DIAGNOSI PRENATALE NELLE MALATTIE DIAGNOSI PRENATALE NELLE MALATTIE RARE: aspetti della diagnosi citogenetica RARE: aspetti della diagnosi citogenetica

e sul DNAe sul DNA

Gabriella Gabriella RestagnoRestagno

S.S. Diagnostica Molecolare e Test Genetici Integra tiS.S. Diagnostica Molecolare e Test Genetici Integra tiAO AO OIRMOIRM--S.AnnaS.Anna , Torino, Torino

gabriella.restagno@oirmsantanna.piemonte.itgabriella.restagno@oirmsantanna.piemonte.it

Torino, 27 GIUGNO 2008

�� Questioni eticheQuestioni etiche

�� Qualche esempio:Qualche esempio:�� Cardiopatie congeniteCardiopatie congenite

�� Sindrome di Sindrome di PraderPrader--WilliWilli

�� Forme atipiche di fibrosi cisticaForme atipiche di fibrosi cistica

�� Le tecnologie impiegate per la diagnosi Le tecnologie impiegate per la diagnosi

EticaEtica

�� L’etica ed i L’etica ed i princìpiprincìpi etici si estendono a tutte le etici si estendono a tutte le sfere dell’attività umanasfere dell’attività umana

�� Si applica ai rapporti interpersonali, con il mondo Si applica ai rapporti interpersonali, con il mondo animale e con l’ambienteanimale e con l’ambiente

�� Deve governare le interazioni non solo nella Deve governare le interazioni non solo nella ricerca ma anche nella vita in genere e nella ricerca ma anche nella vita in genere e nella societàsocietà

�� Serve ad identificare i comportamenti buoni, Serve ad identificare i comportamenti buoni, desiderabili o accettabili, e a dare le ragioni per desiderabili o accettabili, e a dare le ragioni per tali scelte comportamentalitali scelte comportamentali

�� Include l’intero campo della scienza morale, e va Include l’intero campo della scienza morale, e va aldilà dei aldilà dei princìpiprincìpi morali e delle regole di morali e delle regole di condotta condotta

Etica e geneticaEtica e genetica

�� I genetisti hanno l’obbiettivo e la responsabilità di I genetisti hanno l’obbiettivo e la responsabilità di favorire la salute e il benessere dei pazienti, delle loro favorire la salute e il benessere dei pazienti, delle loro famiglie e della comunità in cui prestano servizio. famiglie e della comunità in cui prestano servizio. Questo criterio di responsabilità professionale non Questo criterio di responsabilità professionale non richiede semplicemente di eseguire i test genetici e di richiede semplicemente di eseguire i test genetici e di utilizzare le nuove tecnologie ma di utilizzarle in modo utilizzare le nuove tecnologie ma di utilizzarle in modo non acritico. non acritico.

�� L’etica può influenzare il genetista a diversi livelli:L’etica può influenzare il genetista a diversi livelli:

1.1. Etica personaleEtica personale

2.2. Etica professionaleEtica professionale

3.3. Etica specifica della professione (protocolli scientifici e Etica specifica della professione (protocolli scientifici e standard di organizzazione del laboratorio, e di standard di organizzazione del laboratorio, e di avanzamento della professionalità)avanzamento della professionalità)

Aspetti etici peculiari in Aspetti etici peculiari in

geneticagenetica

1.1. L’etica del contatto L’etica del contatto indirettoindiretto con il paziente: il contatto con il con il paziente: il contatto con il paziente è generalmente mediato dal clinico. Ciò pone un paziente è generalmente mediato dal clinico. Ciò pone un problema sul principio di autonomia, ma anche su quelli di problema sul principio di autonomia, ma anche su quelli di giustizia, giustizia, beneficialitàbeneficialità e non e non maleficenzamaleficenza. .

2.2. Il lavoro di laboratorio presenta rischi fisici sia per i laboraIl lavoro di laboratorio presenta rischi fisici sia per i laboratoristi toristi sia per il paziente: per sia per il paziente: per eses, lo scambio di campioni può portare ad , lo scambio di campioni può portare ad una diagnosi scorretta e ad un trattamento inappropriato per il una diagnosi scorretta e ad un trattamento inappropriato per il paziente. Inoltre c’è il rischio dell’uso scorretto delle informpaziente. Inoltre c’è il rischio dell’uso scorretto delle informazioni azioni derivanti dall’analisi (informazioni sensibili, discriminazione)derivanti dall’analisi (informazioni sensibili, discriminazione)..

