.legato al CoA.

7

La deidrogenazione e la decarbossilazione del piruvato ad La deidrogenazione e la decarbossilazione del piruvato ad Acetil CoA coinvolgono l’azione sequenziale di Acetil CoA coinvolgono l’azione sequenziale di

Ben 4 vitamine sono elementi essenziali di questo sistema: Ben 4 vitamine sono elementi essenziali di questo sistema:

la la tiaminatiamina per la TPP, per la TPP, la la riboflavinariboflavina per il FAD, per il FAD, la la niacinaniacina per il NAD per il NAD il il pantotenatopantotenato per il CoA per il CoA

3 enzimi diversi:3 enzimi diversi:piruvato deidrogenasi (E1), piruvato deidrogenasi (E1), diidrolipoil transacetilasi (E2) diidrolipoil transacetilasi (E2) diidrolipoil deidrogenasi (E3).diidrolipoil deidrogenasi (E3).

e di 5 gruppi prostetici o coenzimi:e di 5 gruppi prostetici o coenzimi: tiamina pirofosfato (TPP) tiamina pirofosfato (TPP) FAD FAD CoA CoA NAD NAD lipoato.lipoato.

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Organizzazione strutturale del complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi

E2= diidrolipoil transacetilasi

(24)

E1= piruvato deidrogenasi

(24)

E3= diidrolipoilDeidrogenasi (12)

Intero complesso (60 subunità)

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12

Regolazione del complesso multienzimatico

• l’attivazione avviene ad opera di una fosfoproteina fosfatasi che defosforila il cmplesso attraverso una reazione Mg2+ e Ca 2+ dipendente

•L’inattivazione del complesso si realizza per azione di una proteina chinasiproteina chinasi Mg 2+-

ATP-dipendente strettamente legata al complesso multienzimatico

• l’acetil CoA e il NADH prodotti nella reazione inibiscono la forma defosforilata (attiva) dell’enzima, ma stimolano la proteina chinasi, promuovendo l’interconversione del complesso nella sua forma inattiva

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• il CoA libero inibisce la proteina chinasi e il NAD

• quando aumenta il rapporto NADH/NAD+mitocondriale o il rapporto acetil-CoA/CoA come avviene durante la -ossidazione degli acidi grassi, il complesso della piruvato deidrogenasi è inattivato per azione della chinasi

• il piruvato è un potente inibitore della proteina chinasi, quindi alti livelli di piruvato inibiscono la chinasi e attivano il complesso

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Modificazione covalente della piruvato deidrogenasi negli eucarioti.

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Funzione principale del Ciclo è quella di generare equivalenti riducenti che sono utilizzati per produrre energia, cioè ATP, nel processo di trasporto degli elettroni-fosforilazione ossidativa

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CICLO DELL’ACIDO CITRICOIl ciclo dell’acido citirco ossida l’acetil CoA, il prodotto comune della degradazione di:• glucosio• acidi grassi• amminoacidi chetogenici

a CO2 e H2O con produzione di NADH e FADH2

• molti amminoacidi glucogenici possono essere ossidati attraverso il ciclo dell’acido citrico grazie alla loro demolizione in uno dei suoi intermedi

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L’attività degli enzimi dell’acido citrico:

• citrato sintasi

• isocitrato deidrogenasi

• -chetoglutarato

• è controllata dalla disponibilità di substrato e dall’inibizione a feedback da parte degli intermedi del ciclo

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1a reazione: formazione di citrato

• l’enzima citrato sintasi è inibito da elevate concentrazioni di NADH(H), ATP di succinil CoA e di acil-CoA che agiscono come effettori negativi

• il citrato a sua volta agisce come effettore negativo della fosfofruttochinasi-1

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L’intermedio citril-CoA non viene rilasciato dall’enzima durante la reazionee si ritiene che rimanga legato al sito catalitico della citrato sintasi

