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Dinamica delle Popolazioni BattericheLaboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia

POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE

Microrganismi acquisiti dalla nascita subiscono modifiche in numero e specie lungo tutto il decorso della vitaDipendono da•fattori genetici•abitudini alimentari e igieniche •situazioni di stress •fenomeni psicosomatici •età




Residenti, o popolazione microbica normalerappresentano circa l’1% del peso corporeo.10 volte il numero totale delle cellule somatiche Intestino: più di 500 (1000) specie diverse di batteri molte delle quali non coltivabili con le metodiche tradizionali Si stima che circa il 60% del materiale fecale sia costituito da batteri.

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Dinamica delle Popolazioni Batteriche

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Popolazione microbica normale

Esistono due gruppi di PMN: residente transito 1) Competizione con nutrienti (interferenza) 2) Competizione con i recettori sulle cellule (tropismo) 3) Produzione di batteriocine 4) Produzione di acidi grassi o altri metaboliti

(anaerobi) 5) Continua stimolazione del sistema immune

(macrofagi) 6) Stimolazione di fattori immuni protettivi (Ig)



PMN

CuteCavità orale e prime vie aereeTratto intestinaleUretraVaginaOcchio




La popolazione microbica dell’apparato gastro-enterico è

stata definita come "un insieme di microrganismi presenti nel lume

intestinale i quali, se convivono in un determinato equilibrio

contribuiscono allo stato di salute dell'ospite"




Nello stomaco vi è un alto grado di acidità e il numero dei

microrganismi non supera le mille unità, mentre nell'ileo la

concentrazione aumenta arrivando nel colon a 1011-1012

batteri per g



PMN intestinale

Duodeno: 103-106/grDigiuno-ileo: 105-108/grCieco-colon trasverso: 108-1010/grSigma-retto: 1011/gr

antibiotici

pHacido

basico




Anche il numero e il tipo di specie di microorganismi

varia con il variare del sito anatomico



PMN intestinale




Portano milioni di geni, un numero di gran lunga superiore ai 20.000 stimati del genoma umano. Una gran varietà di composti che possono essere metabolizzati (è un organo aggiunto, bioreattore)Quando varia, si modifica anche l'assorbimento dei nutrienti Obesi e magri hanno profili batterici radicalmente diversi nei loro intestini




La degradazione nell’intestino crasso, in particolar modo della

lignina e della cellulosa, è incompleta portando a particelle di fibre vegetali che persistono fino all’intestino distale dove

possono esercitare un ruolo che favorisce il processo di eliminazione delle feci




E’ importante il ruolo dei batteri intestinali nella sintesi e nell'utilizzo delle vitamine.B1, B2, B6, B12, PP, H, acido pantotenico e acido folico. La vitamina K viene sintetizzata dall'Eucobacterium lentum che modifica degli steroidi a livello intestinaleI germi intestinali interagiscono con gli acidi biliari.




Gli acidi biliari derivano dal metabolismo del colesterolo nel fegato, coniugati con glicina ed eliminati con la bile.

Il metabolismo degli ormoni steroidei (androgeni, estrogeni e corticosteroidi) avviene nel lume intestinale attraverso varie reazioni chimiche

Gli ormoni steroidei vengono modificati a livello del fegato ed escreti con la bile. Nell'intestino verranno deconiugati e sottoposti alle modificazioni enzimatiche per poi ritornare al fegato attraverso la vena porta.



POPOLAZIONE MICROBICA INTESTINALE

A questo livello vi è una barriera protettiva costituita da uno strato di

muco denso che contiene IgA secretorie, peptidi antimicrobici e anche complessi giunzionali che tengono unite le cellule epiteliali adiacenti in modo da regolare la

permeabilità del tessuto intestinale e impedire che i microrganismi lascino

questa sede




Gli enterociti esprimono recettori PAMP (pathogen-associated molecular pattern), comprese le proteine denominate TLR e NOD. Questi recettori captano la presenza di componenti batterici presenti e conservati in diverse specie microbiche e possono dare inizio ad una cascata pro infiammatoria per la difesa. I batteri possono presentare sulla superficie esterna delle strutture che sono individuate dalle cellule epiteliali e dalle cellule del sistema immunitario



