L.S. in Scienze e tecnologie alimentariAnno Accademico 2008/2009

Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli

alimenti (7 CFU)Modulo:

Chimica analitica strumentale (4 CFU)Giorgio Bonaga

CROMATOGRAFIATEORIA GENERALE

(CAS-2) Giorgio Bonaga

CROMATOGRAFIA(Tswett’s writing = Tswett’s

analysis)

… ma chi è Tswett ?

Giorgio Bonaga

CROMATOGRAFIA(chromos = colore + graphos = scrittura mediante il

colore)

L’8 mar

Mikhail Semynovich Tswett (1872-1919)

Nasce ad Asti (Italia) il 14 maggio 1872, da Siméon, russo, e Maria deDerozza, italiana. Studia a Losanna, poi all’Università di Ginevra, dove si laurea in Scienze nel 1896, discutendo una tesi sulla struttura delle cellule vegetali (protoplasmi e cloroplasti). Nello stesso anno si trasferisce a San Pietroburgo, ma in Russia non gli è riconosciuto il titolo di studio svizzero e pertanto nel 1901 sostiene una nuova tesi di laurea dal titolo “Struttura fisico-chimica della particella di clorofilla. Studio sperimentale e critico”. Nel 1901 si trasferisce a Varsavia, in qualità di assistente presso il Dipartimento di Anatomia e Fisiologia Vegetale, per divenire poi “Lettore” in Botanica e Agricoltura presso

l’Istituto di Veterinaria ed infine “Lettore Senior” al Dipartimento di Chimica e Mineralogia. Il 21 marzo 1903 Tswett presenta il lavoro che di fatto costituisce la data di nascita della “cromatografia”: l’occasione è un Convegno presso la Sezione di Biologia della Società Naturalistica dell’Università di Varsavia ed il titolo della sua relazione è “Sulla nuova categoria di fenomeni di adsorbimento e sulle loro applicazioni nell’analisi chimica”. Nel 1915 ritorna a Mosca, per trasferirsi poi, due anni dopo, all’Università di Tartu (Estonia) in qualità di Full Professor e nel 1918 all’Università di Voronezh (Estonia), città nella quale muore il 26 giugno 1919.

PER I PIU’ CURIOSI: Karlo Ivanovich Sakodynskii:”Michael Tswett: life and work”. Carlo Erba Edizioni, Milano (gratuito, a richiesta)

Giorgio Bonaga

Il primo “cromatogramma”

Il primo “cromatografo” di Tswett (1903)

L = 30-40 cm

d = 2-3 cm

P = 0,5 Atm

materialeadsorbente (CaCO3)

L’IDEA DI TSWETT

xantofilla clorofilla clorofilla xantofilla ‘xantofilla

eluente(etere di petrolio)

Giorgio Bonaga

Il “cromatografo” di Tswett per colonne multiple, con sistema di pressione

Giorgio Bonaga

L’8 mar

In uno dei suoi ultimi lavori M. S. Tswett ha scritto (profeticamente):

“…tuttavia, è auspicabile un grande sviluppo, nell’ambito dell’analisi cromatografica, di colonne capillari “

colonne capillari

Giorgio Bonaga

CROMATOGRAFIA

setto di vetro poroso

allumina granulare (fase stazionaria)

eluente (fase

mobile)

DETECTOR

V R

segn

ale

del d

etec

tor

cromatogramma

Giorgio Bonaga

rivelazionedegli analiti

colonna- fase

stazionaria –

CROMATOGRAFO A BLOCCHI

introduzione del campioneserbatoio

- fase mobile -

gas o liquido iniettori(injector)

solido o liquido rivelatori(detector)

Giorgio Bonaga

Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e l’analisi quali-quantitativa dei componenti di matrici complesse. Nell’indagine biologica sono particolarmente preziose le loro numerose applicazioni nel campo alimentare.In tutti i metodi cromatografici, seppure con alcune differenze, i componenti di una miscela si separano distribuendosi tra due fasi: una FASE STAZIONARIA (un solido o un liquido su

un supporto solido inerte) una FASE MOBILE (un gas o un liquido) che fluisce

in modo continuo sulla fase stazionaria.

La separazione è dovuta principalmente a due effetti:1 . distribuzione dei soluti fra la fase stazionaria e la

fase mobile;2. effetto di trascinamento dei soluti da parte della fase

mobile.Giorgio Bonaga

CLASSIFICAZIONE DEI PROCESSI CROMATOGRAFICI

Giorgio Bonaga

Denominazionedel metodo

Metodospecifico

Fasestazionaria

Tipo diequilibrio

Cromatografia liquida (fase mobile: liquido)

(LC)

liquido/liquido(LLC = LC)

liquido adsorbito su solido

partizione tra due liquidi immiscibili

liquido/fase legata(BPLC)

specie organiche legate alla superficie solida

partizione tra liquido e fase legata

liquido/solido(LSC e TLC)

solido adsorbimento

scambio ionico(IEC/SIC)

resina scambiatricedi ioni

scambio di ioni

esclusione(SEC/GPC/GFC)

liquido negli interstizi di un polimero solido

partizione/setacciamento

Gascromatografia (fase mobile: gas)

(GC)

gas/liquido(GLC = GC) liquido adsorbito su

solidopartizione tra gas e

liquidogas/fase legata

(BPGC)

gas/solido(GSC)

specie organiche legate alla superficie solida

solido

partizione tra gas e fase legata

adsorbimento

Cromatografia con fluidi

supercritici(fase mobile: fluido

supercritico)

fluido supercritico/fase legata

(SFC)specie organiche legate

alla superficie solidapartizione tra fluido supercritico e fase

legata

supporto(solido)

fase stazionaria(liquido)

fase mobile(liquido o gas)

CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE(LC o GC)

Le molecole di soluti diversi si ripartiscono in modo diverso tra la fase stazionaria liquida (supportata da un solido) e la fase mobile liquida o gassosa.