• la citrato sintasi è presente nella matrice mitocondriale ed ha un peso molecolare di 100.000

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2a reazione: formazione di isocitrato

• la reazione aconitasica è fortemente inibita da fluoroacetato ( CH2-F-COO- ) un composto presente in certe piante del Sud Africa

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Centro ferro-zolfo dell’aconotasi

La reazione dell’aconitasi non richiede cofattori , essa richiede la partecipazione di ioni ferroso che gli vengono forniti dal centro ferro-zolfo che è un componente essenziale dell ’attività idratasica dell’enzima

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3a reazione: decarbossilazione ssidativa dell’isocitrato per formare decarbossilazione ssidativa dell’isocitrato per formare a-chetoglutarato. a-chetoglutarato.

Isocitrato deidrogenasi: NAD+ dip. (matrice mitocondriale, ciclo di Krebs) NADP+ dip.(citosol, reazioni anaboliche)

• peso molecolare di 380.000

• è costituita da 8 sub unità identiche

• è stimolata da ADP e in alcuni casi da AMP

• è inibita da ATPe NADH+

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4a reazione:4a reazione:

decarbossilazionedecarbossilazione ossidativa dell’ a-ossidativa dell’ a-chetoglutarato in succinil-CoA e COchetoglutarato in succinil-CoA e CO2

• questo complesso è identico a quello della piruvato deidrogenasi ma non è regolato da reazioni di fosforilazione e defosforilazione

• il complesso è inibito da ATP, GTP da NADH e succinil CoA

• sembra attivato da ioni calcio

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La formazione di ATP o GTP a spese dell’energia rilasciata dalla decarbossilazione ossidativa dell’ a-chetoglutarato è un esempio di fosforilazione a livello del substrato

Il GTP formato dalla succinil-CoA sintetasi può donare il suo gruppo fosforico terminale all’ADP per formare ATP, mediante l’azione reversibile della nucleoside difosfato chinasi.

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Conversione del succinil-CoA a succinato5a reazione:

• fase intermedia in cui la molecola dell’enzima diventa fosforilata a livello di fase intermedia in cui la molecola dell’enzima diventa fosforilata a livello di un suo residuo di His presente nel sito attivo un suo residuo di His presente nel sito attivo

• Il gruppo fosforico viene quindi trasferito all’ADP o al GTP per formare Il gruppo fosforico viene quindi trasferito all’ADP o al GTP per formare ATP e GTP ATP e GTP E ‘ questa l’unica reazione metabolica in cui il GTP è preferito all’ ATP E ‘ questa l’unica reazione metabolica in cui il GTP è preferito all’ ATP

• le cellule animali hanno 2 isozimi, uno per l’ADP e un altro per il GDP. le cellule animali hanno 2 isozimi, uno per l’ADP e un altro per il GDP.

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Reazione della succinil CoA sintetasi

Un gruppo fosforico sostituisce il CoA legato all’enzimaformando un fosfato ad alta energia

Il succinil fosfato dona il gruppo fosforico a un residuodi His dell’enzima formando un fosfoenzima ad alta energia

Il gruppo fosforico viene trasferito dal residuo di His al gruppo fosforico terminale del GDP

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6a reazione: sintesi di fumarato

• la succinato deidrogenasi è fortementa inibita da malonato e ossalacetato• è attivata da ATP, fosfato inorganico e succinato

• il malonato inibisce l’enzima in modo competitivo, dovuto alla notevole somiglianza strutturale col succinato

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• è una flavoproteina che è inserita a differenza degli altri enzimi, nelle membrana mitocondriale interna favorendo il trasferimento diretto degli elettroni alla catena respiratoria

• è’ costituito da due subunità di 70.000 e 30.000 m.w. rispettivamente

La succinato deidrogenasi

• la prima contiene il sito di legame per il substrato, il FAD legato alla lisina e 4 atomi di ferro + 4 atomi di zolfo

• la seconda contiene solo ferro e zolfo

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7a reazione: idratazione del fumarato per produrre malato

• la fumarasi è un tetramero con M.W. Di 200.000

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Ultima reazione: ossidazione del malato a ossalacetato

• in questa reazione con l’ossidazione del malato ad ossalacetato si rigenera il prodotto di partenza che così può riprendere il ciclo

• l’ossalacetato può essere convertito anche in fosfoenol-piruvato o transaminato ad aspartato

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Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo di Krebs di intermedi.Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo di Krebs di intermedi.

In condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi perfetto tra le reazioni che In condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi perfetto tra le reazioni che rimuovono intermedi dal ciclo e quelle che invece lo riforniscono, e quindi la rimuovono intermedi dal ciclo e quelle che invece lo riforniscono, e quindi la concentrazione di questi composti resta costante.concentrazione di questi composti resta costante.

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CARENZA DI PIRUVATO DEIDROGENASICARENZA DI PIRUVATO DEIDROGENASI

• Deficienze dei differenti componenti catalitici o subunità regolatrici

• I bambini con questo deficit presentano alti livelli di lattato, piruvato e alaninalattato, piruvato e alanina che causano acidosi lattica cronica . . Presentano inoltre gravi danni neurologicigravi danni neurologici. In molti casi questa carenza comporta la morte dell’individuo

• La diagnosi viene fatta saggiando il complesso enzimatico e/o le sue subunità enzimatiche in colture di fibroblasti fibroblasti di pelle prelevata dal paziente

•In alcuni casi i pazienti rispondono a un regime regime dieteticodietetico di tipo chetogenico con bassi livelli di carboidrati

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DEFICIT DI FUMARASIDEFICIT DI FUMARASI

• Il deficit di enzimi del ciclo degli acidi ticarbossilici è raro, tuttavia sono stati riportati alcuni casi in cui è presente un grave deficit di fumarasifumarasi sia a livello mitocondrialemitocondriale che citosolicocitosolico

• È presente un grave danno neurologicodanno neurologico con encefalopatia encefalopatia e distoniadistonia che si manifestano precocementa dopo la nascita

• Le urine contengono quantità anomale di fumaratofumarato e di una o più delle seguenti sostanze : succinato,succinato, -chetoglutarato-chetoglutarato, citratocitrato e malatomalato

• Entrambi i genitori presentano livelli di attività livelli di attività enzimaticaenzimatica dimezzatidimezzati rispetto al normale come si verifica nei disordini su base autosomica recessivaautosomica recessiva

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Una molecola di glucosio può potenzialmente promuovere la sintesi di circa 38 ATP in condizioni di aerobiosi, cioè quando funziona il ciclo dell' acido citrico.

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L’energia liberata dalle reazioni dell’intero L’energia liberata dalle reazioni dell’intero processo viene conservata sotto forma di processo viene conservata sotto forma di energia chimica mediante la formazione di un energia chimica mediante la formazione di un ATP o di un GTP e per riduzione di 3 NADATP o di un GTP e per riduzione di 3 NAD++ e di e di un FADun FAD++. .

L’energia liberata dalle ossidazioni L’energia liberata dalle ossidazioni viene efficacemente conservata nel viene efficacemente conservata nel ciclociclo

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Il ciclo dell’acido citrico produce di per sé Il ciclo dell’acido citrico produce di per sé una sola molecola di ATP per giro (nella una sola molecola di ATP per giro (nella conversione del succinil-CoA a succinato).conversione del succinil-CoA a succinato).

