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Dinamica delle Popolazioni BattericheLaboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

Lezioni di Microbiologia

Informazioni:Prof Eugenio A. Debbia

Università di Genova Scuola di Scienze Mediche e Farmaceutiche

DISC-Sezione di Microbiologia,

Viale Benedetto XV, 6, 16132 Genova

Tel: 010-33 51047

329 260 5218

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W. Churchill

1



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Murray et al. Microbiologia Medica EMSI

Mims et al. Microbiologia clinica EMSI

Harvey et al. Le basi della Microbiologia (con

approfondimenti clinici) Zanichelli

Microbiologia Clinica Esculapio 2018

2



Con il microscopio si incomincia a pensare all’invisibileE ciò permette la scoperta dei microrganismi

3



Olanda 1674

Anton van Leeuwenhoek

4

http://images.google.it/imgres?imgurl=http://www.euronet.nl/users/warnar/bac1.jpg&imgrefurl=http://www.euronet.nl/users/warnar/leeuwenhoek.html&h=386&w=362&sz=34&hl=it&start=4&tbnid=mxU82fWzAy1SUM:&tbnh=123&tbnw=115&prev=/images?q=Leeuwenhoek+and+animalcules&svnum=10&hl=it&lr=&sa=X

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Il microscopio a lente singola di Leeuwenhoek5



Germania 1840

Friedrich Henle

Teoria del “germe”

I microorganismi sono

responsabili di

MALATTIA nell’uomo

6

http://it.wrs.yahoo.com/_ylt=A0geunvfixtFlhwAGK4dDQx./SIG=1i1a76r5i/EXP=1159519583/**http:/it.search.yahoo.com/search/images/view?back=http://it.search.yahoo.com/search/images?p=Henle+Friedrich&ei=UTF-8&fr=FP-tab-web-t340&fl=1&x=wrt&w=250&h=240&imgurl=www.cvm.tamu.edu/cancer/professional/Cytology/history%20Images/3-17.jpg&rurl=http://www.cvm.tamu.edu/cancer/professional/Cytology/asp/A_History.asp&size=10.2kB&name=3-17.jpg&p=Henle+Friedrich&type=jpeg&no=9&tt=9&oid=ac018fd360d87dc6&ei=UTF-8

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Vienna 1850-1860

I.F. Semmelweis

Tentò di dimostrare che igermi dalla sala di anatomiagiungevano alla sala parto,tramite i medici e gli studentiSuggerì la disinfezione dellemani prima di interveniresulla puerpera.Non fu mai ascoltato

7

http://it.wikipedia.org/wiki/Immagine:Ignaz_Semmelweis.jpg

http://it.wikipedia.org/wiki/Immagine:Ignaz_Semmelweis.jpg



1870-1880

Francia e Germaniaviene dimostrato che alcuni microorganismi sono i

responsabili di carbonchio, rabbia, peste, colera e tubercolosi

Pasteur Koch

8

http://images.google.it/imgres?imgurl=http://www.charite.de/jpg/rk/rk_ma.jpg&imgrefurl=http://www.charite.de/ch_rkma.html&h=1396&w=988&sz=62&hl=it&start=1&tbnid=uaICFaNYF4QMaM:&tbnh=150&tbnw=106&prev=/images?q=Robert+Koch&svnum=10&hl=it&lr=&sa=G

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MICROBIOLOGIA

• Batteri

• Virus

• Miceti

• Protozoi e altri parassiti9



MicrorganismiOrganismi unicellulari

EucariotiNucleo evidente con

membrana

Batteri Nucleo non evidente

AlgheProtozoiMiceti

EubatteriClamidie

SpirocheteRickettsie

Micoplasmi 10



11



12



13

Only a minute fraction of the Earth’s bacteria have been identified



Yim et al. Phil. Trans. R. Soc. B (2007) 362, 1195–1200

14



Enterobacterales (Enterobacteriaceae)



