In Natura si distingue - microbiologia.unige.it 03 patov .pdf · Laboratorio di Microbiologia...

In Natura si distingue:

Vita saprofita: nell’ambiente a spese di materiale inanimato

Vita parassitaria: a carico di organismi

(Maggioranza dei batteri)

http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htm

Dinamica delle Popolazioni BattericheLaboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

Vita parassitaria: a carico di organismi superiori

Parassiti

Obbligati Facoltativi

(Minoranza)

1

Parassiti

Rapporti tra batteri e ospite:

Commensali (indifferenti)

Simbionti (utili)



Opportunisti (talvolta possono dare malattia)

Patogeni (nocivi) (moltiplicazione in vivo e

tossigenicità)

2

Popolazione microbica normale

Esistono due gruppi di PMN: residentetransito

1) Competizione con nutrienti (interferenza)2) Competizione con i recettori sulle cellule (tropismo)3) Produzione di batteriocine


Dinamica delle Popolazioni Batteriche

3

3) Produzione di batteriocine4) Produzione di acidi grassi o altri metaboliti

(anaerobi)5) Continua stimolazione del sistema immune

(macrofagi)6) Stimolazione di fattori immuni protettivi (Ig)

POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE

Microrganismi acquisiti dalla nascita subiscono modifiche in numero e specie lungo tutto il decorso della vita

Dipendono da

•fattori genetici



4

•fattori genetici•abitudini alimentari e igieniche •situazioni di stress •fenomeni psicosomatici •età


Residenti, o popolazione microbica normaleÈ dominata dai batteri anaerobi o anaerobi facoltativi, si calcola che il rapporto oscilli tra le 100 e le 1000 volte, circa 500-1000 specie diverse



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100 e le 1000 volte, circa 500-1000 specie diverse non del tutto identificate o coltivate nel solo apparato gastroenterico in circa 200 m2 vi sono almeno 10 14 microrganismiL‘unico sito anatomico privo di anaerobi è la faringe


Residenti, o popolazione microbica normalerappresentano circa l’1-3% del peso corporeo.10 volte il numero totale delle cellule somatiche Intestino: più di 500 (1000) specie diverse di



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Intestino: più di 500 (1000) specie diverse di batteri molte delle quali non coltivabili con le metodiche tradizionali Si stima che circa il 60% del materiale fecale sia costituito da batteri.

PMN

Cute

Cavità orale e prime vie aeree

Tratto intestinale



Tratto intestinale

Uretra

Vagina

Occhio

8

PMN Cute

PM transitoria

Pieghe cutanee

Secrezioni sebacee



Sudorazione e lavaggi

Disinfezione

Medicazioni occlusive

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PMN cavità orale

Sterile alla nascita

4-12 ore dopo si stabiliscono i viridanti (madre)

Seguono stafilococchi, anaerobi, neisserie,



Seguono stafilococchi, anaerobi, neisserie, moraxelle, difteroidi.

Eruzione dei denti: spirochete anaerobie, prevotelle, fusobatteri, capnocytophaga

Actinomyces tonsille e gengive degli adulti

Miceti: Candida10

PMN vie respiratorie

Faringe e trachea

simili

alla cavità orale



alla cavità orale

Bronchi pochi batteri

Bronchioli e alveoli sterili

11

PMN vie respiratorie



12


La popolazione microbica dell’apparato gastro-enterico è stata definita come

"un insieme di microrganismi presenti nel lume intestinale i quali, se



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nel lume intestinale i quali, se convivono in un determinato equilibrio

contribuiscono allo stato di salute dell'ospite"


Nello stomaco vi è un alto grado di acidità e il numero dei

microrganismi non supera le mille unità, mentre nell'ileo la



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unità, mentre nell'ileo la concentrazione aumenta arrivando

nel colon a 1011-1012 batteri per g

PMN intestinale

Duodeno: 103-106/gr

Digiuno-ileo: 105-108/gr

Cieco-colon trasverso: 108-1010/gr

pHacido



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Cieco-colon trasverso: 108-1010/gr

Sigma-retto: 1011/gr

antibiotici basico


Anche il numero e il tipo di specie di microorganismi varia



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specie di microorganismi varia con il variare del sito anatomico

PMN intestinale



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Portano milioni di geni (5), un numero di gran lunga superiore ai 20.000 stimati del genoma umano. Una gran varietà di composti che possono essere metabolizzati (è un organo aggiunto, bioreattore)



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metabolizzati (è un organo aggiunto, bioreattore)Quando varia, si modifica anche l'assorbimento dei nutrienti Obesi e magri hanno profili batterici radicalmente diversi nei loro intestini


La degradazione nell’intestino crasso, in particolar modo della lignina e della

cellulosa, è incompleta portando a particelle di fibre vegetali che



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particelle di fibre vegetali che persistono fino all’intestino distale

dove possono esercitare un ruolo che favorisce il processo di eliminazione

delle feci


E’ importante il ruolo dei batteri intestinali nella sintesi e nell'utilizzo delle vitamine.B1, B2, B6, B12, PP, H, acido pantotenico e acido folico.



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folico.La vitamina K viene sintetizzata dall'Eucobacterium lentum che modifica degli steroidi a livello intestinaleI germi intestinali interagiscono con gli acidi biliari.


Gli acidi biliari derivano dal metabolismo del colesterolo nel fegato, coniugati con glicina ed eliminati con la bile.

Il metabolismo degli ormoni steroidei (androgeni, estrogeni e corticosteroidi) avviene nel lume intestinale attraverso varie reazioni chimiche



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attraverso varie reazioni chimiche Gli ormoni steroidei vengono modificati a livello del fegato ed escreti con la bile. Nell'intestino verranno deconiugati e sottoposti alle modificazioni enzimatiche per poi ritornare al fegato attraverso la vena porta.

POPOLAZIONE MICROBICA INTESTINALE

A questo livello vi è una barriera protettiva costituita da uno strato di muco denso che

contiene IgA secretorie, peptidi antimicrobici e anche complessi



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antimicrobici e anche complessi giunzionali che tengono unite le cellule

epiteliali adiacenti in modo da regolare la permeabilità del tessuto intestinale e impedire che i microrganismi lascino

questa sede


Gli enterociti esprimono recettori PAMP (pathogen-associated molecular pattern), comprese le proteine denominate TLR e NOD. Questi recettori captano la presenza di componenti batterici presenti e conservati in



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componenti batterici presenti e conservati in diverse specie microbiche e possono dare inizio ad una cascata pro infiammatoria per la difesa. I batteri possono presentare sulla superficie esterna delle strutture che sono individuate dalle cellule epiteliali e dalle cellule del sistema immunitario



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The commensal microbiota, intestinal epithelial cells, and intestinal immune cells engage in a complex crosstalk. Epithelial cells, M cells, and dendritic cells (DCs) can directly sense and sample the intestinal contents and communicate information about the microbiota to other subsets of immune cells. Toll-like receptors, expressed by epithelial cells, M cells and DCs, and NOD-like receptors, are classes of microbe-sensing molecules. Cytokines, chemokines, and host and microbial metabolites are key molecular mediators of intestinal homeostasis that influence responses of both host and microbe. l

PMN vagina

Alla nascita pH acido: lattobacilli

Dopo alcune settimane fino a pubertà pH neutro: PMN mista cocchi e bacilli

Pubertà pH acido: lattobacilli



Pubertà pH acido: lattobacilli

Dopo la menopausa pH neutro: PMN mista cocchi e bacilli

IMPORTANTE IL LIVELLO DEGLI ESTROGENI

26



27



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Batteri a circolazione interumana:

Infezioni esogene ed endogene



Portatore sano

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Possibili vie d’accesso per i microorganismi

Vie respiratorie

tratto gastro-enterico

Canali naturali



tratto gastro-enterico

genito-urinario

30


Via Esempi

Ingestione Salmonella, Shigella, E. coli, V. cholerae, C. botulinum ecc..

Inalazione Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella Chlamydia ecc…



Penetrazione diretta (aghi, ferite)

C. tetani, S. aureus ecc..

Punture d’artropodi

Rickettsia, Francisella, Y. Pestis ecc..