Nelle 4 reazioni di ossidazione presenti nel Nelle 4 reazioni di ossidazione presenti nel ciclo viene prodotto un grande flusso di ciclo viene prodotto un grande flusso di elettroni che entrano nella catena elettroni che entrano nella catena respiratoria, portando alla formazione di un respiratoria, portando alla formazione di un gran numero di molecole di ATP nella gran numero di molecole di ATP nella fosforilazione ossidativafosforilazione ossidativa

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Nella fosforilazione ossidativa il passaggio di 2 Nella fosforilazione ossidativa il passaggio di 2 elettroni dal NADH all’ossigeno porta alla elettroni dal NADH all’ossigeno porta alla formazione di circa 2.5 molecole di ATPformazione di circa 2.5 molecole di ATP

Il passaggio di 2 elettroni dal FADHIl passaggio di 2 elettroni dal FADH22 all’ossigeno ne forma circa 1.5.all’ossigeno ne forma circa 1.5.

Questa stechiometria ci permette di calcolare Questa stechiometria ci permette di calcolare il numero totale di ATP dalla ossidazione il numero totale di ATP dalla ossidazione completa del glucosio. completa del glucosio.

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Quando le 2 molecole di piruvato sono ossidate Quando le 2 molecole di piruvato sono ossidate completamente a 6 molecole di COcompletamente a 6 molecole di CO22 dalle dalle reazioni del complesso della piruvato reazioni del complesso della piruvato deidrogenasi e del ciclo dell’acido citrico e gli deidrogenasi e del ciclo dell’acido citrico e gli elettroni vengono trasferiti all’Oelettroni vengono trasferiti all’O22 dalla catena dalla catena respiratoria,respiratoria,

si ottengono tramite la fosforilazione si ottengono tramite la fosforilazione ossidativa ben 32 molecole di ATP per ossidativa ben 32 molecole di ATP per molecola di glucosiomolecola di glucosio

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Questo processo ciclico a 8 tappe necessario per Questo processo ciclico a 8 tappe necessario per ossidare a COossidare a CO22 il semplice gruppo acetilico a 2 il semplice gruppo acetilico a 2 atomi di carbonio può sembrare una complicazione atomi di carbonio può sembrare una complicazione inutile e soprattutto non in linea con il principio inutile e soprattutto non in linea con il principio della massima economia della logica molecolare della massima economia della logica molecolare delle cellule. delle cellule.

La funzione del ciclo di Krebs non è però La funzione del ciclo di Krebs non è però esclusivamente quella di ossidare l’acetato; questa esclusivamente quella di ossidare l’acetato; questa via infatti è il cuore del metabolismo intermedio.via infatti è il cuore del metabolismo intermedio.

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I prodotti finali a 4 o 5 atomi di carbonio di molti I prodotti finali a 4 o 5 atomi di carbonio di molti processi catabolici entrano nel ciclo e possono processi catabolici entrano nel ciclo e possono servire come sostanze nutrienti.servire come sostanze nutrienti.

Per esempio, l’ossalacetato e l’a-chetoglutarato si Per esempio, l’ossalacetato e l’a-chetoglutarato si formano rispettivamente formano rispettivamente dall’aspartatodall’aspartato e dal e dal glutammatoglutammato quando vengono degradate le quando vengono degradate le proteine introdotte nell’organismo con la dieta.proteine introdotte nell’organismo con la dieta.

In alcune situazioni, dal ciclo possono essere In alcune situazioni, dal ciclo possono essere prelevati intermedi per usarli come precursori in prelevati intermedi per usarli come precursori in una varietà di vie biosintetiche.una varietà di vie biosintetiche.

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Negli organismi Negli organismi aerobiciaerobici, il ciclo dell’acido citrico è , il ciclo dell’acido citrico è una via anfibolica (serve sia ai processi anabolici sia una via anfibolica (serve sia ai processi anabolici sia a quelli catabolici). Non soltanto agisce nel a quelli catabolici). Non soltanto agisce nel catabolismo dei carboidrati, degli acidi grassi e catabolismo dei carboidrati, degli acidi grassi e degli aminoacidi, ma produce anche precursori degli aminoacidi, ma produce anche precursori per molte vie biosinteticheper molte vie biosintetiche

a-chetoglutarato = aspartato a-chetoglutarato = aspartato (prodotto per (prodotto per transamminazione)transamminazione)

ossalacetato = glutammato ossalacetato = glutammato (prodotto per (prodotto per transamminazione).transamminazione).