3.3. Conservazione dei campioni di DNA per controlli di qualità, Conservazione dei campioni di DNA per controlli di qualità, sviluppi di nuove metodologie, ricerca: sorgente di informazionisviluppi di nuove metodologie, ricerca: sorgente di informazioniaggiuntive successive sul paziente (e sui suoi familiari) cui ilaggiuntive successive sul paziente (e sui suoi familiari) cui ilpaziente può non avere dato il consenso paziente può non avere dato il consenso

La diagnosi molecolare delle La diagnosi molecolare delle

malattie genetichemalattie genetiche

��Lo sviluppo della genetica molecolare ha portato Lo sviluppo della genetica molecolare ha portato all’individuazione di numerose mutazioni genetiche all’individuazione di numerose mutazioni genetiche che sottendono a malattie spesso di notevole gravità che sottendono a malattie spesso di notevole gravità e incurabili (ad es., la malattia di e incurabili (ad es., la malattia di HuntingtonHuntington, il rene , il rene policisticopolicistico dell’adulto dell’adulto autosomicoautosomico dominante ecc..)dominante ecc..)

��Ciò permette di diagnosticare la malattia nel soggetto Ciò permette di diagnosticare la malattia nel soggetto sintomatico, ma ha fatto sorgere rilevanti problemi sintomatico, ma ha fatto sorgere rilevanti problemi etici.etici.

��Diagnosi di malattie genetiche croniche nei Diagnosi di malattie genetiche croniche nei soggetti soggetti asintomaticiasintomatici a rischio a rischio ��Identificazione di marcatori genetici di rischio di Identificazione di marcatori genetici di rischio di malattiamalattia��Diagnosi prenatale di malattie genetiche cronicheDiagnosi prenatale di malattie genetiche croniche

Diagnosi prenatale di malattie Diagnosi prenatale di malattie genetiche cronichegenetiche croniche

�� La diagnosi prenatale di malattie genetiche è oggi molto La diagnosi prenatale di malattie genetiche è oggi molto diffusa, in presenza di un rischio noto di trasmissione di diffusa, in presenza di un rischio noto di trasmissione di particolari malattie non curabili e clinicamente gravi, particolari malattie non curabili e clinicamente gravi, quali la distrofia muscolare di Duchenne. È ovvio che quali la distrofia muscolare di Duchenne. È ovvio che questa indagine prelude alla possibilità di interruzione questa indagine prelude alla possibilità di interruzione della gravidanza in caso di positività del test. della gravidanza in caso di positività del test.

�� La diagnosi genetica prenatale pone almeno due La diagnosi genetica prenatale pone almeno due problemi etici: problemi etici: �� il primo è quello relativo alla sensibilità e al valore predittiil primo è quello relativo alla sensibilità e al valore predittivo del vo del

test geneticotest genetico�� il secondo quello relativo alla scelta di interruzione di gravidil secondo quello relativo alla scelta di interruzione di gravidanza anza

in caso di malattie genetiche scarsamente invalidanti o che si in caso di malattie genetiche scarsamente invalidanti o che si manifestano solo in età adulta o avanzata. manifestano solo in età adulta o avanzata.

LE NUOVE TECNOLOGIE PONGONO NUOVI PROBLEMI ETICI

•Pannelli per l’analisi rapida delle mutazioni più frequenti, determinate su basi epidemiologiche (kit anche fai da te)

•Analisi contemporanea di un elevato numero di mutazioni note e non note, anche in geni diversi: (multiplex PCR)

•Sequenziamento in tempo reale

•Analisi con microarray e macroarry

•WGA, CGH ecc…

Problemi etici in genetica: Problemi etici in genetica: : : interpretazione del significato interpretazione del significato

delle mutazionidelle mutazioni�� DatabaseDatabase

�� Anamnesi familiareAnamnesi familiare

�� Mutazioni “de novo” Mutazioni “de novo”