Sessuale N. gonorrhoeae, T. pallidum, C. trachomatis

transplacentare T. pallidum31


Inserzioni di: cateteri (urinari, vascolari ecc.)

tubi per ventilazione

sondini di drenaggio

Somministrazione di farmaci che deprimono la

Canali occasionali



Somministrazione di farmaci che deprimono la risposta immunitaria o che alterano il microambiente di alcuni distretti dell’organismo (es. antiacidi)

interruzioni dell’integrità della superficie della mucosa e della pelle

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Meccanismi di difesa naturale e barriere

L’ambiente in vivo è molto sfavorevole per i batteri: pH, T, O2, flusso dei liquidi organici, cellule ciliate, macrofagi,



macrofagi,

integrità e composizione biochimica dei tessuti, infiammazione, febbre

Strato corneo della pelle

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Meccanismi di difesa naturale e barriere

Mucose: muco, lisozima, IgA, epiteli ciliati, movimento del contenuto del lume del

Colonizzazione della cute e delle mucose



movimento del contenuto del lume del canale mucoso (intestino, uretra)…

PMN residente

Cellule di sfaldamento

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Meccanismi di difesa naturale

Fagocitosi

Funzioni dei fagociti: chemiotassi, ingestione e uccisione. I batteri elaborano sostanze che attraggono i fagociti, la fagocitosi è favorita dalle opsonine-anticorpi che rivestono la superficie battericaa) l’anticorpo agisce da opsoninab) l’anticorpo + antigene attiva il complemento



b) l’anticorpo + antigene attiva il complementoc) opsonine possono essere prodotte da sistemi termolabili che attivano il complementoLa fagocitosi richiede consumo di energia. E’ posseduta dai granulociti e macrofagi, il meccanismo non è del tutto noto, è stato osservato un aumento della produzione di acqua ossigenata e liberazione di lisozima nei vacuoli (fagosoma, proteine antibatteriche, lisozima, pH, fosfatasi, lactoferrina, perossidasi)

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Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)

Variazione antigenica (shift)

Inibizione della fusione lisosomiale

Elusione dei lisosomi e moltiplicazione nel citoplasma

Strategie batteriche



citoplasma

Produzione di catalasi che scinde lo ione superossido

Resistenza agli enzimi lisosomiali

Produzione di IgA proteasi

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Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)

La resistenza ai macrofagi può aversi mediante:

1. produzione di leucocidine che uccidono i macrofagi

2. capsula che impedisce la fagocitosi




3. produzione di superossidismutasi che sequestra l’ossigeno che serve ai macrofagi per la produzione di ATP che è necessario per la fagocitosi

4. mimetismo antigenico

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Mimetismo antigene

È la presenza di componenti strutturali che presentano notevoli analogie di composizione con materiali presenti nei tessuti dell’organismo ospite che vengono




tessuti dell’organismo ospite che vengono quindi difficilmente individuati come non-self

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Mimetismo antigene

Esempi:

la capsula di S. pyogenes è formata da acido jaluronico, presente nel connettivo.

Alcuni enterobatteri possiedono nella




Alcuni enterobatteri possiedono nella porzione polisaccaridica del LPS determinanti antigeni simili a quelli presenti nelle emazie della specie normalmente parassitata.

40

Mimetismo antigene

S.pyogenes possiede diversi materiali antigenici (proteina M, antigeni di

membrana, carboidrati di gruppo) che presentano analogie molecolari ed

antigeniche con strutture molecolari presenti nel miocardio, cute, nell’encefalo




antigeniche con strutture molecolari presenti nel miocardio, cute, nell’encefalo

e nelle articolazioni e la risposta autoimmune che si mette in opera durante

l’infezione da S. pyogenes, potrebbe rappresentare un elemento di rilievo nella patogenesi della febbre reumatica a della

cardiomiopatia reumatica. 41

Mimetismo antigene

Le Chlamydie presentano negli involucri esterni alcune proteine

ricche in cisteina che hanno analogie antigenetiche con la catena pesante

dell’alfa-miosina specifica del muscolo




dell’alfa-miosina specifica del muscolo cardiaco ed è stata quindi ipotizzata una base autoimmune nella patologia cardiaca correlata alla infezione di

Chlamydia (C. pneumoniaesoprattutto).

42

Gram-negative commensal of the human oropharynx, can causesepticaemia by crossing the mucosal barrier and entering thebloodstream or meningitis by crossing the blood–brain barrierinto the cerebrospinal fluid. In each case, N. meningitidis usesmolecular mimicry to survive exposure to the innate immunesystem. The ability of the immune system to distinguish foreigncells from self is mediated in part by sialic acid, which coats thesurface of human cells and acts as a ‘self signal’. N. meningitidis

Neisseria meningitidis




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surface of human cells and acts as a ‘self signal’. N. meningitidisexploits this feature by decorating its outer surface with sialicacid residues, thus masking itself from human defences.Molecular mimicry is a key component of N. meningitidispathogenesis and mutants that are unable to sialylate their outersurface are highly attenuated. The in vivo nutritionalenvironment has an impact on N. meningitidis host cell mimicry.N. meningitidis can use lactate and glucose as carbon andenergy sources, and lactate and glucose are present innasopharyngeal tissue, serum and cerebrospinal fluid at 1–2 mMand 6–10 mM levels, respectively.

Molecular mimicry by Neisseriameningitidis.

a | Glucose catabolism in N. meningitidisproceeds by the Entner–Doudoroffpathway and lactate catabolism feedsdirectly into the sialic acid pathway. Notethe relative number of metabolic stepsfrom glucose to phosphoenolpyruvate




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compared with that from lactate tophosphoenolpyruvate.b | Sialylated lipopolysaccharide (LPS)

on the N. meningitidis surface mimics thesurface of eukaryotic cells, preventingdeposition of the complement moleculeC3. Inactivation of the lactate permeasegene lctP results in C3-mediated celllysis.

Interestingly, although both of these carbon sources are presentin vivo, N. meningitidis catabolizes lactate at a faster rate thanit does glucose, and mutants that are deficient for lactatetransport are defective colonizers of nasopharyngeal tissue. Whymight a bacterium preferentially metabolize a more oxidizedsubstrate such as lactate over glucose? One likely explanation isthat intermediates of lactate consumption feed directly into the

Neisseria meningitidis




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that intermediates of lactate consumption feed directly into thesialylation pathway, thus enhancing sialic acid biosynthesis. This,in turn, leads to increased sialylation of the N. meningitidis outermembrane.As expected, a N. meningitidis strain that is unable to transportlactate (DlctP) is highly deficient for sialic acid modification of theouter membrane and is more susceptible to complement-mediated killing. Thus, for N. meningitidis, catabolism of apreferred carbon source in vivo is coupled to a unique immune-evasion strategy.

Quando un microorganismo invade l’ospite

E’ in grado di superare le difese di un individuo sano

PATOGENO



Sfrutta alcune situazioni di debolezza dell’ospite

OPPORTUNISTA

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Attributi dei microorganismi che causano malattia

Abilità di causare malattia o produrre lesioni progressive (Patogenicità)Grado di patogenicità, ovvero, malattia causataanche da batteri in numero piuttosto limitato(Virulenza).



(Virulenza).Queste proprietà possono essere suddivise intossicità: abilità nel produrre sostanze tossiche edinvasività: abilità nel penetrare i tessuti e didiffondere.Molti di questi caratteri sono controllati daplasmidi.