Cellula Eucariotica

Nucleo

Cellula

procariotica

BATTERIdimensioni

16



Citoplasma Nucleoide Ribosomi

Parete

cellulareMembrana

citoplasmatica

Membrana

citoplasmatica

Reticolo

endoplasmatico

Ribosomi

Nucleo

Nucleolo

Membrana

nucleare

Citoplasma

Mitocondrio

Cloroplasto

STRUTTURA INTERNA DELLA CELLULA MICROBICA

a) CELLULA PROCARIOTICA b) CELLULA EUCARIOTICA

plasmide

17



Proteine

Acidi

nucleiciLipidi

Polisaccaridi

Nucleoide Ribosomi

Granuli

D’accumulo

Parete

CitoplasmaFlagello

Membrana

Composizione: H2O (80%), K, Na, Mg, Ca, Fe,

Zn, P, S e macromolecole organiche

localizzazione delle macromolecole nella cellula batterica

18



1. Cocchi, 2. Diplococchi,

3. Streptococchi, 4. Stafilococchi

5.Tetradi di cocchi, 6. Coccobacilli

7. Clostridi, 8. Bastoncini,

9. Carbonchi, 10. Fusobatteri

11. Vibrioni, 12. Spirilli

13. Borrelie, 14. Treponemi

15. Leptospira

19



20



COLORAZIONE semplice DELLE

CELLULE PER L’OSSERVAZIONE

MICROSCOPICA

Strisciare la coltura su un vetrino

Formando uno strato sottile

Asciugare all’aria

Passare il vetrino sulla fiamma per fissare il campione

Ricoprire il vetrino con colorante

Risciacquare e asciugare

Porre una goccia d’olio (da immersione)

sul vetrino; osservare con l’obiettivo 100x

Vetrino Olio

100x

21



Hans Joachim Christian Gram

Il suo nome è legato all'importante

scoperta della colorazione di Gram

da lui effettuata nel 1884 a Berlino:

mentre esaminava del tessuto

polmonare di pazienti deceduti per

polmonite notò che le cellule

batteriche si coloravano più

intensamente con cristal violetto e

soluzione di lugol

Tale colorazione è tutt'oggi

essenziale nella classificazione dei

batteri22



COLORAZIONE DI GRAM (complessa o

differenziale)

Fase 1

Fase 2

Fase 3

Fase 4

Ricoprire lo striscio fissato al calore

con cristal-violetto per 2-3 minuti

Tutte le cellule si coloreranno di viola

Aggiungere soluzione iodata per 1 minuto

Le cellule rimarranno viola

Decolorare in alcool per circa 1-2 minuti

Le cellule Gram-positive risulteranno

viola, quelle Gram-negative incolori

Colorare con fucsina per 1-2 minutiG-

G+

Le cellule Gram-positive (G+)

risulteranno viola, quelle Gram-negative

(G-) avranno una tonalità da rosa a rosso23


La colorazione di Gram

Un Gram positivo Un Gram negativo Un Gram positivo

Bastoncelli Gram negativi

misti a cocchi Gram positivi

Cocchi Gram

positiviCocchi Gram

positivi24


25



Colorazione di Ziehl-Neelsen(bacilli alcool-acido resistenti)

Fucsina fenicata a caldo 5 m

Acido solforico (20%) 30’’

Alcool 30’’

Blu di metilene 1 m

26


Batteri alcool-acido resistenti: rossi

su fondo blu azzurro

27


Osservazione a contrasto di fase

Un batterio (L. sakei),

400x

Un lievito (S. cerevisiae),

400xUna muffa (G. candidum),

400x

Un attinomicete

400x

Un lievito (Y. lipolytica)

400x

Una muffa (R. oligosporus),

400x28


Osservazione in campo scuro

29



Anatomia della cellula batterica

Schematicamente dall'esterno verso l'interno i batteri presentano:

a) glicocalice o slimeb) capsulac) flagelli, pili o fimbried) involucro (parete in generale) totalmente diverso tra gram-positivi e gram-negativi (tale differenza è messa in rilievo proprio dalla colorazione di Gram)e) membrana citoplasmaticaf) mesosomig) citoplasma cromosoma o altro materiale genetico accessorio: es. plasmidi. ribosomicorpi inclusi

30



Glicocalice

Materiale stratificato intorno alla cellula

Strato S: distribuzione regolare (cristallina)

di sub-unità glicoproteiche piuttosto

gommoso

Capsula: matrice fibrosa costituita da

polimeri di carboidrati. Più comsistente.