Giorgio Bonaga

fase stazionaria(solido)

fase mobile(liquido o gas)

CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO(LSC o GSC)

I siti attivi della fase stazionaria solida “legano” le molecole dei solventi e dei soluti con legami reversibili non polari e polari di “forza” diversa:1) forze deboli (tipo Van der Waals) e dipolo istantaneo-dipolo istantaneo

per solventi e soluti non polari;

2) dipoli permanenti per solventi e soluti polari;3) legami H per molecole con H su eteroatomi (N, O, F);4) interazioni dielettriche per solventi polarizzabili.

siti attivi

Giorgio Bonaga

PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA

La fase stazionaria è costituita da particelle solide o da un film liquido che riveste un supporto solido, contenute all’interno di un tubo lungo e sottile (cromatografia su colonna) o depositate su una superficie (cromatografia planare). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la fase mobile (m):

Xm

Le due caratteristiche del processo cromatografico sono:

1. Migrazione differenziale2. Allargamento della banda

tempo

Giorgio Bonaga

Xs

MIGRAZIONE DIFFERENZIALECostituisce la base del processo di separazione cromatografica ed è strettamente legata alla differenza dei tempi di ritenzione di soluti diversi (selettività). In sintesi, è diversa la velocità di migrazione di soluti diversi lungo la fase stazionaria della colonna.Simuliamo gli equilibri tra i 3 soluti A B C, la fase mobile e una singola particella di fase stazionaria:

[Cs]

[Cm]

[Bs][As]

[Bm] [Am]

[Cs]>[Bs]>[As][Am]>[Bm]>[Cm]

Giorgio Bonaga

Nell’esempio illustrato, all’equilibrio (in realtà i processi cromatografici sono processi di “non equilibrio”, ma per ora è utile considerarli equilibri nella descrizione qualitativa dei fenomeni che intervengono), l’analità A è prevalentemente nella fase mobile, B si ripartisce in modo uguale nelle due fasi e C è prevalentemente nella fase stazionaria.La velocità con cui un analita si muove lungo la colonna dipende dalla frazione di molecole che si trova nella fase mobile ad ogni istante (quelle che interagiscono con la fase stazionaria non si muovono lungo la colonna, se non al sopraggiungere di un nuovo volume di fase mobile).La migrazione differenziale dipende dall’equilibrio di distribuzione di ogni analita tra la fase stazionaria e la fase mobile e perciò essa è controllata dalle 3 variabili sperimentali che influenzano la distribuzione (ossia le variabili che influenzano l’equilibrio di distribuzione termodinamico del soluto tra le due fasi):

• COMPOSIZIONE DELLA FASE MOBILE• COMPOSIZIONE DELLA FASE STAZIONARIA• TEMPERATURA

Per modificare la migrazione differenziale allo scopo di migliorare la separazione tra soluti, si deve operare su queste 3 variabili.

Giorgio Bonaga

COEFFICIENTE DI PARTIZIONE(O DI DISTRIBUZIONE)

Esprime la COSTANTE TERMODINAMICA Kd, ovvero il rapporto tra la concentrazione molare dell’analita X nella fase stazionaria e la concentrazione molare dell’analita X nella fase mobile.

Kd(A) = 1/3 = 0,33 (più veloce di B e C) Kd(B) = 2/2 = 1,00 (3 volte più lento di A) Kd(C) = 3/1 = 3,00 (9 volte più lento di A)

Nell’esempio precedente i coefficienti di partizione degli analiti A, B e C sono:

Kd(X) = CsCm

Giorgio Bonaga

Anche le molecole dello stesso soluto si muovono lungo la colonna con velocità differenti: la loro dispersione genera un profilo (banda di eluizione) di tipo gaussiano, il cui apice rappresenta la velocità media del soluto. Il termine comune della banda di eluzione è picco cromatografico.

t

velocità media

Giorgio Bonaga

• Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario ad un soluto per eluire da una estremità all’altra della colonna (ed essere “visto” dal detector).

• Tempo morto (t0 o tM): tempo di ritenzione di un soluto che non è trattenuto dalla fase stazionaria e pertanto fluisce alla stessa velocità della fase mobile.

W

tR

t0

0

0

t

det

ecto

r sig

nal

TEMPO DI RITENZIONE

Giorgio Bonaga

• Volume di ritenzione (VR): volume di fase mobile necessario per eluire il soluto da un’estremità all’altra della colonna.

• Volume morto (V0 o VM): volume di ritenzione di un soluto che non è trattenuto dalla fase stazionaria. Esso coincide con il volume di fase mobile che occupa la colonna.

(es.: colonna di r = 0,5 cm e di lunghezza 100 cm, V0 = 0,5 cm x 0,5 cm x 3,14 x 100 cm = 25 cm3 = 25 ml).VR e tR sono tra loro proporzionali se il flusso della fase mobile è

costante, in base alla relazione:VR = tR x F

F = flusso della fase mobile (volume nell’unità di tempo, espresso in ml/min)

(es.: soluto con tR = 5 min, a F = 30 ml/min, il VR = 5 min x 25 ml/min = 125 ml)

Giorgio Bonaga

ESEMPIODati F = 1,0 ml/min e una colonna di sezioni:

e = 2,5 mm/5,0 mm = 0,5Ag = 2,5 mm2 . 3,14 20 mm2 = 0,2 cm2

A = 0,2 cm2 . 0,5 = 0, 1 cm2

da cui:

A = area effettiva della sezione media della colonna (area disponibile per il flusso della fase mobile)

A = Ag . eAg = area geometrica della sezione della colonna e = (interparticle porosity) rapporto tra la sezione disponibile per la

fase mobile e la sezione totale della colonna

1,0 cm3 . min-1 0,1 cm2 . 60

v = 10,0 cm/sec

5,0 mm2,5 mm

RELAZIONE TRA FLUSSO (F) E VELOCITA’ MEDIA LINEARE (v)

La relazione tra F (in ml/min) e v (in cm/sec) della fase mobile è:

(A x 60) F v =

Giorgio Bonaga

Nell’esempio precedente, se la lunghezza della colonna L = 100 cm, misurando sul cromatogramma il valore di t0 = 10” si ottiene:

da cui, anche:

La velocità lineare media v (in cm/sec) di flusso della fase mobile è anche espressa dalla relazione:

t0

L v =

10” 100 cm v = 10,0

cm/sec

F = 10,0 cm . sec-1 . (0,1 cm2 . 60) 1,0 ml/min

È intuitivo che la velocità media lineare (in cm/sec) del soluto è espresso dalla relazione:

Nell’esempio precedente, con L = 100 cm, misurando sul cromatogramma il valore di tR = 100” si ottiene:

tR

L v(soluto) =

100” 100 cm

v (soluto) = 1,0 cm/sec Giorgio Bonaga

Il parametro più significativo per descrivere la velocità di migrazione del soluto lungo la colonna è il fattore di capacità (k’), che esprime il tempo di ritenzione (tR) di un soluto in funzione del tempo morto (t0):

FATTORE DI CAPACITA’ (k’)Retention Factor

t0

tR – t0 k’ =tR

t0

0t

1’ 6’

A

k’A = 6 – 1 = 51 Giorgio Bonaga

Dunque k’ rappresenta un tempo di ritenzione relativo (al segnale del solvente) e consente di confrontare il comportamento di due colonne differenti rispetto le quali un soluto non rivela gli stessi tR e t0. Il fattore k’ può essere espresso anche utilizzando il volume di ritenzione e il volume morto: V0

VR – V0 k’ =

(es.: dati VR = 250 ml e V0 = 50 ml, il k’ = 250 – 50/50 = 200/50 = 4)

Il fattore k’ è anche espresso dal rapporto tra la concentrazione molare del soluto nel volume di fase stazionaria e la concentrazione molare del soluto nel volume di fase mobile (ammesso che si possa parlare di concentrazione in mol/l del soluto in un materiale solido):

(es.: dati CS = 20 mol/l, CM = 10 mol/l, VS = 100 ml, V0 = 50 ml, il k’ = 20/10 x 100/50 = 4)

CM . V0

CS . VS k’ =

Giorgio Bonaga

Ricordando che:

(es.: dati CS = 20 mol/l e CM = 10 mol/l, Kd = 2,0)

si ottiene:

(es.: dati VS = 100 e V0 = 50, k’ = 2,0 x 100/50 = 4)

CM

CS Kd =

V0

VS k’ = Kd .