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Isole di patogenicità (PAI)

I geni per i fattori di patogenicità, soprattuttose localizzati a livello cromosomico, possonoessere (Gram-) riuniti in segmenti di DNA:PAI



PAI

I PAI probabilmente sono segmenti di DNAacquisiti orizzontalmente che differenziano ibatteri che li posseggono dagli altri dellastessa specie

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Infezione

L’infezione è il processo attraverso il

quale un microorganismo entra in



quale un microorganismo entra in

relazione con l’ospite

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Infezioni

Monomicrobica: un singolo patogeno

Polimicrobica: da più patogeni aerobi o anaerobi

Mista: aerobi ed anaerobi insieme

Comunitaria: acquisita in ambiente non



Comunitaria: acquisita in ambiente nonospedaliero

Nosocomiale: acquisita dopo 72 ore dal ricovero

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Fasi di una proliferazione batterica

1) Adesione

2) Invasione

3) Produzione di metaboliti (crescita)

4) Produzione di tossine: enzimi degradativi



4) Produzione di tossine: enzimi degradativi

tossine tipo A-B

5) Endotossine

6) Induzione di infiammazione

7) Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)

8) Resistenza agli antibiotici

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Fattori che caratterizzano un microorganismo patogeno

Adesività mediata da strutture specializzate

ac. lipoteicoici nei gram-positivi

proteine nei gram-negativi (fimbrie, pili ecc.)

produzione di capsula (slime)

capacità biochimica di metabolizzare nelle condizioni



capacità biochimica di metabolizzare nelle condizioni

nutrizionali fornite dai tessuti dell’ospite

capacità di penetrare e moltiplicarsi in tessuti profondi (invasività)

capacità di contrastare i meccanismi difensivi dell’ospite

produzione di esotossine

52

Adesione

Uno dei principali eventi che promuovono l’infezione.

Il processo è mediato da strutture poste sulla superficie esterna dei batteri note come adesine, per esempio l’antigene K88 dell’Escherichia colienteropatogeno, gli acidi lipoteicoici



enteropatogeno, gli acidi lipoteicoici (streptococchi) e altre. Le cellule epiteliali hanno a loro volta, come già detto, strutture che legano le adesine ad esempio fibronectina disposta sulla superficie dell’epitelio orale.

(Batteri isogenici privi di adesine non danno infezione)

53

Perchè i batteri aderiscono?

• I batteri non adesi verrebbero eliminati

• Adesione: prima tappa della colonizzazione

3: Fase di adesione reversibile e irreversibile

• Adesione: prima tappa della colonizzazione e della formazione del biofilm

54

Evidenze sperimentalidel ruolo dell’adesione nella

colonizzazione• I batteri legano recettori isolati o analoghi

dei recettori• L’adesina purificata o un suo analogo lega il • L’adesina purificata o un suo analogo lega il

recettore • L’adesione è inibita da:

• Analoghi dei recettori e delle adesine• Enzimi che distruggono l’adesina o il recettore• Anticorpi specifici diretti contro l’adesina o il

recettore55

Cosa utilizzano i batteri per aderire? Adesine batteriche

• Proteine espresse sulla superficie• Fimbrie• Glicocalice, Lipopolisaccaride (G-), Acidi • Glicocalice, Lipopolisaccaride (G-), Acidi

teicoici (G+)• Enzimi

• Enzimi batterici ancorano la cellula al substrato

• Enzimi batterici possono esporre recettori criptici 56

Morfologia delle adesine

Type I fimbriaeAfimbrial adhesin

Type IV fimbriae (= bundle forming pilus) Curli

57

ADESINE BATTERICHEADESINE BATTERICHE

58

AdesivitàAdesione specifica e selettiva alle cellule epiteliali: adesine-recettore

)

Colonizzazione delle mucose



G-: proteine in fimbrie o piliG+: glicolipidi (ac. Lipoteicoici, [LTA]) +

proteine (es. F di S.pyogenes) in fibrilleRecettore su cellule: porzione glicidica di

glicoproteine o glicolipidi o proteine di membrana

Materiale capsulare59

Adesività

Ogni specie batterica interagisce con recettori presenti su determinati epiteli: Esiste uno spettro

S. mitis tutta la mucosa buccale S. salivarius lingua e gengiveS. pyogenes faringe e tonsille




N. gonorrhoeae uretraV. cholerae intestino tenueE. coli ileo, colon,tratto urogenitale, ecc.

Tossine ciliostatiche

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Fibronectina

Sulla superficie delle cellule epiteliali vi è una proteina, la fibronectina, con cui interagiscono le adesine dei batteri gram-positivi, prevenendo così l’adesione dei gram-negativi. La fibronectina è una glicoproteina prodotta dagli epatociti e distribuita in forma solubile in tutti i liquidi



epatociti e distribuita in forma solubile in tutti i liquidi organici, viene escreta nelle cavità naturali dell’organismo dove si deposita sulla superficie delle mucose ed è inoltre presente nei tessuti dove forma un reticolo fibrillare. La fibronectina è coinvolta in alcuni processi biologici tra cui la fagocitosi, la rigenerazione dei tessuti e nella differenziazione cellulare.

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Acquisizione di patogeni potenziali:malattia di base

Durante il decorso di varie affezioni si determinano variazioni nelle cellule di rivestimento (cute e mucose) con colonizzazione da parte dei bacilli gram-negativi e riduzione della popolazione batterica gram-positiva



Volontari o pazienti ricoverati in clinica psichiatrica non hanno dimostrato variazioni della popolazione batterica normale dell’orofaringeVariazioni con la durata della degenza (stesso reparto)

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FIBRONECTINA: ALTRI EFFETTI SULLA POPOLAZIONEBATTERICA RESIDENTE

La presenza di fibronectina in:ferite accidentali o causate da strumenti, sulla superficie di cateteri predispone all’invasività di cocchi gram-positivi (stafilococchi, streptococchi) che possiedono sulla loro superficie recettori per la fibronectina con la quale creano un legame molto stabile.



fibronectina con la quale creano un legame molto stabile.

La colonizzazione dei cateteri avviene con batteri gram-positivi produttori di slime che li rende immuni da qualsiasi trattamento con farmaci e dall’azione dei macrofagi.

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Fibronectina: un modulatore della popolazione batterica residente

Pazienti affetti da malattie organiche o ustioni, traumi ecc. dimostrano un ridotto tasso di fibronectina nel plasma

Conseguenze



ConseguenzeRiduzione di fibronectina dalla superficie cellulare scomparsa dei microorganismi (cocchi) gram-positivi colonizzazione da parte di bacilli gram-negativiProduzione di proteasi batterica e dell’ospite?Ulteriore riduzione del tasso di fibronectina nel sito di colonizzazione.

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Immunità naturale e Immunità acquisita:

Immunità naturale:dovuta non dal contatto con l’antigene ma dal genotipo.Es. malattie che colpiscono certe specie e non altre.Nell’uomo certe razze, certi gruppi etnici ecc.resistenza individuale diversa, nutrizione età, malattievarie.varie.Immunità acquisita:passiva dovuta alla somministrazione di anticorpispecifici che danno una copertura temporanea, ma puòconsentire una immediata ed elevata rispostaanticorpale. E’ passiva l’immunità acquisita dalla madreattraverso il flusso sanguigno ed il colostro.

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Immunità attiva e Immunità umorale

Immunità attivadovuta al contatto con un antigene, produzione di anticorpi richiedetempi di sviluppo anche lungo ma può dare protezione permanente

Immunità umoraleproduzione attiva di anticorpineutralizzano tossine e prodotti cellulari



neutralizzano tossine e prodotti cellularieffetto battericida diretto o litico con il complementobloccano l’abilità infettiva dell’agenteagglutinano i batteri facilita la fagocitosiopsonizzazione, interagiscono con le componenti di superficie chepossono limitare la fagocitosi

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Sopravvivenza alla superficie delle mucose

Una volta ancorati alla superficie di un epitelio (ma questo anche nei tessuti profondi) i batteri si moltiplicano e interagiscono con le cellule superiori attraverso la produzione di sostanze variamente tossiche. Queste proteine vengono secrete da appositi sistemi secretori grazie al quale i batteri



appositi sistemi secretori grazie al quale i batteri possono traslocare nel citosol della cellula eucariotica le proteine effettrici che interferiscono con il signalling eucariotico, compromettendo le funzioni cellulari e attivando il processo di apoptosi o alterano strutture particolari e causano necrosi

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Invasione

Produzione di enzimi extracellulari o attivi all’esterno dei batteri:collagenasi: distrugge il collagenocoagulasi: causa la coagulazione del plasma S.aureusialuronidasi: idrolizza l’acido ialuronico (tessuto connettivo)streptochinasi: (fibrinolisina) promuove la formazione di plasmina

dal plasminogeno, dissolve i coaguli



dal plasminogeno, dissolve i coaguliemolisine: lisano i globuli rossiproteasi: idrolizzano le immunoglobuline o altre proteine

dell’ospite.La tossicità gioca un ruolo importante nell’invasività ma non è un

fattore diretto (capsula polisaccaridica o di acidi ialuronici, proteina M, polipeptidi di superficie, resistenza agli enzimi dei fagociti).