�� Espressione variabile (geni modificatori, Espressione variabile (geni modificatori, eterogeneità eterogeneità allelicaallelica o di o di locuslocus, fattori , fattori ambientali, ambientali, pleiotropismopleiotropismo))

�� Penetranza incompletaPenetranza incompleta

Prevalenza delle cardiopatie congenite Prevalenza delle cardiopatie congenite (CC)(CC)

�� Sono la forma più comune di difetto alla nascita Sono la forma più comune di difetto alla nascita (1/145 nati vivi)(1/145 nati vivi)

�� Un quarto associato a Un quarto associato a dismorfismidismorfismi (diagnosi di (diagnosi di sindrome)sindrome)

�� Nel 11.9% associate anomalie cromosomiche, Nel 11.9% associate anomalie cromosomiche, nel 7,4% mutazioni genichenel 7,4% mutazioni geniche

�� Nelle CC isolate raramente la causa è Nelle CC isolate raramente la causa è monogenica; poiché la prevalenza nei familiari di monogenica; poiché la prevalenza nei familiari di pazienti con CC isolata è superiore a quella solo pazienti con CC isolata è superiore a quella solo probabilistica (2%probabilistica (2%--16% contro 0,4%16% contro 0,4%--0,8%) si 0,8%) si ipotizza una componente geneticaipotizza una componente genetica

CAUSE GENETICHE NOTE DI CC (20%)CAUSE GENETICHE NOTE DI CC (20%)

�� SINDROMI MENDELIANE SINDROMI MENDELIANE

�� SINDROMI CROMOSOMICHESINDROMI CROMOSOMICHE

�� EREDITA’ MENDELIANAEREDITA’ MENDELIANA--NON SINDROMICANON SINDROMICA

�� NON MENDELIANENON MENDELIANE--NON SINDROMICHE NON SINDROMICHE

I principali stadi dello sviluppo cardiaco nel topo e I principali stadi dello sviluppo cardiaco nel topo e l’espressione delle proteine nella l’espressione delle proteine nella morfogenesimorfogenesi (studi (studi

su topi “knockout”)su topi “knockout”)

Da Nemer M, 2008

I siti delle CC maggiori. I siti delle CC maggiori. Lo stesso fattore di trascrizione è Lo stesso fattore di trascrizione è correlato a difetti differenticorrelato a difetti differenti, e , e lo stesso difetto può essere lo stesso difetto può essere

causato da più di un genecausato da più di un gene (eterogeneità (eterogeneità allelicaallelica ed ed eterogeneità eterogeneità geneticagenetica) )

Da Nemer M, 2008

Tecnologie di diagnosi citogenetica e sul DNA

DPNinvasiva

CariotipoCariotipo ““classicoclassico””

�� Prepared from chromosome Prepared from chromosome metaphase spreadsmetaphase spreads

�� Requires dividing cellsRequires dividing cells

�� Each chromosome has its Each chromosome has its unique staining patternunique staining pattern

�� Results need to be read and Results need to be read and interpreted by a certified interpreted by a certified cytogeneticistcytogeneticist

�� Resolution of technique is ~5 Resolution of technique is ~5 MbMb

Test “rapidi” prenatali per le Test “rapidi” prenatali per le sindromi da sindromi da aneuploidiaaneuploidia

�� QFQF--PCRPCR

�� FISHFISH

�� ArrayArray-- CGHCGH

QF-PCR Triploidy

QF-PCR Trisomy 13

QF-PCR Trisomy 21

QF-PCR Trisomy 18

Casistica Centro Ecografia e Struttura di Genetica Casistica Centro Ecografia e Struttura di Genetica S.AnnaS.Anna Torino 2003Torino 2003 -- 2007 (6050 casi):2007 (6050 casi):

-- 4704 QF4704 QF--PCR su LAPCR su LA

-- 1340 QF1340 QF--PCR su CVPCR su CV

Risultati patologici:Risultati patologici: 278/6050 (4,5%) 278/6050 (4,5%)

163 163 trisomietrisomie 21 (2,7%) 21 (2,7%)

62 trisomie 18 (1,02%)62 trisomie 18 (1,02%)