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Attraverso Attraverso l’aspartato e il glutammatol’aspartato e il glutammato, gli atomi , gli atomi di carbonio di carbonio dell’ossalacetato e dell’a-dell’ossalacetato e dell’a-chetoglutaratochetoglutarato vengono usati per costruire altri vengono usati per costruire altri aminoacidi,aminoacidi, come pure i come pure i nucleotidi purinici e nucleotidi purinici e pirimidinici. pirimidinici.

L’ossalacetatoL’ossalacetato viene convertito in glucosio nel viene convertito in glucosio nel processo della processo della gluconeogenesi. gluconeogenesi.

Il succinil-CoAIl succinil-CoA è un intermedio fondamentale nella è un intermedio fondamentale nella biosintesi dell’eme.biosintesi dell’eme.

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Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo di Krebs Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo di Krebs di intermedi.di intermedi.In condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi In condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi perfetto tra le reazioni che rimuovono intermedi dal perfetto tra le reazioni che rimuovono intermedi dal ciclo e quelle che invece lo riforniscono, e quindi la ciclo e quelle che invece lo riforniscono, e quindi la concentrazione di questi composti resta costante.concentrazione di questi composti resta costante.

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La più importante reazione anaplerotica che La più importante reazione anaplerotica che avviene nel rene e nel fegato è la carbossilazione avviene nel rene e nel fegato è la carbossilazione reversibile del piruvato per formare ossalacetato, reversibile del piruvato per formare ossalacetato, catalizzata dalla catalizzata dalla piruvato carbossilasi. piruvato carbossilasi.

Quando il ciclo dell’acido citrico è povero di Quando il ciclo dell’acido citrico è povero di ossalacetatoossalacetato o di qualsiasi altro intermedio, o di qualsiasi altro intermedio,

il piruvato viene carbossilato a il piruvato viene carbossilato a ossalacetato.ossalacetato.

L’aggiunta enzimatica di un gruppo carbossilico alla L’aggiunta enzimatica di un gruppo carbossilico alla molecola del piruvato richiede energia, che viene molecola del piruvato richiede energia, che viene fornita dall’ATP; l’energia libera necessaria a legare fornita dall’ATP; l’energia libera necessaria a legare un gruppo carbossilico è quasi uguale a quella un gruppo carbossilico è quasi uguale a quella ricavabile da una molecola di ATP. ricavabile da una molecola di ATP.

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La piruvato carbossilasiLa piruvato carbossilasi è un enzima è un enzima regolatorioregolatorio ed è praticamente inattivo in assenza ed è praticamente inattivo in assenza di Ac-CoA (modulatore positivo).di Ac-CoA (modulatore positivo).

Ogni qualvolta l’Ogni qualvolta l’Ac-CoA Ac-CoA è presente in è presente in eccesso eccesso stimola la reazione della stimola la reazione della piruvato carbossilasipiruvato carbossilasi a a produrre più ossalacetato, consentendo quindi al produrre più ossalacetato, consentendo quindi al ciclo di utilizzare più Ac-CoA nella reazione della ciclo di utilizzare più Ac-CoA nella reazione della citrato sintasi.citrato sintasi.