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Penetrazione nei tessuti profondi

Mucosa

Sottomucosa

Tessuti profondi



Tessuti profondi

Via ematica/linfatica

Tutto l’organismo

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Penetrazione nei tessuti profondi

Il danneggiamento dell’epitelio mucoso è per molti batteri la strada per raggiungere la sottomucosa, altri quali Salmonelle e Shigelle utilizzano



quali Salmonelle e Shigelle utilizzano peculiari meccanismi invasivi che

consentono di penetrare direttamente nelle cellule dell’epitelio

mucoso. 71

Sopravvivenza nella sottomucosa e nei tessuti profondi

Sfuggire alle difese immunitarie (capsula o resistenza al killing dei fagociti)

moltiplicazioneTempo di moltiplicazione in vivo (8-10h ?) (situazione simile a chemostato*, ma effetto del



(situazione simile a chemostato*, ma effetto del s.i.)Siderofori ecc.Tropismo d’organo

* sangue e linfa portano nutrimenti e allontanano scorie

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Capsula

Contrasta gli effetti potenzialmentenocivi dell’interazione adesine-recettorefagocitaMaschera le adesine, varia la carica di superficie batterica




Maschera le adesine, varia la carica di superficie battericaOstacola la deposizione di C3b e l’ancoraggio di AbStrategia + comune nei G+Nei G- mancata produzione di fimbrie

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Sopravvivenza nella sottomucosa e nei tessuti profondi

Una volta all’interno di fagociti professionali,alcuni batteri patogeni sono in grado di evaderedal fagosoma (prima della fusione con i lisosomi),mentre altri sono in grado di moltiplicarsiall’interno del fagosoma alterando la membranaimpedendo la fusione con il lisosoma, oppure



all’interno del fagosoma alterando la membranaimpedendo la fusione con il lisosoma, oppureproduzione di catalasi e SOD per contrastare imeccanismi di killing ossigeno-dipendenti,eliminado i derivati dell’ossigeno molecolareprovvisti di azione microbicida (perossido diidrogeno, anione superossido etc).

74



75



Le shigelle non essendo in grado di accedere all’interno degli enterociti della mucosa del colon, attraverso la membrana apicale di tali cellule, guadagnano l’accesso alla sottomucosa attraverso le cellule M per transcitosi. I pochi batteri che arrivano alla sottomucosa vengono prontamente fagocitati dai macrofagi residenti nella sottomucosa.

76



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Produzione di metaboliti

Sono costituiti da prodotti originati dallacrescita batterica in seguito alla demolizionedi composti complessi, molti di questi, comel’acido lattico, alcoli, acetone o aldeidi o



l’acido lattico, alcoli, acetone o aldeidi ocomunque composti organici possonoesercitare un effetto tossico sulle cellule.

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Potere aggressivo dei batteri

Sostanze non tossiche:

capsula, coagulasi, catalasi (H2O2) SOD (O2

-), collagenasi, ialuronidasi ecc.

Sostanze tossiche:



Sostanze tossiche:

Esotossine: esocitate, proteiche

Endotossine: legate al batterio LPS

Divisione non netta i.e. endotossine proteiche: V. cholerae

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Differenze tra esotossine ed endotossine

ESOTOSSINE

Escrete da cellule viventi e ritrovate ad elevate concentrazioni nei terreniPolipeptidi PM 10.000-900.000Relativamente instabili: tossicità spesso rapidamente distrutta col calore>60°



distrutta col calore>60°Altamente antigeniche, stimolano la formazione di alti titoli di antitossina che neutralizza la tossinaConvertibile in antigene (anatossina) da formalina, acidi, calore ecc.Altamente tossiche, fatali per animali da laboratorio in mg o menoNon producono febbre nell’ospite

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Differenze tra esotossine ed endotossine

ENDOTOSSINE

Parte integrante della parete dei gram-negativiComplesso lipopolisaccaridico (LPS), il lipide A è la porzione responsabile della tossicitàStabile al calore>60° per ore senza perdere tossicitàNon stimola la formazione di antitossina



Non stimola la formazione di antitossinaLa parte polisaccaridica (molto variabile) stimola la produzione di anticorpi (Antigene somatico O)Non è convertibile in anatossinaDebolmente tossico per animali anche a dosi di mgSpesso causa febbre

81

Classificazione delle esotossine

TOSSINE CITOLITICHEAttive sulla membrana delle cellule

TOSSINE NEUROTROPEAttive sulle cellule del sistema nervoso



TOSSINE ENTEROTOSSICHEAttive sulle cellule della mucosa intestinale

TOSSINE PANTROPEAttive su tutte le cellule, inibiscono la sintesi proteica

82

Tossine emolitiche

Formazione di pori attraverso la membrana

Attività fosfolipasica che idrolizza la fosforilcolina della membrana



Fig 7.3 LA placa

83

Esotossine che agiscono a livello delle strutture della superficie cellulare

Tossina esfoliativa →sindrome cute ustionata



Tossine emolitiche (emolisine o citolisine)84

TOSSINE ENTEROTOSSICHE

Citotossiche che causano danni evidenti alle celluleCitotoniche danni non evidenti

Colerica è il prototipo (80.000 daltons)Subunità A 29.000 e 5-6 subunità B identiche 10.500Le sub. B si legano al recettore sulla membrana e facilitano l’ingresso della A



ALa A induce una ADP-ribosilante NAD-dipendente sul GTP che attiva inmodo permanente l’adenilciclasiquesto provoca un perturbazione nel passaggio di acqua ed elettroliti(perdita di acqua attraverso il lume intestinale)

Con meccanismo simile si ritrova in E. coli, K. pneumoniae, S. typhimurium e S. enteritidis

85



86

Tossina pertossica



87

L’esotossina dissenterica è prodotta dalla Shigella dysenteriae di tipo 1.Neurotossica ed enterotossica. L’inibizione della sintesi proteica avviene con unmeccanismo non ancora noto. Si osserva un’inibizione del trasferimento degliamminoacidi sulla catena peptidica nascente.

Tossina della pertosse. Proteina (100.000 D) composta da 5 subunità.La produzione di cAMP è regolata da due proteine situate all’interno della



La produzione di cAMP è regolata da due proteine situate all’interno dellamembrana cellulare: Gs che ha funzione stimolante e Gi che svolgeattività inibente. La tossina colerica ha come bersaglio finale la Gsmantenendola in uno stato attivo permanente, mentre la tossina della pertosseinteragisce con Gi impedendo qualsiasi attività inibente.

88

TOSSINE PANTROPE

Tossina difterica (prototipo), catena polipeptidica di 62.000 D unita da 2 ponti S-S, la molecola è tagliata da proteasi in due frammenti A e B che restano uniti da S-S. Il frammento B riconosce il bersaglio cellulare, mediante la sua parte COOH terminale, sulla superficie della cellula. Si lega alla parte idrofoba della membrana e crea un canale attraverso il quale il frammento A penetra all’interno. Il glutatione (presente all’interno della cellula) libera il frammento



Il glutatione (presente all’interno della cellula) libera il frammento A, enzimaticamente attivo (ADP-ribosilante). Agisce sul NAD staccando ADP-riboso che interagisce con il fattore EF2 bloccando la traslocazione sul ribosoma. Il complesso EF2-ADP potrebbe ancora reagire con il ribosoma e il GTP (che fornisce energia), tuttavia è bloccata l’idrolisi del GTP, non si ha quindi energia e la sintesi proteica è interrotta.