20 trisomie 13 (0,3%) 20 trisomie 13 (0,3%)

5 triploidie (0,08%)5 triploidie (0,08%)

15 Turner s. (0,25%)15 Turner s. (0,25%)

+21, +18 and +13 +21, +18 and +13 mosaicismimosaicismi : 13 (0,21%): 13 (0,21%)

METODICA FISHMETODICA FISH

�� FISH FISH (fluorescence (fluorescence in situin situ hybridization)hybridization)

�� Requires investigation of several dividing cellsRequires investigation of several dividing cells

�� Microscopic visualization of fluorescent probes Microscopic visualization of fluorescent probes specifically binding to complementary regions of specifically binding to complementary regions of the chromosomethe chromosome

�� Resolution 100 Resolution 100 –– 500 kb500 kb

FISH per Diagnosi di FISH per Diagnosi di DiGeorgeDiGeorge S.S.

SNPsSNPs per Diagnosi di per Diagnosi di DiGeorgeDiGeorge S.S.

SNPsSNPs per Diagnosi di per Diagnosi di DiGeorgeDiGeorge S.S.

aCGHaCGH permette il passaggio da dati soggettivi a dati permette il passaggio da dati soggettivi a dati quantitativiquantitativi

Today’s predominant technology

Microscopic imaging of chromosomes

aCGH provides a visual representation of data generated

La corretta diagnosi è fondamentale La corretta diagnosi è fondamentale per il calcolo del rischio di ricorrenzaper il calcolo del rischio di ricorrenza

Journal of American College of Cardiology, 2003, 42:923-29

Come sta cambiando la Come sta cambiando la classificazione genetica della classificazione genetica della

FCFC

�� Da malattia “monogenica” a malattia Da malattia “monogenica” a malattia complessacomplessa

Ereditarietà “semplice”, correlazioneGenotipo-fenotipo Caratteri Complessi: interazioneCaratteri Complessi: interazione

Geni + ambienteGeni + ambiente

Basi genetiche “semplici” e basi genetiche “complesse”

GenotypeGenotype--Phenotype CorrelationsPhenotype Correlations

Sweat gland:GOOD

Pancreas: GOOD

Lung: BAD

Genotype

Adapted from Welsh and Smith. Sci Am. 1995;273:52-59.

MutazioniMutazioni CFTR e CFTR e conseguenzeconseguenzeclinichecliniche

Scala di gravità

CFNormale PS PI

Mutazioni tipiche

CBAVD, COPD,

pancreatite, etc.

Mutazioni atipiche

GenotipoGenotipo CFTRCFTR

DifettoDifetto didi basebase

SintomiSintomiGeniGeni modificatorimodificatori

FattoriFattori ambientaliambientali

EffettoriEffettori del del fenotipofenotipo CFTRCFTR

genotipogenotipo CFTRCFTR

CF CF tipicatipica

GeniGeni modificatorimodificatori

FattoriFattoriambientaliambientali

genotipogenotipo CFTR CFTR

CF CF atipicaatipica

GeniGeni modificatorimodificatori

FattoriFattoriambientaliambientali

EffettoriEffettori didi CF CF tipicatipica e e atipicaatipica

PotenzialiPotenziali genigeni modificatorimodificatori

� Inibitore delle Proteasi (PI): mutazioni Z e S

� Emocromatosi ereditaria (HFE): Cys282Tyr

� Transforming growth factor beta (TGF β1)

� Mannose Binding Lectin-2 (MBL2)

Malattia OMIM 1° locus 2° locus EffettoFibrosiCistica

603855 CFTR CFM1 Soppressore

Sorditàcongenita

220290 GJB2 GJB6 Digenico

Retinitepigmentosa

180721 RDS ROM1 Digenico

CistinuriatipoIII

600918 SLC7A9 SLC3A1 Digenico?

Ipercolester.familiare

143890 LDRL 13q Soppressore

SMA 603011 SMN1 H4F5 Modificagravità

SLA 147450 SOD1 CNTF Modificagravità

Usher tipoI 276903 USH3 MyoVIIA Sinergico

Esempi di malattie Esempi di malattie oligogenicheoligogeniche