Eguagliando le due espressioni di k’:

V0

VR – V0 V0

VS=

da cui: + Kd . VSVR = V0

Kd .

(es.: dati V0 = 50 ml, Kd = 2, VS = 100, VR = 50 + 2,0 x 100 = 250 ml)Giorgio Bonaga

k’ =Kd . F

Se il soluto ha un valore della Kd molto basso (tendente a 0) risulterà VR = V0 , cioè quel soluto è indifferente al processo di ripartizione (analogamente alla fase mobile). Ogni soluto ha un valore caratteristico di k’ in una determinata colonna, dal momento che k’ e Kd sono legate dalla relazione:

ponendo: si ottiene: V0

VS k’ = Kd .

V0

VS = F

V0

VS = F

V0 VS

con V0 = VS , K’ = Kd con V0 = 0,5VS , K’ = 2 . Kd F è detto rapporto di fase ed è diverso da colonna a colonna;

pertanto ogni soluto ha un k’ caratteristico in funzione della colonna utilizzata.

Il k’ ottimale è compreso tra 3-4Giorgio Bonaga

ALLARGAMENTO DELLA BANDAOltre alla migrazione differenziale dei soluti, il processo cromatografico comporta una allargamento della banda del soluto (cioè di molecole uguali che hanno lo stesso coefficiente termodinamico di partizione Kd) rispetto la sua larghezza iniziale. L’entità dell’allargamento è funzione del tempo che il soluto trascorre nella colonna, ovvero quanto maggiore è il suo tempo di ritenzione tanto maggiore è l’allargamento della banda.

t0 t1 t2

Giorgio Bonaga

L’allargamento della banda, che corrisponde al picco nel cromatogramma, è dovuto alla diversa velocità di migrazione delle molecole del soluto, per effetto di fattori fisici e cinetici la cui entità dipende dal valore del fattore di capacità k’ del soluto.

iniezioneW

W2 2

h

I fattori fisici e cinetici che determinano l’allargamento della banda sono:

1. TORTUOSITA’ DEI PERCORSI2. DIFFUSIONE LONGITUDINALE3. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE4. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE STAGNANTE5. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA

t0

h

tR

Giorgio Bonaga

t0

t2

t1

1. TORTUOSITA’ DEI PERCORSI

BA

Le molecole di soluto non seguono lo stesso percorso e pertanto impiegano tempi diversi per percorrere la stessa lunghezza di colonna, ovvero nello stesso tempo percorrono lunghezze diverse della colonna.

dp

l

v

Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

2. DIFFUSIONE LONGITUDINALE

fasemobile

fase mobile(più concentrata)

fase mobile(meno concentrata)

fase mobile(meno concentrata)

È la diffusione delle molecole del soluto, con direzione parallela all’asse longitudinale della colonna, nei versi che vanno dalle zone a maggiore concentrazione di fase mobile alle zone a minore concentrazione.

g

Dm

v

Giorgio Bonaga

3. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE

Dmv

W

dp

Giorgio Bonaga

4. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE STAGNANTE

v

W

Dm

dp

Giorgio Bonaga

5. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA

U

dliq Q

v

Giorgio Bonaga

DS

OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO CROMATOGRAFICO

Sono stati discussi la MIGRAZIONE DIFFERENZIALE e, soltanto dal punto di vista qualitativo, l’ALLARGAMENTO DELLA BANDA.Per la loro trattazione quantitativa, i parametri che influenzano il processo cromatografico possono essere riuniti in macrocategorie, ciascuna delle quali contribuisce, seppure in modo differente, all’aspettopiù importante della performance di una separazione cromatografica, la RISOLUZIONE.

1. FATTORE DI EFFICIENZA

2. FATTORE DI SELETTIVITA’

3. FATTORE DI CAPACITA’

RISOLUZIONE

Giorgio Bonaga

FATTORE DI EFFICIENZAL’efficienza di una colonna è definita dalla forma e dall’allargamento dei picchi cromatografici. Per comprendere nei dettagli il fattore di efficienza occorre introdurre due concetti fondamentali:

A) ALTEZZA EQUIVALENTE DI UN PIATTO TEORICO • definizione• fenomeni fisici e cinetici che contribuiscono al

valore dell’HETP• equazione di Van Deemter

B) NUMERO DI PIATTI TEORICI DI UNA COLONNA• definizione• equazioni

Giorgio Bonaga

A) ALTEZZA EQUIVALENTE DI UN PIATTO TEORICO(Height Equivalent to the Theoretical Plate = HETP)

Consideriamo l’avanzamento di un soluto nella colonna cromatografica. Se non vi fosse flusso di fase mobile nel I° tratto di colonna si instaurerebbe un equilibrio di partizione (nel nostro caso Kd = 2/8 = 0,25). In realtà la fase mobile fluisce e pertanto il processo di partizione procede lungo la colonna senza il raggiungimento di uno stato di equilibrio permanente. Nel II° tratto di colonna una parte del soluto trasportato dalla fase mobile migra nella fase stazionaria (con una Kd = 1,6/6,4 = 0,25). Anche nel III° tratto una parte del soluto migra nella fase stazionaria (con una Kd = 1,28/5,12 = 0,25). E così di seguito.

HETP

I°

II°

III°

2,0 M

1,6 M

1,28 M

8,0 M

6,4 M

5,12 M

10,0 M

Giorgio Bonaga

HETP

I°

II°

III°

2,0 M 0,4 M

1,6 M 0,32 M

1,28 M 0,256 M

0 M 1,6 M

0 M 1,28 M

0 M 1,024 M

Non bisogna dimenticare che la quantità di soluti presenti nella fase mobile e nella fase stazionaria sono espresse dalla concentrazione molare (numero di moli di soluto in un litro di soluzione). È ovvio che la concentrazione molare nella fase stazionaria del I° piatto teorico (M = 2,0) si modifica quando sopraggiunge un volume di fase mobile priva di soluti (M = 0). Dunque avviene una migrazione inversa, che va dalla fase stazionaria alla fase mobile, fino a quando il rapporto tra le concentrazioni molari nelle due fasi non eguaglia il Kd = 0,25 (0,4/1,6). In modo analogo avverrà nel II°, III°, ecc., piatto teorico.