89

Esotossine che inibiscono la sintesi proteica cellulare



90

Esotossine citotossiche per azione sul citoscheletro

Sono tutte tossine binarie, formate cioè da due distinti componenti A e B che sono secreti separatamente e si riuniscono solo alla superficie della cellula bersaglio, possiedono tutte un attività catalitica ADP-ribosiltransferasica ed hanno come specifico bersaglio l’actina.C2 di C. botulinum, fattore citotossico necrotizzante prodotto da molti stipiti di E. coli uropatogeni nell’uomo



C2 di C. botulinum, fattore citotossico necrotizzante prodotto da molti stipiti di E. coli uropatogeni nell’uomo e animali e la tossina dermonecrotica di Bordetella spp.Tossine sono denominate CDT (cytolethal distending toxins) dimostrate in in E.coli, Shigella e Salmonella. induce danni nel DNA che innescano i sistemi di riparo e il blocco del ciclo cellulare Le cellule bersaglio principali sono monociti- macrofagi.

91

TOSSINE NEUROTROPE

Tetanica e del carbonchio attive sulle cellule del SNCBotulinica attiva sulle cellule del sistema periferico

La botulinica blocca la liberazione di acetilcolina nella giunzione neuromuscolare si ha quindi paralisi flacida (meccanismo non noto)



(meccanismo non noto)

La tetanica blocca l’inibitore del riflesso si ha quindi contrazione, diffonde attraverso il midollo spinale e giunge ai centri nervosi, blocca i mediatori (glicina, acido gamma-aminobutirrico, nucleotidi ciclici) si fissa sui recettori gangliosidici della membrana dei motoneuroni a livello presinaptico (paralisi spastica)

92



GABA

93



94



95

Tossina botulinica

Sulla base del valore di LD50 di circa 1 ng/kg, poche centinaia di grammi di questa tossina potrebbero teoricamente uccidere ogni essere umano presente sulla Terra (a scopo comparativo, la



sulla Terra (a scopo comparativo, la stricnina richiederebbe 400 tonnellate per uccidere ogni essere umano). Generalmente le dosi letali orali risultano comprese fra 0,5 e 5 mg/kg di alimento ingerito.



97

Endotossina



Glucosamina fosforilata ed esterificata con acidi grassi saturi

Ripetizione di unità diverse nelle diverse specie

Contribuisce alla tossicità del Lipide A influenzandone l’idrosolubilità e la struttura

98

Endotossina

LPS si lega a proteina di memb. CD14 (recettore) dei macrofagiLe LBP prodotte dal fegato e presenti in circolo si combinano con LPS e catalizzano il suo trasferimento sul macrofago e il legame con



si combinano con LPS e catalizzano il suo trasferimento sul macrofago e il legame con CD14Recettori Tlr presenti sui macrofagi in contatto con LPS legato a CD14, trasducono il segnale di membrana → rilascio citochine

99

Endotossina

In passato si riteneva che LPS agisse direttamente sulle membrane biologiche

Oggi si sa che:



stimola i macrofagi al rilascio di sostanze che sono le reali effettrici dell’attività tossica

Attiva la cascata del complemento

Attiva la cascata della coagulazione

100



101

Effetti dell'endotossina

- febbre (attivazione di IL-l)

- neutropenia: adesivita' delle cellule ai vasi, granulocitosi- ipoglicemia: intensa attività metabolica cellulare glicolisi- ipotensione: vasodilatazione, permeabilità, stagnazione di

liquidi- anormale perfusione di organi essenziali



- anormale perfusione di organi essenziali- attivazione del complemento

- disseminata coagulazione intravascolare- reazioni di Schwartzman (locale e generalizzata)

102

Superantigene

Alcune tossine particolari liberate da alcunipatogeni attivano le cellule T senza richiesta diantigene, si legano al recettore di queste cellule siaa quello del complesso maggiore diistocompatibilità che può scatenare una risposta



istocompatibilità che può scatenare una rispostaimmune nei confronti delle stesse cellule, quindimolto rischioso. Esempi di queste tossine sonoquelle dello shock tossico di S.aureus e quelleeritrogeniche di S.pyogenes.

103

superantigeni

Enterotossine stafilococcicheTSST (Tossina dello Shock Tossico)T. pirogeniche streptococcicheDevono parte della loro tossicità a:



Devono parte della loro tossicità a:Specifica attività enzimatica (es. attivazione interleuchinaSono fortemente pirogene Interagiscono con i LT, attivazione e moltiplicazione in % amplificata (2-20% vs 0.0001-0.01% normale Ag)

104

A. L’antigene convenzionale,internalizzato ed elaboratodalla cellula viene espostonel contesto del MHC II alriconoscimento del TCR conspecifica capacitàcombinatoria



combinatoria

A. Il superantigene legadirettamente, senzaprecedente internaliz. edelaboraz., le proteine delMHC II e il TCR

105

Infiammazione

Si ha in risposta di infezione batterica, ma inparticolare per i virus, si ha un eccesso dirisposta immune in proporzione al processo



risposta immune in proporzione al processoinfettivo. Chlamydia, Borrelia e sifilide, maanche streptococchi (febbre reumatica)

106



107



108

IgA

Le IgA o immunoglobuline secretorie si trovano intutti gli epiteli in contatto con l’esterno. Siformano, attraverso la cattura, da parte dellecellule M (microfold) che sono localizzate neipressi delle placche del Peyer, di corpi estranei,virus, batteri, tossine, ecc. Queste cellule nonhanno attività fagocitaria, presentano quindi



virus, batteri, tossine, ecc. Queste cellule nonhanno attività fagocitaria, presentano quindil’antigene ai macrofagi sottostanti che lodigeriscono e lo presentano alle cellule T cheelaborano le IgA specifiche, in questo modol’organismo ha immunoglobuline per contrastarel’invasione dei microorganismi più frequentementepresenti.

109



110

IgA

La mucosa intestinale secerne Ig, in particolare IgA. Si calcola che ne siano prodotte dai 40 ai 60 mg al giorno per ogni kg di peso corporeo. Nelle placche del Peyer vengono prodotte anche IgM. Le IgA sono considerate l’elemento primario per



111

Le IgA sono considerate l’elemento primario per la risposta immunitaria verso gli antigeni microbici. Le IgG fanno parte della risposta immunitaria innata della mucosa.

INTERAZIONI TRA BATTERI Infezioni polimicrobiche

Possono essere più gravi di quelle

causate da un singolo patogeno

quando le interazioni tra le singole



specie

trasformano un’infezione mista in

una

INFEZIONE SINERGICA

112

INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico

E’ un fenomeno comune e

importante nella produzione di

infezioni miste di



infezioni miste di

aerobi ed anaerobi

specie in tessuti a lento ricambio o

drenaggio o dove l’eliminazione

dei patogeni è rallentato

113


E’ un fenomeno ben documentato

nelle infezioni sperimentali

intraddominali



intraddominali

tessuti molli

setticemie

dentali

ginecologiche

114


E’ un fenomeno ben documentato

nelle infezioni sperimentali

Da peritoniti sono stati isolati i vari



Da peritoniti sono stati isolati i vari

microorganismi in coltura pura:

Rinoculati in animali

Singola specie: innocua

Coltura mista: palese infezione

115

INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico (ipotesi)

Favorevoli modifiche dell’ambiente

Provvedere a nutrienti essenziali

Provvedere a fattori di virulenza




Modulare la risposta immunitaria

Protezione reciproca nei confronti degli agenti antibatterici

116

INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico

Favorevoli modifiche all’ambiente

Il consumo di O2 da parte dei batteri aerobi nella popolazione mista produce condizioni favorevoli alla proliferazione degli anaerobi, i quali a loro volta proteggono i batteri



i quali a loro volta proteggono i batteri aerobi dalla fagocitosi

Il basso pH dovuto al metabolismo di molti aerobi e acidogeni crea situazioni favorevoli per lo sviluppo di anaerobi e acidofili

117



Molte specie aerobie che producono capsula

(E.coli, K.pneumoniae, S.pneumoniae)

raramente producono ascessi se



raramente producono ascessi se

agiscono come unico patogeno

mentre il Bacteroides fragilis (anaerobio)

produce una capsula che è in grado di

promuovere la formazione di ascessi

118



ASCESSO: UN AMBIENTE PROTETTO

La formazione sinergistica di un ascesso provvede:

una barriera alla diffusione degli agenti antibatterici

una barriera ai fattori dell’immunità dell’ospite



una barriera ai fattori dell’immunità dell’ospite

allo sviluppo di più specie batteriche che:

>elaborano enzimi inattivanti gli antibiotici (β-lattamasi, cinasi anti aminoglicosidi ecc.)