Possono intrappolare acqua e gli antibiotici

senza dare impermeabilità

31



FIGURA 2.34. Le capsule forniscono protezione per le cellule.

32



Flagelli

Moto browniano

Movimento attivo

Flagello: unico filamento sprovvisto

di membrana – flagellina-

(diversa in specie batteriche diverse)

Chemiotassi positiva e negativa

33



STRUTTURA

DI UN FLAGELLO

BATTERICO

Membrana

citoplasmatica

Proteina

Mot

Periplasma

Proteina Fli

invertitore

del motore

Anello MS

Peptidoglicano

Anello P

Anello L

Uncino

Flagellina

Filamento

Membrana

Esterna

LPS

Richiede molta energia

ATP

34



Bacteria…

…are innumerable

…live in organized communities

…can communicate



Are they « intelligent »?



Intelligence in living beingsAdaptation to new situations

Robert, Dictionnaire de la Langue Française 2002

Intelligence in animalsAbility to form association links

between events or objects of which

it has had noprevious experienceOxford Dictionary of Science 2000



Swimm

Tumble

s t

s

t

st

s



Direct swim to the

source, up to a certain

concentration.

Swimming for food in E. coli

Then tumbling/swimming

again



FIGURA 2.28. La mobilità indirizzata permette ai batteri di rispondere a segnali chimici esterni.

40



41



FIGURA 2.30. Proteus mirabilis iperflagellato.

42



Pili o Fimbrie

Le fimbrie sono appendici diverse dai flagelli,sono costituite da una proteina detta pilina chegioca un ruolo fondamentale nel processo diadesione dei batteri ad altre cellule(patogenicità). Spesso sono codificati daiplasmidi (vedi oltre) sia come fimbrie perl'adesività sia come pilo detto sessuale percreare un ponte citoplasmatico tra due cellulebatteriche nei processi di coniugazione.

43

Type IV fimbriae (= bundle forming pilus)

Type I fimbriaeAfimbrial adhesin

Curli

44



45



La Parete (Cell-Wall)

E’ lo strato compreso tra la membrana citoplasmatica e la capsula

Gram+: peptidoglicano e ac. teicoici

Gram-: peptiglicano, lipoproteine, membrana esterna e lipolisaccaride (LPS)

Fornisce protezione osmotica (5-20 atm) entra in gioco nella divisione non ha permeabilità selettiva

46



Gram positivi Gram negativi

Peptidoglicano

Membrana

citoplasmatica

Peptidoglicano

Membrana

Periplasma

Membrana esterna

Lipopolisaccaridi e

proteine

RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA

DELLA PARETE CELLULAREDEI GRAM POSITIVI E NEGATIVI

47



PARETE CELLULARE DEI GRAM

POSITIVI

Acido teicoicoProteina associata

alla pareteAcido

lipoteicoico

Peptidoglicano

Membrana

citoplasmatica

48



BATTERIO GRAM NEGATIVO

Membrana esterna

Membrana

citoplasmatica

Peptidoglicano

49



PARETE CELLULARE DEI

GRAM NEGATIVI

Membrana

esterna

Periplasma

Membrana

citoplasmastica Interno

FosfolipidePeptidoglicano

Lipoproteina

Polisaccaride O-specifico Core polisaccaridico

Lipide APorina

Esterno

Lipopolisaccaride

(LPS)

50



Enzimi attivi sulla parete

Lisozima, contenuto nella saliva, lacrime e

mucosa nasale,

Autolisine, contenute negli stessi batteri:

glicosidasi, amidasi e peptidasi

(enzimi che intervengono sulla sintesi di

parete).

52



Membrana citoplasmatica

Costituita da fosfolipidi e proteine, non

contiene steroli (negli eucarioti) presenta

invaginazioni: i mesosomi importanti nella

formazione del setto vi è attaccato il DNA in

certe specie su altri mesosomi vi è un sistema

di trasporto attivo (fotosintesi, azoto)

53



Doppio strato fosfolipidico della

Membrana Citoplasmatica batterica

Regione

idrofila

Regione

idrofobica

Acidi grassi

H2O

FosfatoGlicerolo

Lipidi 40% (steroli assenti, fosfolipidi ++)