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La reazione della La reazione della piruvato carbossilasipiruvato carbossilasi richiede la richiede la biotinabiotina; questa vitamina è un ; questa vitamina è un trasportatore specializzato di gruppi a un atomo di trasportatore specializzato di gruppi a un atomo di carbonio nella loro forma più ossidata: carbonio nella loro forma più ossidata: la COla CO22

I gruppi carbossilici sono attivati in una reazione I gruppi carbossilici sono attivati in una reazione

che che idrolizza ATP e lega COidrolizza ATP e lega CO22 all’enzima all’enzima a a

cui è legata la cui è legata la biotina.biotina. Questa Questa COCO22 “attivata” “attivata”

viene quindi donata a un accettore in una reazione viene quindi donata a un accettore in una reazione

di di carbossilazionecarbossilazione

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La piruvato carbossilasi è composta da 4 La piruvato carbossilasi è composta da 4 subunitàsubunità identiche,identiche, contenenti ognuna una contenenti ognuna una

molecola di molecola di biotina legata covalentemente biotina legata covalentemente mediante un legame amidico con il mediante un legame amidico con il gruppo aminico e di uno specifico gruppo aminico e di uno specifico residuo di lisina.residuo di lisina.

La reazione procede in 2 fasi;La reazione procede in 2 fasi;

• prima il gruppo carbossilico derivato dall’HCOprima il gruppo carbossilico derivato dall’HCO33--

viene legato alla biotina, viene legato alla biotina,

•poi il gruppo è trasferito al piruvato per formare poi il gruppo è trasferito al piruvato per formare ossalacetatoossalacetato

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REGOLAZIONE DELCICLO DELL’ACIDO

CITRICO

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Il ciclo dell’acido citrico è regolato a livello delle sue tre Il ciclo dell’acido citrico è regolato a livello delle sue tre tappe esoergonichetappe esoergoniche

Il flusso dei metaboliti attraverso il ciclo dell’acido citrico è Il flusso dei metaboliti attraverso il ciclo dell’acido citrico è sotto stretto controllo. sotto stretto controllo.

Tre fattori governano la velocità del flusso attraverso il ciclo: Tre fattori governano la velocità del flusso attraverso il ciclo:

11.la disponibilità di substrato, .la disponibilità di substrato, 2.2.l’inibizione da accumulo di prodotti l’inibizione da accumulo di prodotti 3.3.l’inibizione allosterica retroattiva (a feedback) dei primi l’inibizione allosterica retroattiva (a feedback) dei primi

enzimi del ciclo da parte degli ultimi intermedi.enzimi del ciclo da parte degli ultimi intermedi.

Vi sono Vi sono 3 tappe3 tappe fortemente esoergoniche nel ciclo: fortemente esoergoniche nel ciclo:

1.1. reaz. catalizzata dalla reaz. catalizzata dalla citrato sintasicitrato sintasi

2.2. reaz. catalizzata dalla reaz. catalizzata dalla isocitrato deidrogenasiisocitrato deidrogenasi

3.3. reaz. catalizzata dalla reaz. catalizzata dalla a-chetoglutarato deidrogenasia-chetoglutarato deidrogenasi

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In condizioni normali la velocità della In condizioni normali la velocità della glicolisi e del glicolisi e del acido citricoacido citrico sono coordinate in modo che la quantità sono coordinate in modo che la quantità di glucosio metabolizzato a piruvato sia soltanto quella di glucosio metabolizzato a piruvato sia soltanto quella che poi entra nel ciclo dell’acido citrico sotto forma di che poi entra nel ciclo dell’acido citrico sotto forma di Acetil-CoA. Acetil-CoA.

Piruvato, lattato e Acetil-CoAPiruvato, lattato e Acetil-CoA sono mantenuti a sono mantenuti a concentrazioni stazionarie. concentrazioni stazionarie.

La velocità della glicolisi viene quindi adeguata a quella La velocità della glicolisi viene quindi adeguata a quella del ciclo dell’acido citrico non soltanto dai livelli di del ciclo dell’acido citrico non soltanto dai livelli di ATP e ATP e

di NADH,di NADH, che sono componenti della che sono componenti della fase sia fase sia glicolitica sia respiratoria dell’ossidazione glicolitica sia respiratoria dell’ossidazione del glucosio,del glucosio, ma anche dal ma anche dal citrato.citrato.