>causano strette condizioni di anaerobiosi che compromettono l’attività di di aminoglicosidi e chinoloni così come la fagocitosi

119


Provvedere a nutrienti essenziali(commensalismo)

Veillonelle e difteroidi sintetizzano vit. K (naftaquinone) che è richiesto da B.melaninogenicus per crescere e per esprimere la virulenza

S.mutans produce PAB utilizzato da S.sanguis



S.mutans produce PAB utilizzato da S.sanguis

I treponemi fanno uso di acidi grassi (butirrico e succinico) liberato da anaerobi (fusobatteri, batteroidi)

Le Veillonelle metabolizzano ac. lattico liberato dalla popolazione microbica normale (PMN)

Molti batteri della cavità orale usano ac. lattico liberato dagli altri commensali

120



Fusobacterium necrophorum elabora una

leucocidina che protegge

Corynebacterium pyogenes dall’attività

battericida dei leucociti. (C. pyogenes produce un



battericida dei leucociti. (C. pyogenes produce un

fattore di crescita per F. necrophorum)

S. aureus produce ialuronidasi che esalta

l’attività necrotica degli streptococchi

anaerobi e conduce alla distruzione dei

tessuti

121


Modulazione della risposta immunitaria

Nelle infezioni miste gli anaerobi inibiscono la fagocitosi degli aerobi mediante disturbi o indebolimenti delle attività di:opsonizzazionechemiotassi dei neutrofiliproduzione di ossigeno



produzione di ossigenobatteriocidiaAttraverso il meccanismo di:diminuzione delle opsonine del sieroproduzione di acidi grassi volatili (butirrico e succinico) tossici per la fagocitosiproduzione di leucocidine

122


Protezione reciproca nei confronti degli agenti antimicrobici

B. fragilis e altre specie anaerobie producono β-lattamasi

Nelle infezioni miste questi enzimi proteggono le specie sensibili ai β-lattamici inattivando questi



specie sensibili ai β-lattamici inattivando questi antibiotici (patogenicità indiretta)

B. fragilis e vari Clostridi possono aminofenilare il cloramfenicolo rendendolo inefficace sulla restante popolazione batterica mista

123


Strategie terapeutiche

L’eliminazione selettiva di un componente della popolazione mista fa fallire il sinergismo batterico

Farmaci a spettro ristretto



Farmaci a spettro ristretto

Eliminazione di tutti i patogeni in causa

Antibiotici ad ampio spettro

usualmente β-lattamici

in caso di allergie: macrolidi o altri agenti

124

Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite

Capsula: per mascherare le cellule opsonizzate ostacola lafagocitosi (S.pneumoniae, K.pneumoniae, H.influenzae)Coagulasi: il germe si annida nel coagulo per proteggersidalle difese in generale S.aureusFibrinasi, jaluronidasi, collagenasi: distruggerel’integrità dei tessuti con penetrazione all’interno (molti



l’integrità dei tessuti con penetrazione all’interno (moltiopportunisti)Compromettere la funzionalità dei fagociti e dellecellule ciliate: BordetelleProduzione di enzimi citotossici: S.aureus,S.pyogenes, Pseudomonas spp.A livello di fagocitosi: blocco dei processi ossidativi(Salmonella, Legionella) impedire la fusione tra fagosoma elisozima (Gonococchi, Micobatteri)

125


Cattura del ferro (siderofori) in competizione con lattoferrina

Sfuggire alla risposta immunitaria: liberare la capsula(pneumococchi)

Variazioni di antigenicità (Borrelia e gonococchi) E.coli KI nella



Variazioni di antigenicità (Borrelia e gonococchi) E.coli KI nellameningite infantile

Cattura di materiale dell’ospite e distribuirlo sulla superficieesterna per confondere la risposta immunitaria (Treponema pallidum)

Liberare la proteina A che si lega alla porzione Fc delle Ig cheprovoca l’inversione dell’anticorpo (S.aureus)

126


Fase aerobia (aerobi, >>>ATP)

Fase anaerobia (aerobi, <<<ATP)

Fase planctonica



Fase sessile

Ridotta tossicità di LPS P.aeruginosa, Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Morte cellulare programmata (PCD)

128


Biofilm: Ig, macrofagi, antibiotici, replicazione lentaFase intracellulare, per sfuggire ai macrofagi, Ig e a molti antibiotici, tasso di crescita



e a molti antibiotici, tasso di crescitaInduzione di forme filamentoseQuorum sensing, attivazione di alcune funzioni cellulari mediate da ferormoni (in funzione del numero)Attivazione di uno stato vitale ma non coltivabile

129

S. pneumoniae

S. pneumoniae is known for its ability to enter into a state ofgenetic competence under conditions of high celldensity in response to a secreted signaling peptide (QS).Only a fraction of the S. pneumoniae cells becomecompetent in response to the peptide autoinducer andelaborate a bacteriocin that causes the lysis of



130

elaborate a bacteriocin that causes the lysis ofnoncompetent cells.

The lysed cells release not only transforming DNA andnutrients but also pneumolysin and other factorsimportant for virulence.

S. pneumoniae sacrifices some its relatives for this purpose which facilitates invasion of its host.

Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza

La vita dei microorganismi èprevalentemente sessile e solo unafrazione minima (<0,1 %) mantiene



frazione minima (<0,1 %) mantieneuno stato planctonico

131


La semplice adesione ad una superficie,attiva nel microorganismol’espressione di molti geni checodificano sia per tutti i prodotti



codificano sia per tutti i prodottideputati alla vita sessile sia quelli chesono coinvolti nei meccanismi dipatogenicità e virulenza

132


Una volta che i batteri sono adesi, essi siorganizzano in microcolonie. Questofenomeno implica la presenza di unbiofilm, ove i microorganismi sono



biofilm, ove i microorganismi sonoimmersi, costituito da polisaccaridi eprodotti metabolici che, come già detto,mediano adesività tra i microorganismi egli epiteli e tra i batteri stessi.

133

Biofilm : una resistenza fenotipica

http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm

Dunne WM Jr . Clin Microbiol Rev 2002;15:155-166 134

Fasi del biofilmBiofilm : una strategia batterica


rilascioorganizzazioneadesioneSalvatorelli G. et al.Biofilms: stato dell’arte l’INTERNISTA, 10 (4), 2002Dunne WM Jr . Clin Microbiol Rev 2002;15:155-166 135

Biofilm : i riflessi negativi !..

• Protezione vs anticorpi• Ridotta attività PMN

nessuna fagocitosi • Rilascio di enzimi

inattivanti gli ATB• Rilascio di enzimi

inattivanti gli ATB

Solo gli elementi planctonici sono distrutti :• normali processi di difesa

• antibioticiLewis K et al : Antimicrob Agents Chemother 2001;45:999-1007136


Il biofilm rappresenta un nido di microorganismi anche quando tutte le forme planctoniche sono state uccise.



forme planctoniche sono state uccise. Questo spiega perché i cateteri colonizzati sono sorgenti di gravi infezioni con scarse possibilità di successo terapeutico.

137

Impianto su superfici mucoseImpianto su superfici mucose

Center for Disease Control and PreventionCenter for Disease Control and Prevention

stima chestima chela formazione di biofilmla formazione di biofilm

Biofilm in patologia umana


Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nature Rev. Drug Discov. 2: 114-122, 2003

Potera C. Forging a link between biofilms and disease.Science 283: 1837-1939, 1999

la formazione di biofilmla formazione di biofilmsia implicata almeno nel sia implicata almeno nel 6565--80%80%

di tutte le infezionidi tutte le infezionicroniche e/o recidivanti.croniche e/o recidivanti.