54



STRUTTURA DELLA

MEMBRANA

CITOPLASMATICA

Molecola

fosfolipidicaProteine integrali

di membrana

FosfolipidiEsterno Gruppi

idrofilici

Gruppi

idrofobici

Interno

55



Membrana citoplasmaticaFunzioni

permeabilità selettiva e trasporto,

trasporto elettroni e fosforilasi ossidativa

escrezione enzimi idrolitici

contiene enzimi e proteine (carrier) deputate alla sintesi del DNA, polimeri della parete, lipidi di membrana contiene recettori e proteine necessarie alla chemiotassi

Il 50% della membrana si presenta in uno stato semifluido dovuto alla grande attività per la crescita batterica

56



FUNZIONI DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA

Barriera

di permeabilità

Sito di ancoraggio

Produzione dell’energia

Previene dispersioni e funziona come centro di transito

per il trasporto di nutrienti da e verso la cellula

Siti di molte proteine coinvolte nel trasporto, nelle

vie biosintetiche e nella chemiotassi

Enzimi della catena respiratoria

Mesosomi ?57



Forza motrice protonica: le reazioni biochimiche a livello di MC creano un eccesso di H+ all’esterno (gradiente) che tendono a rientrare. Attraverso ATPasi la cellulagenera ATP.

58



59



Lo spazio periplasmico

E’ compreso tra la membrana interna e quellaesterna, è riempito da un gel formato dapeptidoglicano idratato. Diffusi nel gel vi sonoinoltre proteine ed oligosaccaridi nonché proteineleganti specifici substrati, enzimi come la fosfatasialcalina che reagendo con substrati li rendonotrasportabili all’interno. Molti di questi compostiintervengono nella regolazione della pressioneosmotica, per esempio, cellule che crescono inambiente ipotonico aumentano la sintesi dioligosaccaridi.

60



61

LPS, Endotossina: LIPIDE A

Dimero di N acetil

glucosamina

fosforilata ed

esterificata con acidi

grassi saturi

Ripetizione di unità diverse nelle

diverse specie

Contribuisce alla tossicità del

Lipide A influenzandone

l’idrosolubilità e la struttura

La struttura del lipide A è molto conservata; in particolare, è

praticamente identica in tutte le Enterobacteriaceae

Presenza costante di alcuni

zuccheri particolari come

l’acido cheto-deossioctonico

(KDO) e un eptoso

rappresentato in genere da

L-glicero-D-mannoeptoso



Struttura

UNITA’ BASALE

Gruppo

N-acetile

N-acetilglucosamina (G) Acido N-acetilmuramico (M)

Legami

peptidici

Acido Meso

diaminopimelico

Legame sensibile

Al lisozima

L-alanina

Acido D-glutammico

D-alanina62



FIGURA 2.15. I legami crociati tra le catene peptidiche danno resistenza al peptidoglicano.

63



64



Sistemi di secrezione(Gram-negativi)

Sono NOTI SEI (sette) SISTEMI di esportazione di molecole

effettrici nella membrana e citoplasma della cellula ospite della

quale modulano ed alterano le funzioni per favorire la propria

sopravvivenza e replicazione nei tessuti dell.ospite. L’energia

necessaria per il trasporto del substrato è fornita da ATP per

azione di ATPasi (tranne che nel sistema IV) situata nella

faccia interna della membrana citoplasmica. Alla

secrezione di molte proteine batteriche partecipano delle

chaperonine che legano il substrato, ne impediscono la

degradazione e ne orientano il passaggio attraverso i vari

sistemi

65



Sistemi di secrezione(Gram-negativi)

Tipo I: la proteina è direttamente liberata nell’ambiente attraverso una porina

Tipo II: la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi un vettore la porta all’esterno

TipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente con un meccanismo tipo siringa

TipoIV: il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula mediante un ponte citoplasmatico (donatore e ricevente)

Tipo V: la proteina è portata all’esterno mediante se stessa (autotrasporto)

Tipo VI: la proteina è direttamente iniettata nella cellula bersaglio (eu-procariota) mediante meccanismo attivo (coda di fago)

Tipo VII: (MT) la proteina è immessa fuori dalla membrana interna e portata all’esterno attraverso un meccanismo non ancora noto

66



67



Fig. 4. Model for type VII secretion. Both Esx and PE/PPE proteins are exported as dimers

by the T7S secretion machinery. Substrate recognition occurs via a C-terminal secretion motif on one of the dimer subunits (indicated by a

red box). The cytosolic component EspG specifically recognizes PE/PPE proteins and possibly targets these substrates to the putative

membrane channel that consists of EccB, EccC, EccD and EccE. The three nucleotide binding domains of EccC are likely involved in

energizing translocation of substrates through this channel. In this model, T7S is a two-step process, in which the channel in the outer

membrane refers to a hypothetical, so far unidentified pore.