Quest’ultimo, cioè il prodotto della prima tappa del ciclo, è Quest’ultimo, cioè il prodotto della prima tappa del ciclo, è anche un anche un inibitore allostericoinibitore allosterico della fosforilazione del della fosforilazione del fruttosio 6-fosfato da parte della fruttosio 6-fosfato da parte della fosfofrutto chinasi-1 fosfofrutto chinasi-1 della via glicolitica.della via glicolitica.

64Il ciclo del citrato come piattaforma girevole del metabolismo.

65

L‘ aconitasi funziona in condizioni vicine all' equilibrio, per funziona in condizioni vicine all' equilibrio, per cui la velocità di cui la velocità di consumo del consumo del citratocitrato dipende dipende dall'attività:dall'attività:

1.1.dell'isocitrato dell'isocitrato deidrogenasideidrogenasi NAD+-dipendente, NAD+-dipendente, che in che in vitro viene fortemente inibita dal suo prodotto vitro viene fortemente inibita dal suo prodotto NADH.NADH.

2.2. La citrato sintasiLa citrato sintasi viene anche viene anche inibita dal NADHinibita dal NADH, ma è , ma è meno sensibile dell'isocitrato deidrogenasi alle variazioni meno sensibile dell'isocitrato deidrogenasi alle variazioni della della [NADH].[NADH].

La citrato sintasi La citrato sintasi è anche inibita e dal citrato che è anche inibita e dal citrato che compete con l'ossalacetato)compete con l'ossalacetato)

3.3. l'inibizione l'inibizione dell‘a-chetogluraratodell‘a-chetoglurarato deidrogenasideidrogenasi da da parte del NADH e del succinil-CoA. parte del NADH e del succinil-CoA. Il succinil-CoAIl succinil-CoA compete compete anche con anche con l'acetil-CoAl'acetil-CoA nella reazione della citrato sintasi nella reazione della citrato sintasi ((inibizione retroattiva competitivainibizione retroattiva competitiva). ).

Questo sistema di inibizioni combinate aiuta a Questo sistema di inibizioni combinate aiuta a mantenere regolato il ciclo dell' acido citrico in mantenere regolato il ciclo dell' acido citrico in modo coordinato.modo coordinato.

66

Altri meccanismi regolatoriAltri meccanismi regolatori

Studi in vitro riguardanti gli enzimi del ciclo dell'acido Studi in vitro riguardanti gli enzimi del ciclo dell'acido citrico hanno permesso di identificare alcuni inibitori e citrico hanno permesso di identificare alcuni inibitori e attivatori allosterici.attivatori allosterici.

L’ADP è un attivatore allostericoL’ADP è un attivatore allosterico dell'isocitrato dell'isocitrato deidrogenasi, mentre l'ATP inibisce questo enzima. deidrogenasi, mentre l'ATP inibisce questo enzima.

Il Ca2+Il Ca2+ oltre alle sue altre numerose funzioni cellulari, oltre alle sue altre numerose funzioni cellulari, regola il ciclo dell' acido citrico in diversi punti: regola il ciclo dell' acido citrico in diversi punti: attivaattiva la la piruvato deidrogenasi fosfatasipiruvato deidrogenasi fosfatasi, che a sua volta , che a sua volta attiva il complesso della attiva il complesso della piruvato deidrogenasipiruvato deidrogenasi per la per la produzione di produzione di acetil-CoA.acetil-CoA.

Il Ca2+,Il Ca2+, attiva anche attiva anche l'isocitrato deidrogenasi e l‘a l'isocitrato deidrogenasi e l‘a chetoglutarato deidrogenasichetoglutarato deidrogenasi

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Regolazione del Regolazione del ciclo dell’acido ciclo dell’acido citrico.citrico. Questo schema del ciclo dell’acido citrico, che comprende anche la reazione della piruvato deidrogenasi, indica i punti di inibizione (ottagoni rossi)(ottagoni rossi) e gli intermedi della via che agiscono da inibitori (frecce rosse frecce rosse tratteggiatetratteggiate).).