138

Biofilm batterici e Infezioni recidivanti

• Endocarditi: valvole naturali o artificiali • Quadri legati a inserzione di cateteri, protesi, lenti,tubi endotracheali• Otiti,sinusiti


• Otiti,sinusiti • Prostatiti, uretriti ,cistiti • infezioni vie biliari•Fibrosi cistica

Riacutizzazioni di BPCO

Costerton JW e al :Science 1999;284 :1318-22139

“ Biofilm “ su superfici inerti

140

• Prevenire la formazione di biofilm

• Disgregare biofilm, già esistenti

Attacco al Biofilm


Sethi et al. N Engl J Med 2002; 347: 465-471

• Disgregare biofilm, già esistenti

• Eradicare i microrganismi negli strati più profondi del biofilm

141

La strategia terapeutica deve tener conto che gli antibiotici attualmente in uso

sono stati sviluppati e studiati

Attacco al Biofilm


Creson M. Focus: Bacterial Cities TimesDispatch.com 13 Gennaio 2003

sono stati sviluppati e studiati per agire contro batteri planctonici

e non organizzati in biofilm

142

Attacco al Biofilm

Eradicare le cellule planctoniche ! responsabili dell’episodio acuto,

per ritardare :


per ritardare : colonizzazione,

potenziale produzione di biofilmrecidivare dell’infezione

Kobayashi H. Int J Antimicrob Agents 2001 ; 17:351-56 143


Nel loro insieme queste osservazioniindicano che la fase planctonica è quellache favorisce la disseminazione della vita



che favorisce la disseminazione della vitamicrobica, mentre la fase sessileall’interno del biofilm è favorevole allasopravvivenza.

144


Lo sviluppo del biofilm è condizionato dalla presenza nell’ambiente di un fattore prodotto dagli stessi microorganismi autoinducente che a sua volta dipende dal



autoinducente che a sua volta dipende dal numero dei batteri, il fenomeno è noto come quorum sensing

145

Quorum Sensing



146

Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri

Quorum sensing

E’ stato identificato nel 1970 su un batterio luminescente il Vibrio fischeri che colonizza un cefalopodo. Il microorganismo è presente in mare ad una concentrazione di circa 100



in mare ad una concentrazione di circa 100 cell/ml. Mentre sull’organo luminoso del pesce raggiunge 1010 cell/ml e diviene luminescente.

147

Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri

Quorum sensing

I batteri elaborano un prodotto specie specifico (omoserinalattone) diffusibile nell’ambiente ove permane e si accumula.

Quando la concentrazione raggiunge un limite



Quando la concentrazione raggiunge un limite condizionato dal numero dei batteri presenti si ha induzione del gene bersaglio.

148

Quorum sensing

Il sistema detto luxI~luxR è stato identificato in molte specie ed è tutto da valorizzare.

E’ un sistema molto economico per rivelare la



E’ un sistema molto economico per rivelare la propria presenza solo quando il numero è sufficientemente alto per avere tutti i vantaggi (nutrimenti, trasferimento di geni, fattori di patogenicità e virulenza, ecc.)

149

Quorum sensingApplicazioni

E’ stato dimostrato che se in P.aeruginosa si inattiva il gene las il microorganismo perde i suoi caratteri di patogenicità.



Si possono rendere innocui i patogeni eliminando il loro sistema quorum sensing?

150

Quorum sensingApplicazioni

Trovare composti che funzionano come gli autoinduttori ma bloccano il gene

Furanone è stato trovato in un’alga



Furanone è stato trovato in un’alga

ha dimostrato di interferire con il quorum sensing di Serratia liquefaciens.

151



152I Gram-positivi causano effetti simili ma usano mediatori diversi

La scoperta dei sistemi quorum sensing neibatteri gram-negativi ha non soloapprofondito le nostre conoscenze sullapatogenesi delle infezioni causate da questi



patogenesi delle infezioni causate da questiorganismi ma potrebbe anche provvedere aimezzi per il trattamento di queste comuni edimportanti infezioni

Hartman and Wise 2001

153

E’ noto che in natura i batteri si presentano con caratterist ichemolto diverse da quelle che mostrano in coltura in laborator io

L’ambiente naturale può essere sfavorevole alla crescita e allasopravvivenza di molti batteri, specialmente di quelli adattati asopravvivenza di molti batteri, specialmente di quelli adattati amoltiplicarsi nell’uomo o negli animaliQuesti microorganismi hanno sviluppato risposte sofistic atealle variazioni ambientali

154

Quando le condizioni ambientali non sono idonee all a crescita, i batteri entrano in una fase programmata di

sviluppo che risulta in uno stato metabolico meno attivo e rende il batterio più resistente.

•Aumento della resistenza agli agenti antimicrobici

•Cambiamenti nell’idrofobicità di superficie e nelle capacità adesivecapacità adesive

•Cambiamenti a carico degli acidi grassi di membrana , degli aa della parete

•Cambiamento di forma

•Topologia del cromosoma

155

I BATTERI SI ADATTANO ALLE VARIAZIONI AMBIENTALI MEDIANTE

•Induzione della sintesi di sistemi di cattura dei nutrienti presenti in concentrazioni ridotte

•Modificazione della sintesi di alcuni enzimi allo s copo di utilizzare efficientemente i nutrienti presenti in

concentrazioni ridotte

•Modulazione del tasso di incorporazione dei nutrien ti •Modulazione del tasso di incorporazione dei nutrien ti presenti in eccesso

•Riorganizzazione di alcune vie metaboliche allo scopo di evitare possibili blocchi

Coordinamento dei tassi di sintesi per mantenere la crescita bilanciata

157

VBNCviable but non culturable

(Xu et al. 1982)

I batteri in stato VBNC sono metabolicamente attivi ma non sono in

grado di attuare i processi divisionali che grado di attuare i processi divisionali che portano alla formazione di colonia sui

terreni di coltura normalmente utilizzati per il loro rilevamento

158

FATTORI CHE INFLUENZANO

L’ATTIVAZIONE DELLO STATO

VBNC

Scarsità di nutrienti

Temperatura

LuceLuce

Salinità

Pressione idrostatica

Ossigeno

159

ELENCO DI ALCUNI BATTERI CHE

POSSONO ATTIVARE LO STATO

VBNC

Aeromonas

Agrobacterium

Alcaligenes

Pseudomonas

Rhizobium

Salmonella

Enterococcus

Escherichia

Helicobacter

Campylobacter

Enterobacter

Shigella

Vibrio

Yersinia

Klebsiella

Legionella

Micrococcus

160

SAGGI UTILIZZATI PER LA DIMOSTRAZIONE DELLA VITALITA’ BATTERICA

•Conta Vitale Diretta (DVC)

•Immunofluorescenza - Conta Vitale Diretta (DFA -DVC) •Ricerca di RNA Vitale Diretta (DFA -DVC)

•Colorazione con cloruro di tetrazolio (CTC)

•Colorazione con “Live/Dead bacLight Viability kit”

•Ricerca di RNA messaggero (RT-PCR)

•Ricerca di antigeni specifici dello stato VBNC

161

Le cellule non coltivabili (VBNC, stressate) possono rappresentare un problema

per la salute pubblica se per la salute pubblica se non rilevate con saggi

adeguati

162

Filamentation of bacteria in response to environmental cues.

a | Innate immune cues. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) reside intracellularly within bladderepithelial cells. A small number of intracellular bacteria respond to the activation of host immuneeffectors by filamentation. Epithelial-cell death accompanies bacterial growth, thereby resulting in theexposure of filamentous and bacillary organisms on the surface. The filamentous form is resistant toneutrophil phagocytosis. The recovery from filamentation results in the invasion of naive epithelial cellsto begin the process again.

168


b | Predator sensing cues. Marine bacterial populations are made up of multiple species,including the prototypical Flectobacillus spp. Protist grazing on all species stimulatesfilamentation in Flectobacillus spp. Filamentous forms cannot be grazed by marine protists.Recovery from filamentation results in an alteration in the diversity of bacteria in theenvironment and the depletion of non-Flectobacillus species

169


c | Quorum sensing cues. Proteus mirabilis grows as a bacillary form that can count the number ofsimilar species in the vicinity by quorum sensing. If a quorum of organisms is verified, the bacteriarespond by initiating the differential gene expression that leads to filamentation. Although amechanistic reason for filamentation in Proteus spp. Is under debate, the evidence suggests that thismorphology leads to enhanced invasion of the urothelium, thereby providing protection from thehost immune response. Dissemination into the tissue disperses the swarming filaments. Cell divisionis restored owing to low levels of quorumsensing molecules in the tissue.