Giorgio Bonaga

Il tratto di colonna nel quale si realizza una condizione “corrispondente” ad uno stato di equilibrio (cioè un equilibrio reversibile di partizione) è detto “altezza equivalente di un piatto teorico” (HETP), come se la fase mobile fosse ferma. L’espressione altezza del piatto teorico è mutuata dalla teoria delle colonne di frazionamento per distillazione, data l’analogia tra il processo di distillazione frazionata e il processo di ripartizione cromatografica, entrambi utilizzati per separare i componenti di una miscela.

altezza delpiatto teorico

B(liquido)

miscela(A+B)

percorsoliquido

in ascesa

piatto sfioratore

Giorgio Bonaga

A(vapore)

La diffusione eddy:

• dipende dalla regolarità dell’impaccamento (“column packing”)• è direttamente proporzionale al diametro delle particelle di fase

stazionaria• è indipendente dalla velocità lineare media di flusso della fase mobile

FENOMENI FISICI E CINETICI CHE CONTRIBUISCONO AL VALORE DELL’HETP

1. DIFFUSIONE EDDY (tortuosità dei percorsi)

È riassunta nell’espressione:He = 2 dp . l

l = costante legata alla regolarità dell’impaccamento della colonnadp = diametro delle particelle di fase stazionaria

Giorgio Bonaga

2. DIFFUSIONE LONGITUDINALE

È riassunta nell’espressione:Hd = 2 g

g = coefficiente dipendente dalla distribuzione delle particelle di fase stazionaria (fattore di ostruzione = 0,6 per impaccate; 1,0 per capillari)

Dm = coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile =

v = velocità lineare media di flusso della fase mobile

Dmv

La diffusione longitudinale:• dipende dalla distribuzione delle particelle della fase stazionaria;• è direttamente proporzionale al Dm del soluto nella fase mobile;• è inversamente proporzionale alla velocità lineare media di flusso della

fase mobile (maggiore velocità minore tempo disponibile alla diffusione longitudinale).

NOTA: la Hd è di scarsa importanza nella LC perché i coefficienti di diffusione nei liquidi sono bassi, ma è molto importante nella GC per i valori elevati dei coefficienti di diffusione nei gas.

Giorgio Bonaga

k T6 p h r

Giorgio Bonaga

RELAZIONE TRA v E DIFFUSIONE LONGITUDINALE

v bassa

v alta

3. e 4. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE E IN FASE MOBILE STAGNANTE

È riassunto nell’espressione:

W = fattore dipendente dal diametro della colonna (= dc2 ) dp = diametro delle particelle di fase stazionaria

Dm = coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobilev = velocità lineare media di flusso della fase mobile

Il trasferimento di massa in fase mobile (e in fase mobile stagnanate):• dipende dal diametro della colonna;• è direttamente proporzionale al quadrato del diametro delle particelle;

• è direttamente proporzionale alla velocità del flusso della fase mobile;• è inversamente proporzionale al Dm del soluto nella fase mobile;

Dm

vHm = W dp2

Giorgio Bonaga

5. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIAÈ riassunta nell’espressione:

Q = fattore dipendente dal tipo e dalla forma delle particelle della fase stazionariaU = costante relativa alla velocità di migrazione del soluto dalla fase stazionaria verso la fase mobile (interazione soluto/fase stazionaria)dliq = spessore del rivestimento liquido depositato sul supporto solidoDs = coefficiente di diffusione del soluto nella fase stazionaria v = velocità lineare media di flusso della fase mobile

Ds

v

Il trasferimento di massa in fase stazionaria:• dipende dal diametro e dalla forma delle particelle di fase stazionaria;• dipende dalla velocità di migrazione (desorbimento) del soluto dalla fase

stazionaria verso la fase mobile;• è direttamente proporzionale alla velocità lineare media di flusso della

fase mobile;• è inversamente proporzionale al Dm del soluto nella fase stazionaria.

Hs = Q U dliq2

Giorgio Bonaga

dp

dliq

RAPPRESENTAZIONE DEI TERMINI l, g, W, Q, dp, dliq

Q

gl

W e g Giorgio Bonaga

Ds

Dm

RAPPRESENTAZIONE DEI TERMINI Dm, Ds, U

U

Giorgio Bonaga

U= velocità di trasferimento del soluto dalla fase stazionaria alla fase mobile (dipende dall’antagonismo tra le interazioni soluto/ fase stazionaria e le interazioni soluto/fase mobile), ovvero dalla velocità di desorbimento del soluto dalla fase stazionaria

Dm o Ds = 6 p h r k T

k = costante di BoltzmannT = temperaturah = viscosità del solutor = raggio della particella =

k = R/N = 1,38 . 10-23 J/KR = costante universale dei gasN = numero di AvogadroK = temperatura assoluta

√ Vp3

Dai contributi all’HETP dei vari fenomeni fisici e cinetici si ottiene il valore dell’HETP totale:

Ds

Q U 22 dp. l + + +

2 g Dmv Dm

v W dp2 HETP = He+ Hd+ Hm+ Hs = v

Ponendo:

2 dp l = A

2 g Dm = B

L’equazione diviene: HETP = A + B + C . v

Ds

Q U dliqDm

W dp2

+ = C

v

costanti caratteristiche per ogni singola colonna e per una data fase mobile

equazione di Van Deemter

dliq

2

Giorgio Bonaga

v (cm/sec)

HETP

(cm

)

velocità ideale(v = √ B/C )

Diagrammando l’equazione di Van Deemter si ottiene un’iperbole che correla il valore dell’HETP alla velocità lineare media v di flusso della fase mobile, ma nel diagramma sono identificabili anche le 3 costanti (A, B e C) caratteristiche di una certa colonna e di una data fase mobile.

altezzaminima

C . vA

Bv

Giorgio Bonaga

retta parallela all’asse x

retta con coefficiente angolare C

iperbole equilatera

Liquid Chromatography

Gas Chromatography

v (cm/s)

CORRELAZIONE TRA v E HETP

HETP

(mm

)HE

TP (m

m)

v (cm/s) Giorgio Bonaga

CORRELAZIONE TRA v E SEPARAZIONE

1,0 ml/min 2,0 ml/min

4,0 ml/min 5,0 ml/min

1 1

1 1

2 223

3

33

minuti

2

0 4 8 0 2 4 0 1 2 0 0,5 1 1,5

Giorgio Bonaga

HETP NELLA HPLC TRADIZIONALE, FAST HPLC, UPLC

0 1 2 3 4 5 6 v (mm/sec)

HE

TP (m

m)

0

5

10

15

20

25

30

10 mm (1970)