68



Sistemi di secrezione(Gram-positivi)

Le proteine elaborate nel citoplasma sono

trasferite a livello di membrana citoplasmatica

qui alcune proteine vettore (chaperone)

mediano il passaggio attraverso la parete

durante il quale la proteina si trasforma nella

versione funzionale con meccanismo non noto

70



FUNZIONI DEL CROMOSOMA

Il cromosoma consiste di circa 3,8-4,5 milioni di basiappaiate, esso è diviso funzionalmente in segmenti,ciascuno dei quali determina una sequenza diaminoacidi e quindi la struttura di una proteina.Queste proteine, enzimi, componenti dellamembrana ecc. costituiscono le proprietà delmicrorganismo. Un segmento di DNA che determinaun prodotto funzionale è chiamato gene. Gli eventiattraverso i quali una sequenza di nucleotidi di ungene determina una proteina sono i seguenti:

71



L’enzima RNApolimerasi, usando il DNA

come modello, forma una singola catena

poliribonucleotidica chiamata RNA

messaggero (mRNA). Questo processo è noto

come trascrizione. Questo mRNA ha una

sequenza nucleotidica che è complementare

con una delle catene della doppia elica di

DNA.

72



73



74



Gli aminoacidi sono attivati enzimaticamente e

trasferiti ad una molecola particolare di RNA

chiamato RNA transfer (tRNA). Questi tRNA hanno

una struttura che presenta ad una estremità una

tripletta di basi sul mRNA, ed all’altra estremità

hanno legato l’aminoacido corrispondente. La

tripletta posta sul mRNA si chiama codon.

75



mRNA ed il tRNA vanno insieme sulla

superficie del ribosoma. Il tRNA trova la

tripletta complementare sul mRNA. Il

ribosoma si muove sul mRNA e la sintesi

procede. Il processo è noto come traduzione.

76



PLASMIDI

I plasmidi sono piccoli elementi di DNA circolare

che si replicano autonomamente (replicon, fattori R,

elementi genetici extracromosomici, geni aggiunti,

episomi, profagi non integrati). Codificano per

funzioni non indispensabili per la cellula, ma che

possono essere fondamentali in particolari ambienti.

Diffusione della resistenza agli antibiotici

77



Plasmidi o Fattori R

• Scoperti in Giappone nel 1955

• Coniugativi e non

• Codificano resistenza per uno o più antibiotici

• Possono quindi essere selezionati da uno qualsiasi degli antibiotici inefficaci

• Possono codificare anche resistenza ai metalli pesanti

• Spesso codificano per enzimi inattivanti



Origine dei Fattori R

Esistevano prima dell’era antibiotica

Veicolati spesso da microorganismi produttori di antibiotici

e/o

occupanti le stesse nicchie dei germi produttori di antibiotici

Ceppi produttori di antibiotici sintetizzano enzimi simili a quelli specificati dai Fattori R



PLASMIDI

Elementi genetici extracromosomici DNA

circolare, doppia elica replicazione autonoma

( da 1.5 a 400 Kb 1-1,5 Kb = 1 gene

4500 Kb = cromosoma

1 Mdal = 1 milione dalt = 3 Kb

1ųm = 2 Mdal

80



PLASMIDI

ClassificazioneFenotipo

Numero di copie

Peso molecolare

Frammenti di restrizione

Gruppo di compatibilità

Genetico e biochimico

Fattori R coniugativi e non

Amplificazione dei geni

Batteriocine

81



82



83

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ENDOSPORE

Diversi microorganismi (gram+), quando lecondizioni ambientali diventano sfavorevoli,sono in grado di formare endospore (Bacillus,Clostridium, Sporosarcina ecc.) che poi sonoliberate nell’ambiente.