170


d | Antimicrobial cues. Filamentation occurs if bacteria are exposed to certain β-lactam antibiotics invitro and in vivo. Filamentation allows for survival until the antibiotic is diluted or becomes inactive.The restoration of cell division occurs once the antibiotic activity is lost. In some cases, for example,Burkholderia pseudomallei, cell-division capacity is maintained even in the presence of antibiotics ofsimilar and dissimilar classes, which indicates that protection has been conferred to daughter cells. The

mechanisms and consequences of this response have not yet been explored.

171

INVASIONE CELLULARE da parte di batteri enteropatogeni

173

Cos‘è un batterio enteropatogeno invasivo?

• I batteri invasivi sono capaci di promuovere il loro ingresso in

cellule che non sono fagociti professionisti.

• I batteri enteroinvasivi raggiungono il lume intestinale,

aderiscono alle cellule dell’ospite e superano la b arriera naturale,

estremamente impermeabile, rappresentata dalle cell ule epiteliali

Esempi :

Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuberculosis

Shigella spp.

Salmonella spp.

Listeria monocytogenes174

Barriere all‘infezione batterica nel tratto gastro-i ntestinale

175

La barriera dell‘epitelio intestinale

176

Cellule M: il punto debole, il tallone d‘Achille

Le placche del Peyer (formate da un centro germinativo di lin fociti B circondato dalinfociti T) si trovano nella sottomucosa dell’intestino t enue. L’epitelio sovrastante leplacche presenta cellule M, cellule epiteliali specializzate nel consentire il passa ggiodi particelle nel tessuto linfoide sottostante.La superficie basolaterale invaginata forma una superfici e dove migrano linfociti emacrofagi. Molecole e particelle vangono trasportate nell a tasca.

177

Fattori che determinano se il batterio sarà internalizzato o no:

• Natura del recettore sulla cellula ospite

• Forza dell’interazione

• Capacità del batterio di inviare segnali che • Capacità del batterio di inviare segnali che stimolano o antagonizzano l’internalizzazione

178

STUDI IN VITRO E IN VIVO

Colture cellulari

Diverse linee cellulari sono state usate per studiare l’inv asionebatterica: sistema eccellente, riproducibile e non compli cato, macon diverse limitazioni

Modelli animali

Dopo che i dettagli molecolari sono stati determinati in vit ro,possono essere poi verificati in modelli animali

179

Meccanismi di invasione cellulare

TriggerZipper

Yersinia, Listeria Salmonella, Shigella

180

Ingresso di Listeria monocytogenes in fagociti non professionisti in vitro

Sono coinvolte almeno due proteine di superficie: • Internalina (InlA): proteina di superficie che è an corata covalentemente alla parete

• InlB: proteina di superficie legata debolmente alla parete

181

in vivo

• I topi non sviluppano una malattia letale dopo infezione per os conListeria: scarsa traslocazione dei batteri attraverso l’intestino•Risultati simili con Listeria wt o mutanti inlA

• Cellule che esprimono E-cadherin di topo, al contra rio di cellule che esprimono E-cadherina umana, non permettono ingress o di Listeria via inlA

Listeria wt causa una malattia sistemica in topitransgenici che esprimono caderina E umana neglienterociti, mentre mutanti InlA sono incapaci diattraversare la barriera intestinale efficientemente

•la specie specificità è dovuta a differenze in un si ngolo aa

182

Model of invasion of the intestinal epithelium by Listeria

183

Motilità dipendente dalla polimerizzazione

di actina• Polimerizzazione dell’actina con

formazione di code• Si muove nel citoplasma• Invade le cellule adiacenti• Invade le cellule adiacenti• ActA: proteina di 90 kDa,

determina il reclutamento e l’assemblaggio dei filamenti Localizzata ad una estremità del batterio

Velocità: 1um/sec

185

• I batteri a contatto con la membrana plasmatica continuano a muoversi• Producono protusioni che si estendono nella

cellula adiacente: listeriopodi• Si forma una vescicola con due membrane e la

cellula si libera nel citoplasma

Ingresso nella cellula adiacente e fuoriuscita dal vacuolo secondario

Per la fuoriuscita dai vacuoli:

• Listeriolisina• PC- PLC: proteina extracellulare 28 kDa fosfolipasi

a largo spettro, idrolizza la fosfatidil colina (PC)• Metallo proteasi: trasforma il precursore di PC-

PLC (33 kDa) in forma attiva (28 kDa)• Le due fosfolipasi determinano la lisi di entrambe le

membrane cellulari. Non è noto se svolgano ruoli diversi nei due compartimenti che formano il vacuolo Pseudopodi: 40 um

Per la fuoriuscita dai vacuoli:

186

plcBhlyA

actA

hlyA plcA

inlA/B

actA

inlA: internalina; hly: listeriolisina; plcA: PI- PLC (una fosfolipasi);

actA: polimerizzazione actina; plcB: PC- PLC (una fosfolipasi) 187

The invasive phenotype of Shigella is dependent on a type III secretion system encoded by a 30 kb region of a 200 kb virule nce plasmid

VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB inducendo l’espressione della proteina virB, anch’essa plasmidicaVirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa.

Ipa B e C, si integrano nella membrana dell’ospite e promuovono la formazione degli pseudopodi

IpaA iniettata nel citoplasma dell’ospite favorisce la depolimerizzazione dell’actina accumulata intorno al sito d’ingresso del batterio. Le proteine IpaA servono anche per la lisi del vacuolo

IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta

mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genesspa surface presentation of invasion plasmid antigensspa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di traslocazione inattivo Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula

IcsA ( VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica.

189

IPa (Invasion-Plasmid-Antigens)-ABCD

Ipa B e C, si integrano nella membrana

dell’ospite e promuovono la formazione degli

pseudopodi

FATTORI DI VIRULENZA plasmidici

IpaA iniettata nel citoplasma dell’ospite

favorisce la depolimerizzazione

IpaA (30 kDa) IpaB (62 kDa), IpaC (42 kDa), e

IpaD (35 kDa) in condizioni non secretorie sono accumulate nel

citoplasma legate ad una proteina di 18 kDa

(IpgC) che ne impedisce depolimerizzazione

dell’actina accumulata intorno al sito d’ingresso del

batterio. Le proteine IpaA

servono anche per la lisi del vacuolo

impedisce l’aggregazione e la

digestione

VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB inducendo l’espressione della proteina virB, anch’essa plasmidicaVirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa.

190

FATTORI DI VIRULENZA

spa surface presentation of invasion plasmid antigens

mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genes.

spa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di traslocazione inattiva Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula

IcsA ( VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula

batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica.

IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta

191

invasion plasmid antigens ipa, surface presentation of invasion plasmid antigens spa, membrane excretion of Ipa mxi, virulence vir genes.

Preinvasion step in the pathogenesis of Shigella spp. Ipa: invasion plasmid antigens; Mxi-Spa: membrane expression of Ipa proteins and surface presentation of antigens

A 37°C, VIRF e VIRB attivano operon spa, mxi e ipa

192

Early steps in the invasion of Shigella spp into M cells. Ipa: invasion plasmid antigen; Spa: surface presentation of antigens

193

Cytoskeletal rearrangements induced during Shigellainvasion of epithelial cells. Shigella secretes the effector proteins, such as IpaB, IpaC, IpaA and VirA, into host cells. IpaB and IpaC are integrated into the host membrane, and IpaC modulates Cdc42-dependent filopodial formation which, in turn, may cause activation of Rac1 and lamellipodial formation. IpaA binds vinculin, and the binds vinculin, and the resulting IpaA−vinculin complex promotes depolymerization of actin filaments, which is thought to be required for modulation of lamellipodial formation. VirA binds / -tubulin heterodimers and induces MT destabilization. VirA-induced MT destabilization would in turn lead to MT growth and stimulation of the Rac1 activity, and thus evoke the local membrane ruffling.

196

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