5 mm (1980)

3 mm (2000)

1,7 mm (2004) UPLC

FAST HPLC

HPLC

HPLC

Giorgio Bonaga

EFFETTI DELL’HETP SULL’EFFICIENZA E SUL TEMPO

0 2 4 6 8 10 18

300 200 100 rrr0 - 25

0 2 4 6 8 10 12

300 200 100 rrr0 - 25

HPLC

UPLC

mV

mV

t (min)

t (min)

1,8 minuti

18 minuti• flusso: 1,0 ml/min• colonna: 4,6 mm i.d. x 150

mm• fase stazionaria: C18 (5,0

mm)• fase mobile: H2O/CH3CN

(50/50)• lunghezza d’onda: 254 nm• campione (20 ml): 1. uracile 2. alcol benzilico 3. benzene 4. toluene 5. alcol etilico• flusso: 0,6 ml/min• colonna: 2,1 mm i.d. x 50 mm• fase stazionaria: C18 (1,8 mm)• fase mobile: H2O/CH3CN (50/50)• lunghezza d’onda: 254 nm• campione (1 ml): 1. uracile 2. alcol benzilico 3. benzene 4. toluene 5. alcol etilico

1

2

3 45

12

3 4 5

Giorgio Bonaga

B) NUMERO DI PIATTI TEORICI (N)

Il numero di piatti teorici N (ha soltanto un significato matematico, perché il processo cromatografico non è una singola separazione, ma una sequenza continua di stati di equilibrio reversibili) è definito dall’espressione:

da cui:N = L

HETP

HETP = s2

L

L = 10 cmHETP = 1 cmN = 10

Tenendo conto che l’effetto dell’eluizione di un soluto è una curva gaussiana, si può correlare l’ampiezza della curva con la varianza s2 o con la deviazione standard s di una misura. In sintesi si può esprimere il piatto teorico in termini di varianza o di deviazione standard per unità di misura di lunghezza della colonna:

HETP = LN

HETP = 1 cmL = 10 cms2 = 10 cm2 da cui:s = 10 cm2 3,15 cm

HETP . L = s2

Giorgio Bonaga

La relazione tra la deviazione standard s (espressa in centimetri) e la deviazione standard t (espressa in secondi) è data dalla velocità lineare media v del soluto (v = L/tR , espressa in cm/sec).

Nel caso precedente, con v = L/tR = 1 (cm/sec), si ottiene che la deviazione standard t = 3,15 secondi, corrispondente alla deviazione standard, che per la colonna considerata è s = 3.15 centimetriSi prenda il tracciato cromatografico con in ascissa il tempo t: la varianza del soluto si ottiene mediante una procedura grafica sul picco del cromatogramma.Si traccino le tangenti al punto di flesso della gaussiana in entrambi i lati del picco e si congiungano: si ottiene un triangolo che ha come base la linea di base e come area il 96% dell’area totale sottesa al picco. Questo 96% è compreso tra due deviazioni standard (± 1s) rispetto l’apice del picco.Le intercette sono a ± t dal massimo e pertanto l’ampiezza della base del triangolo isoscele risulta essere Wb = 4t, ovvero t =

Wb/4.

s s (cm) tR (sec) v L (cm)

t = =

Giorgio Bonaga

L

t

tR

+1s

+2s

t tt t

Wb=4s=4t

-2s

96%

Sostituiamo il valore di t nella t = s tR/L e risolviamo per s:

ovveroWb s tR L4

= s L Wb 4 tR

=

Giorgio Bonaga

punti di flesso

Wi = 2s

Wh = 2, 35 s-1s

Nell’equazione:

sostituiamo il valore trovato di s:

16tR

Wb

2

HETP =

L2 Wb2

L 42 tR2HETP = =

s2L

L Wb2

16 tR2

Nell’equazione:N = L

HETP

sostituiamo il valore di HETP:

N = LL Wb2

16 tR2

= L 16 tR2 L Wb2

= 5,54 tR

Wh

2=

La relazione tra Wb e Wh (full width at half maximum) è: Wh = 2,35 s = 2,35 . Wb/4 Giorgio Bonaga

tR = 17’

Wb = 1’42”

N = 16 = 160017’ 1’42”

2

Whh2

ESEMPIO

= 1’

N = 5,54 = 1600

17’ 1’

2

Il numero di piatti teorici (N), ovvero l’altezza equivalente di un piatto teorico (HETP) consente di confrontare l’efficienza di due colonne cromatografiche di differente lunghezza (L). Giorgio Bonaga

ESEMPIOIn 2 colonne, rispettivamente di L = 75 mm e L = 100 mm, si introduca la stessa quantità di una soluzione contenente il soluto A e si registrino i rispettivi tracciati cromatografici. La colonna più corta risulta più efficiente.

tR = 5’

W = 1’

N = 16 = 40051

2

W = 2”

tR = 9”

N = 16 = 30092

2

HETP = 75 mm/400 = 0,19 mm

HETP = 100 mm/300 = 0,33 mm

A

A

Giorgio Bonaga

ALLARGAMENTI DEL PICCO NON DOVUTI ALLA COLONNA

In un cromatografo, oltre alla colonna, sono presenti i tubi di connessione e le giunzioni della linea di flusso della fase mobile che generano dei fenomeni di turbolenza, ai quali si sommano i fenomeni di diffusione longitudinale. L’effetto finale è un allargamento del picco cromatografico che risulta proporzionale al volume dei circuiti entro i quali passa la fase mobile e quindi anche alla lunghezza dei tubi di connessione. Dunque all’allargamento della banda concorrono numerosi fattori che, sebbene poco influenti rispetto quello dovuto alla colonna, possono essere così riassunti:

WT = Wj + Wf + We + Wd + Wc

dove:WT = larghezza totale del piccoWj = allargamento dovuto ai volumi morti e alla dispersione del soluto nell’injectorWf = allargamento dovuto alle connessioni dopo l’injector e prima del detectorWe = allargamento dovuto ai capillari di connessione injector/colonna e colonna/detectorWd = allargamento dovuto al detectorWc = allargamento dovuto alla colonna

Giorgio Bonaga

FATTORE DI SELETTIVITA’È la misura quantitativa dell’entità di separazione tra due soluti e dunque rappresenta la capacità di un “sistema cromatografico” di distinguere tra due sostanze. Una colonna cromatografica è tanto più selettiva tra due soluti quanto maggiore è la loro MIGRAZIONE DIFFERENZIALE (sulla quale è utile ricordare che influiscono 3 variabili: composizione della fase mobile, composizione della fase stazionaria, temperatura). In sintesi la selettività è la capacità di una colonna di differenziare i tempi di ritenzione di due soluti diversi.Il fattore di selettività è definito dall’espressione:

dove:k’A = fattore di capacità del soluto Ak’B = fattore di capacità del soluto B (con tempo di ritenzione maggiore)

Per modificare il fattore di selettività si può agire in 5 modi (modificazione della fase mobile, variazione del pH della fase mobile, modificazione della fase stazionaria, variazione della temperatura, ricorso a effetti chimici specifici di un determinato soluto).