La spora è una cellula in fase di riposo,altamente resistente al calore, all’essiccamento,e agenti chimici, quando le condizioni risultanonuovamente favorevoli la spora germina eproduce una cellula vegetativa.

84



85



Sporulazione

La sporulazione comporta la produzione di nuovestrutture, enzimi e metaboliti. Circa 200 geni strutturalisono attivati durante il processo. Inizia con unainvaginazione della MC sino a racchiudere il nucleo. Laprespora si trova così racchiusa tra due membranecapaci di sintetizzare parete nella parte compresa traloro. La prima struttura che appare si chiama corteccia,con internamente la parete della spora, all’esterno delledue membrane si costituisce la tunica sporale(mantello), ed oltre la tunica l’esosporio. Tutto richiedeuna gran quantità di calcio e sintesi di ac. dipicolinico.All’interno ove è contenuto il nucleo (core), gli enzimivegetativi sono degradati e rimpiazzati da costituentidella spora.

86



STADI DI FORMAZIONE

DELL’ENDOSPORA

Stadio 0

Stadio 1

Stadio 2

Stadio 3 Stadio 4

Stadio 5

Stadio 6

Stadio 7

Cellula

vegetativa

Parete

Membrana

citoplasmatica

DNA

Spora in via di sviluppo

Membrana

interna della spora

Membrana

esterna

della spora

Core

Nucleo

centrale

Disidratazione

Esosporio

Corteccia iniziale

Strati corticali

Esosporio

Core

Spora libera

7-10h

87



Proprietà

Core: contiene il nucleo, tutti icomponenti della sintesi proteica ed unsistema per generare energia basato sullaglicolisi. L’energia per la germinazione èconservata in 3-fosfoglicerato piuttostoche ATP. La resistenza è dovuta in parteallo stato disidratato e alla presenza nelcore di dipicolinato di calcio (intermedionella sintesi della lisina)

88



Proprietà

Parete della spora

E’ lo strato più interno di parete checirconda la MI della spora, composta dipeptidoglicano (diventerà parete nellacellula quando germinerà)

89



Proprietà

Cortex

E’ lo strato più spesso dell’involucrodella spora, contiene peptidoglicano macon meno legami crociati di quello usuale.Sensibile al lisozima, la sua autolisi èimportante durante la germinazione.

90



Proprietà

Mantello

E’ composto da proteine di tipocheratinoso aventi molti legami disolfuro.Impermeabile agli agenti chimici.

91



Proprietà

Esosporio

Lipoproteina contenente alcuni carboidrati.

92



Fisiologia della spora

Nessun consumo di O2

Attività enzimatiche assenti

Assenza di sintesi macromolecolari

Resistenti agli UV e all’essiccazione

Termoresistenza: stabilità proteine(particolare stabilizzazione della struttura2aria e 3aria), Ca, acido dipicolinico problemasterilizzazione

Possono sopravvivere per decine di anni

94



GERMINAZIONE

Avviene in tre stadi: attivazione, iniziazione e crescita.AttivazioneAnche se posta in ambienti favorevoli la spora nongermina se non vi è danno al mantello: calore, abrasione,acidità e composti contenenti gruppi sulfidrici liberi.IniziazioneUna volta attivata la spora, la germinazione avviene secerti effettori sono legati (L-alanina, adenosina). Questomette in azione l’autolisina che degrada il cortex. E’assunta acqua, è liberato il dipicolinato di calcio e sonodegradati gli altri costituenti della spora.CrescitaSi osserva un rigonfiamento all’interno (core) e quindisintesi di nuova parete su quella già presente (parete dellaspora) con successiva divisione cellulare.

95

Resistenza Inattivazione

Batteri non

sporigeni

80°C, 5-10 min

Sporigeni

C. botulinum

C. tetani

Clostridi

gangrena

gassosa

Bollitura

330 min

90 min

30 min

Vapor acqueo

20 min, 121°C,

1 atmosfera

Calore secco

90 min, 170°C

DIFFERENZE PRINCIPALI TRA

ENDOSPORA E CELLULA ORIGINARIA

Morfologia e dimensioni

Composizione

Resistenza agenti chimici e fisici

Attività metaboliche

96

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