ADP e CaADP e Ca++++ (sfere verdi) sono invece attivatori.

68

Così Così il Ca2+,il Ca2+, il segnale che stimola la contrazione muscolare, il segnale che stimola la contrazione muscolare, stimola anche la produzione dell'ATP che andrà a supportarlastimola anche la produzione dell'ATP che andrà a supportarla

Nel muscolo cardiacoNel muscolo cardiaco, dove il ciclo dell' acido , dove il ciclo dell' acido citrico è attivo, il flusso dei metaboliti lungo il ciclo è citrico è attivo, il flusso dei metaboliti lungo il ciclo è proporzionale alla velocità del consumo cellulare di proporzionale alla velocità del consumo cellulare di ossigenoossigeno

Poiché il consumo di ossigeno, la riossidazione del NADH e la Poiché il consumo di ossigeno, la riossidazione del NADH e la produzione di ATP sono saldamente accoppiatiproduzione di ATP sono saldamente accoppiati, , il ciclo dell'acido il ciclo dell'acido citrico deve essere regolato da meccanismi retroattivi che citrico deve essere regolato da meccanismi retroattivi che coordinino la produzione di NADH con il consumo di energia.coordinino la produzione di NADH con il consumo di energia.

69

I più importanti regolatori del ciclo dell'acido citrico sono i suoi substrati, l'acetil-CoA e l'ossalacetato, e il suo prodotto, NADH.

70

Sia l'acetil-CoA sia l'ossalacetato sono Sia l'acetil-CoA sia l'ossalacetato sono presenti nei mitocondri a una concentrazione presenti nei mitocondri a una concentrazione che non è in grado di saturare la citrato che non è in grado di saturare la citrato sintasi.sintasi.

l flusso metabolico lungo questo enzima l flusso metabolico lungo questo enzima varia quindi in funzione della concentrazione varia quindi in funzione della concentrazione di substrato e viene controllato dalla di substrato e viene controllato dalla disponibilità di quest'ultimo. disponibilità di quest'ultimo.

Si è già visto che la produzione di acetil-CoA Si è già visto che la produzione di acetil-CoA a partire da piruvato viene regolata dall' a partire da piruvato viene regolata dall' attività della piruvato deidrogenasi. attività della piruvato deidrogenasi.

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. . La concentrazione di ossalacetato, che è in La concentrazione di ossalacetato, che è in equilibrio con il malato, fluttua a seconda del equilibrio con il malato, fluttua a seconda del rapporto [NADH]/[NAD+] seguendo rapporto [NADH]/[NAD+] seguendo l'espressione all'equilibriol'espressione all'equilibrio

K K = = [ossalacetato][NADH][ossalacetato][NADH] [malato] [NAD+][malato] [NAD+]

Se, per esempio, aumenta il carico di lavoro Se, per esempio, aumenta il carico di lavoro del muscolo e la respirazione, nei mitocondri del muscolo e la respirazione, nei mitocondri la [NADH] diminuisce.la [NADH] diminuisce.

Il conseguente aumento della [ossalacetato] Il conseguente aumento della [ossalacetato] stimola l'attività della citrato sintasi, che stimola l'attività della citrato sintasi, che controlla la velocità di formazione del citrato.controlla la velocità di formazione del citrato.

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Diversamente da quanto accade agli enzimi che limitano la velocità della glicolisi e del metabolismo del glicogeno, i quali regolano il flusso mediante

• elaborati sistemi di controllo allosterico

• cicli del substrato

• modificazioni covalenti

gli enzimi regolatori del ciclo dell' acido citrico sembrano controllare il flusso principalmente mediante tre semplici meccanismi:

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(1) disponibilità di substrato

(2) inibizione da prodotto

(3) inibizione retroattiva competitiva da parte di intermedi prodotti più avanti lungo il ciclo

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fine