(tR)B – t0 =(tR)A – t0= k’B

k’A

Giorgio Bonaga

ESEMPIOData il cromatogramma dei due soluti A e B, di cui sono noti i tempi di ritenzione tRA e tRB e il tempo di ritenzione del solvente t0, si può calcolare il fattore di selettività . La variazione di modifica il tR di uno dei due soluti.

t0= 1’

tRB = 6’ tRA = 5’

6 - 1 =5 - 1

= 1,25

Giorgio Bonaga

t0= 1’

7 - 1 =5 - 1

= 1,50

tRB = 7’ tRA = 5’

FATTORE DI CAPACITA’Il fattore di capacità k’ è funzione della composizione della fase mobile. Il soluto interagisce con la fase stazionaria, ma la sua migrazione si ottiene con una fase mobile verso la quale le caratteristiche fisiche e chimiche del soluto risultino intermedie tra quelle della fase mobile e quelle della fase stazionaria. In queste condizioni il soluto si ripartisce tra le due fasi e la variazione del suo k’ è in relazione al tempo che il soluto trascorre nella fase stazionaria. I valori di K’ sono compresi tra 0 e 10 (ottimali: 3-4).

A tR = 4’

tR = 6’

t0 = 1’

t0 = 1’

k’A = 4 – 1 = 31

k’A = 6 – 1 = 51A

Giorgio Bonaga

RISOLUZIONE (R)È l’abilità di una colonna cromatografica di separare soluti diversi, ovvero di produrre cromatogrammi in cui i soluti compaiono come picchi con profili molto stretti e ben separati tra loro. Il fattore di risoluzione (o risoluzione), in generale, si riferisce ai due soluti più difficilmente separabili. Dati i picchi A e B di un cromatogramma, la risoluzione R è espressa da:

ESEMPIONel primo caso WA = WB, nel secondo WA WB

WB = 8’ WA = 4’ WB = 8’

tRA = 24’ tRB = 33’

R = 36 - 24 = 1,5 8

R = 2 . 33 - 24 = 1,5 4 + 8

WA = 8’

tRB = 36’ tRA = 24’

2 Dt 2 (tRB –tRA) Dt (WA + WB) 2 W W

R = = =

Giorgio Bonaga

La risoluzione dipende da 3 fattori:

1. fattore di efficienza (N): minimo allargamento della banda (He, Hd, Hm e Hs) espresso dall’equazione di van Deemter (N e HETP);

2. fattore di selettività (): cambiamento dei tempi di ritenzione dei soluti con miglioramento della loro separazione (composizione fase mobile, composizione fase stazionaria, temperatura);

3. fattore di capacità (k’): variazione delle caratteristiche della fase mobile per determinare una variazione dei fattori di capacità k’ dei soluti.

La espressione completa della RISOLUZIONE è:fattore diefficienza

fattore diselettività

R = 1 N . -1 . k’B 4 k’B + 1 fattore di

capacità

Giorgio Bonaga

t0= 1’

(tR)B = 7’(tR)A= 6’

WB = 1’

ESEMPIO

Dal cromatogramma in cui compaiono i picchi A e B, possiamo calcolare N, e k’B:

N = 16 . (7/1)2 = 784 = 7 - 1/6 - 1 = 1,2k’(B) = 7 - 1/1 = 6,0e da questi tre fattori calcolare la risoluzione R:

A B

Giorgio Bonaga

1 784 1,2 -1 6 28 0,2 6 4 1,2 6 + 1 4 1,2 7R = . . = . . = 7,0 .

0,17 . 0, 86 = 1,02

RISOLUZIONE E PERCENTUALE DI OVERLAPPING DI DUE PICCHI DI AREA 1:1

R = 0,4100%

R = 0,592%

R = 0,688%

. . . . . . . .

R = 0,784%

. . . . . .R = 0,8

60%R = 1,0

20%R = 1,25

5%R = 1,5

0%. .

Giorgio Bonaga

ESEMPIOCon una colonna di 10 cm è stato ottenuto il seguente cromatogramma, nel quale è visibile la sovrapposizione dei picchi A e B. Dal cromatogramma si possono facilmente calcolare i valori di N, HETP, e k’B e da questi il valore della risoluzione, che risulta essere R 1,0. Ammettendo che per separare al 100% i due picchi occorra una R = 1,5 che colonna bisogna utilizzare ?

t0= 1’

tRB = 5’tRA= 4’

WB = 1’

N = 400 [16 . (5/1)2]HETP = 0,25 mm [100mm/400] = 1,33 [(5-1)/(4-1)]k’B = 4 [5-1]

Giorgio Bonaga

A B

Preliminarmente si può verificare che:

R = 1 N . - 1 . k’B 1,0 4 k’B + 1ma dall’espressione della R si può isolare il termine N:

N = 4 R . . k’B + 1 - 1 k’BN = 16 R2 . 2 . k’B + 1 2 - 1 k’B

scegliendo una R = 1,5 per una separazione dei picchi = 100%, si ottiene:

N = 16 . 1,5 2 . 1,33/0,33 2 . 4+1/4 2 900dalla relazione: HETP = L/Nsi ottiene: L = N . HETP da cui: L = 900 . 0,25 mm = 225 mm =22,5 cm

Giorgio Bonaga

OTTIMIZZAZIONE DELLA RISOLUZIONECome modificare i valori di N, e k’, in modo da ottenere il fattore di risoluzione idoneo alla separazione della miscela analizzata ?Per semplicità consideriamo una miscela di due soli componenti A e B i cui picchi cromatografici appaiono sovrapposti (è mostrata l’area di sovrapposizione).

A BtRAtRB

Giorgio Bonaga

A) VARIAZIONE DEL FATTORE DI EFFICIENZA N

Se si aumenta N si ottiene un restringimento dei picchi (lasciando però inalterato il valore di tRA e tRB) con un miglioramento della risoluzione.L’aumento di N si ottiene:• diminuendo le costanti A (l e dp della diffusione eddy) e C (W e

dp del trasferimento di massa in fase mobile; Q del trasferimento di massa in fase stazionaria) dell’equazione di Van Deemter. La diminuzione delle costanti A e C si ottiene utilizzando delle particelle di fase stazionaria di piccolo diametro o particelle porose solo in superficie, e con un impaccamento uniforme della colonna (diminuisce l’altezza dell’HETP);

• utilizzare una colonna più lunga (aumentando N aumenta il numero di piatti teorici);

• diminuendo v in modo da ridurre l’altezza dell’HETP e, a parità

di lunghezza della colonna, aumentare il numero di piatti teorici.

Giorgio Bonaga

EFFETTO DELLE DIMENSIONI E DELLA FORMA DELLE PARTICELLE DI FASE STAZIONARIA SULL’ALLARGAMENTO DEI PICCHI

particelle grandidi forma sferica

particelle grandidi forma irregolare

particelle piccoledi forma irregolare

picco simmetricoalto e stretto

picco simmetricobasso e largo

picco simmetricomedio-alto e medio-stretto

Giorgio Bonaga

DIMENSIONI E POROSITA’ DELLA PARTICELLADI FASE STAZIONARIA

20 mm Ø particella Ø poro

= 500:1

100 Å = 0,01 mm5 mm Ø particella Ø poro

= 500:1

400 Å = 0,04 mm

A parità di rapporto tra diametro della particella e diametro del poro, la particelle di dimensione più ridotta (specialmente se di forma irregolare) riducono i fenomeni di trasferimento di massa in fase mobile e in fase mobile stagnante (W e dp) e in fase stazionaria (Q) Giorgio Bonaga

PICCHI ASIMMETRICIFinora, al di là della loro forma e dell’altezza, sono stati considerati soltanto picchi simmetrici (gaussiani). Non di rado, però, il cromatogramma mostra picchi asimmetrici dovuti alla criticità della quantità di soluto rispetto la quantità di fase stazionaria (ovvero al sovraccarico della fase stazionaria), rapporto generico noto come carico di campione.La saturazione di tutti i siti attivi della fase stazionaria produce due conseguenze possibili:• buona parte del soluto si lega più stabilmente alla fase

stazionaria, producendo una eluizione “ritardata” di soluto sulla coda del picco (“tailing”);

• la maggior parte del soluto, per effetto cooperativo, si lega e si slega più rapidamente alla fase stazionaria, producendo una euizione “anticipata” di soluto sul fronte del picco (“fronting”).

Il tailing è comune, il fronting molto meno. Per evitare l’asimmetria dei picchi, che peggiora ovviamente la risoluzione di una colonna, si può operare in due modi: 1) ridurre la quantità di campione introdotta (piccoli volumi di soluzioni dilute); 2) aumentare la superficie di siti attivi della fase stazionaria (riduzione della sua granulometria).

Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

symmetric frontingtailing

DISTRIBUZIONE DEI SOLUTI RISPETTO LA VELOCITA’ MEDIA

L’asimmetria (As) dei picchi è dovuta alla deviazione della costante termodinamica di ripartizione Kd (= CS/Cm) dei soluti e può essere cosi rappresentata:

symmetricAs = 1,0

frontingAs < 1,0

tailingAs > 1,0

As = =

<> 1

h

10% h

Giorgio Bonaga

B) VARIAZIONE DEL FATTORE DI SELETTIVITA’ Se si aumenta si aumenta la differenza tra il tRB e il tRA, ovvero si modifica la ripartizione dei soluti tra la fase stazionaria e la fase mobile.L’aumento di si ottiene:1. modificando la fase mobile;2. modificando il pH della fase mobile;3. modificando la fase stazionaria;4. modificando la temperatura;5. facendo ricorso ad interazioni chimiche caratteristiche di un

solo soluto.

6. MODIFICAZIONE DELLA FASE MOBILEÈ la modificazione selettiva del tR di un soluto che produce un aumento del fattore .ESEMPIO ILe LC a fase diretta (silice non funzionalizzata) di una miscela di acetonaftalene e dinitronaftalene effettuate con le due miscele eluenti riportate in tabella, mostrano valori di k’ e tali che soltanto con pentano/piridina (95/5) si separano i picchi, per effetto della diminuzione della k’ dell’acetonaftalene (probabilmente per l’interazione tra l’N della piridina e il =CO dell’acetonaftalene) che determina un aumento di .

Giorgio Bonaga

MISCELAELUENTE

C5H12/CH2Cl277/23

C5H12/piridina95/5

C O M P O S T O k’ k’

1 acetonaftalene

5,51,05

2,32,04

2 dinitronaftalene

5,8 5,4

CO CH3

N..

1 2CO CH3 NO2

NO2

1 2

Giorgio Bonaga

ESEMPIO IILe LC a fase inversa (silice C:18) di una miscela di cinque composti benzenici, effettuata con tre diverse miscele eluenti, mostrano valori di k’ e tali che soltanto con H2O/THF (63/37) si separano i picchi delle coppie critiche anilina/fenolo e anisolo/benzene.

MISCELAELUENTE

H2O/CH3OH50/50

H2O/AcCN60/40

H2O/THF63/37

C O M P O S T O k’ k’ K’

1 anilina 1,31,23

1,51,07

1,71,35

2 fenolo 1,6 1,4 2,33 anisolo 4,5

1,044,3

1,093,9

1,204 benzene 4,7 4,7 4,75 clorobenzen

e9,2 7,7 6,5

Giorgio Bonaga

Giorgio Bonaga

1

1

1

2

2

2

3

3

3

4

4

4

5

5

5

NH2 ClOCH3OH

2. MODIFICAZIONE DEL pH DELLA FASE MOBILEI tR di soluti contenenti gruppi acidi o basici dissociabili sono influenzati dal pH della fase mobile; pertanto modificando il pH si può aumentare il fattore .

ESEMPIO I seguenti nucleotidi:

contengono dei gruppi acidi la cui dissociazione dipende dal pH del mezzo e pertanto i loro tR dipendono dal pH della miscela eluente.

adenina monofosfato (A) guanina monofosfato (G)

citidina monofosfato (C) uracile monofosfato (U)HO

OCH2ON

N

O

O

H

PO

OO

OH

--

OCH2ON

N

NH2

OPO

OO

OHHO

--

HO

OCH2O

O

N

N

N

N

H2N

H

PO

OO

OH

--

HO

OCH2

NH2

N

N

N

N

OPO

OO

OH

--

Giorgio Bonaga

pH

AG

CU

0 1 2 3 4 5 6 7

4 3 2 1 0

tR

A + UGC

pH = 3,5

pH = 3,0

La cromatografia di scambio anionico (IEC) condotta con fase mobile tamponata a pH 3,0 anziché a pH 3,5 consente la separazione della coppia critica A/U. Giorgio Bonaga

CU

A G

3. MODIFICAZIONE DELLA FASE STAZIONARIAIl fattore può essere innalzato scegliendo una fase stazionaria che produca interazioni selettive soltanto con uno dei soluti della coppia critica.ESEMPIOLa separazione per LC a fase diretta della coppia acido benzoico/benzoato di metile, con fase stazionaria non polare risulta critica. Se, tenendo costante la miscela eluente, si utilizza una colonna con fase stazionaria polare si ottiene la separazione della coppia critica, per effetto dell’interazione tra i siti polari della fase stazionaria e il gruppo carbossilico dell’acido benzoico. 1 2

2 1

CO OHCO OCH3

Giorgio Bonaga

4. MODIFICAZIONE DELLA TEMPERATURANon è molto influente nella LC, ma rilevantissima nella GC. In generale un aumento di temperatura produce un incremento della forza eluente della fase mobile, quindi una diminuzione dei fattori di capacita k’ di tutti i soluti e in ultima analisi un aumento del fattore .ESEMPIOMolti composti acidi hanno il valore della costante di dissociazione acida Ka dipendente dalla temperatura; pertanto la variazione di temperatura produce un effetto selettivo.Nella cromatografia a coppie ioniche (fase stazionaria: silice porosa, fase mobile: acqua/metanolo + perclorato di triottilammonio) di una miscela di sei sostanze il cromatogramma a 25°C mostra soltanto 4 picchi, mentre quello a 43°C mostra sei picchi debitamente separati.

1 2 3 4 5 6

OHCH3

H3C

CH3

CH3CH3

SO3HOH

CH3

OH

SO3HSO3HHO3S

OHCOOH

OH

Giorgio Bonaga

1

1+2

34 5+6

32

4

5 6

25°C

43°C

1 = acido salicilico2 = acido 2-naftol-3,6-disolfonico3 = acido 1-naftol-5-solfonico4 = 4.metilfenolo5 = acido 2,3,4-trimetil-benzensolfonico6 = 2,5-dimetil-fenolo

Giorgio Bonaga

5. EFFETTI CHIMICI SPECIFICI DI UN DETERMINATO SOLUTOSi sfruttano le interazioni chimiche di un solo soluto per modificarne il tR e di conseguenza aumentare il fattore .ESEMPIO La LC a fase inversa (silice C18) che utilizza una fase mobile arricchita di Ag+ consente la separazione della vitamina D2 dalla D3 (in seguito alla complessazione p) e rivela anche la presenza di un’impurezza, mentre nella cromatografia senza Ag+ è visibile un solo picco cromatografico irrisolto.

0 5 10 15

D2+ D3

D2 D3

D2(ergocalciferolo)

D3(colecalciferolo)

Ag+

impurezzaHO HO

Giorgio Bonaga

C. VARIAZIONE DEL FATTORE DI CAPACITA’ k’Nella LC il valore del fattore k’ è funzione della composizione della fase mobile. La fase stazionaria interagisce con il soluto e la migrazione del soluto - cioè la sua ripartizione tra le due fasi - si realizza impiegando una fase mobile tale che il soluto mostri proprietà chimiche e fisiche intermedie tra quelle della fase mobile e quelle della fase stazionaria (competitività tra le fasi). Se ci riferiamo alla polarità delle molecole di soluto, ci sono due possibilità:

FASE STAZIONARIA: polare (allumina o silice attiva)FASE MOBILE: apolare (esano, tetracloruro di carbonio)

FASE STAZIONARIA: apolare (polistirene, silice C18)FASE MOBILE: polare (acqua, metanolo, tetraidrofurano e loro miscele)

Se facciamo riferimento al secondo caso (RPC), per migliorare la separazione il parametro che incide sulla risoluzione è la composizione della fase mobile. È evidente che minore è la polarità del soluto maggiore è il suo tR, ovvero se il tR del soluto è troppo elevato lo si può diminuire riducendo la polarità della fase mobile. Il fattore di capacità k’, che si ottiene dal valore del tR , è correlato alla risoluzione mediante il rapporto k’/k’+1.

Giorgio Bonaga

Analizziamo la curva che correla i valori di k’ con i valori del rapporto k’/k’+1

0 1 2 3 4 5

0

0,5

1,0

si osserva che il rapporto aumenta rapidamente per poi tendere ad un asintoto = 1. I valori di k’ ottimali sono compresi tra 3 e 4 (a cui corrispondono dei valori k’/k’+1 di 0,75 e 0,80) perché per valori superiori corrispondono incrementi poco significativi del rapporto. Se il valore del tR del soluto è molto basso l’incremento di k’ ha un senso, altrimenti conviene agire sugli altri fattori della risoluzione (N o ).

k ’

k ’k ’+1

Giorgio Bonaga

variazione di N

variazione di

variazione di k’

cromatogrammainiziale

A

A

A

A

B

B

B

B

Giorgio Bonaga

• soluti con gli stessi tR• minore allargamento dei picchi

• varia il tR di un soluto• stesso allargamento dei picchi

• variano i tR dei due soluti• maggior allargamento dei picchi

ACRONIMI DELLA CROMATOGRAFIAa) TECNICHE CROMATOGRAFICHEAF = Affinity ChromatographyBPC = Bonded Phase ChromatographyCC = Column ChromatographyCGC = Chiral Gas ChromatographyCLC = Chiral Liquid Chromatography2DGC = Two Dimensional Gas ChromatographyFGC = Fast Gas ChromatographyGC = Gas Chromatography (= Gas Liquid Chromatography)GFC = Gel Filtration ChromatographyGPC = Gel Permeation Liquid ChromatographyGSC = Gas Solid ChromatographyHPCE = High Performance Capillary ElectrophoresisHPLC = High Performance Liquid ChromatographyHPTLC = High Performance Thin Layer ChromatographyHRGC = High Resolution Gas ChromatographyIEC = Ion Exchange ChromatographyIPC = Ion Pair ChromatographyLC = Liquid ChromatographyLEC = Ligand Exchange Chromatography LLC = Liquid Liquid ChromatographyLSC = Liquid Solid Chromatography Giorgio Bonaga

MGC= Multidimentional Gas Chromatography (Comprehensive GC)NPC = Normal Phase ChromatographyPC = Paper ChromatographyPLOT = Porous Layer Open TubularRPC = Reverse Phase ChromatographySCOT = Support Coated Open TubularSEC = Size Exclusion ChromatographySIC = Suppressed Ion ChromatographySFC = Supercritical Fluid ChromatographyTLC = Thin Layer ChromatographyUFGC = Ultra Fast Gas ChromatographyUPLC = Ultra Performance Liquid ChromatographyWCOT = Wall Coated Open Tubular

Giorgio Bonaga

B) RIVELATORI PER CROMATOGRAFIADAD = Diode Array Detector (LC)ECD = Electron Capture Detector (GC)ED = Electrochemical Detector (GC)FD = Fluorescence Detector (LC)FID = Flame Ionization Detector (GC e LC)MS = Mass Spectrometry Detector (GC e LC)NPD = Nitrogen Phosphorus Detector (GC)RID = Refractive Index Detector (LC)TCD = Thermo Conductivity Detector (GC)UV-VIS = UltraViolet-Visible Detector (LC)