The commensal microbiota, intestinal epithelial cells, and intestinal immune cells engage in a complex crosstalk. Epithelial cells, M cells, and dendritic cells (DCs) can directly sense and sample the intestinal contents and communicate information about the microbiota to other subsets of immune cells. Toll-like receptors, expressed by epithelial cells, M cells and DCs, and NOD-like receptors, are classes of microbe-sensing molecules. Cytokines, chemokines, and host and microbial metabolites are key molecular mediators of intestinal homeostasis that influence responses of both host and microbe. l



PMNCommensali e Patogeni

Regolazione dell'espressione di TLR

Localizzazione

Fattori attenuanti



PROBIOTICI

Vi sono specie batteriche che aiutano questa barriera a mantenere la propria integrità, a stimolare il sistema immune e a creare un ambiente che limita la proliferazione di specie batteriche patogene, questi microorganismi noti come probiotici sono da tempo ritenuti di grande utilità per tutto l’apparato gastroenterico e non solo, anche se non sono ancora del tutto noti i diversi aspetti della loro benefica attività.



PROBIOTICI

Il termine probiotico, (dal Greco”pro bios”, a favore della vita) venne coniato da Fuller nel 1989 come “un microrganismo vivente che esercita un effetto positivo sulla salute dell'ospite con il risultato di rafforzare l'ecosistema intestinale”. I probiotici sono esseri vitali, microrganismi non patogeni (batteri o lieviti) che devono raggiungere l’intestino vivi in quantità sufficiente a conferire un effetto benefico all’organismo ospite.



PROBIOTICI

I prebiotici sono componenti del cibo non digeribili che promuovono la crescita o l’attività di batteri enterici benefici, perciò portando beneficio all’ospite. I simbionti sono combinazioni di probiotici e prebiotici designati a promuovere la sopravvivenza dei microrganismi ingeriti e la colonizzazione da parte di questi del tratto intestinale.



PROBIOTICI

Batteri usati come probiotici comprendono: Lactobacillus species, Bifidobacterium species, E. coli, Enterococcus e Streptococcus species. Molti microorganismi impiegati come probiotici sono d'origine umana, e sono considerati sicuri per questo utilizzo mentre l’unico lievito usato come probiotico è il Saccharomyces boulardii.



PROBIOTICI

Germi ingeriti vivi Questi microorganismi dovendo attraversare ambienti come lo stomaco a valori di pH estremamente bassi attivano un stato di morte apparente o vitale ma non coltivabile (VBNC) per cui un esame microbiologico condotto con le procedure standard potrebbe dare risultati negativi.



PROBIOTICI

Vi sono dati, ottenuti mediante tecniche di biologia molecolare, che dimostrano la presenza di funzioni enzimatiche attribuibili a questi germi a testimonianza di una certa attività biologica, anche se in forma ridotta, di questi batteri.



PROBIOTICI

Colonizzare o transitareI germi in transito sono in grado di stimolare molte funzioni che aiutano le difese dell’ospite contro gli agenti patogeni o comunque nocivi per la salute.Il probiotico può portare effetti benefici anche se costituito da batteri uccisi ma somministrati come quelli vivi



PROBIOTICIALTRI PRODOTTI ANTIMICROBICI

•Perossido d’idrogeno•Acido lattico•Biosufactanti•Molecole coaggreganti•Inibitori adesione•Molecole lipofiliche ad ampio spettro antibatterico non ben caratterizzate



PROBIOTICI

I probiotici attraverso il metabolismo dei vari substrati presenti incluso i prebiotici son in grado di produrre degli acidi grassi a catena corta, (Short-chain fatty acids, SCFA) che si ritrovano nei campioni di feci umane ad una concentrazione che può superare 100 mmol/LI tre principali acidi grassi a catena corta sono: acetato, proprionato e butirrato.



SCFAButirato

Induce differenziazione cellulare e inibisce la crescita delle cellule tumorali

I colonciti usano il butirato come fonte di energia e in assenza vanno in apoptosi

InfiammazioneStress ossidativoBarriera intestinaleMucinaGiunzioni cellulari (TJ)



PROBIOTICI

Nell'apparato gastro-enterico, così come in molti epiteli degli organi interni del corpo sono localizzate delle cellule, dette a calice (goblet cells), deputate alla produzione di muco, che, con uno spessore non superiore al mm, ricopre e protegge tutti gli epiteli. Il muco è costituito da mucina, le mucine sono glicoproteine, che formano un gel protettivo, fornendo una zona di separazione tra i batteri e la superficie delle cellule epiteliali



PROBIOTICI

Questo strato svolge una funzione di protezione nei confronti di molecole potenzialmente dannose o altri antigeni, mentre esercita una funzione lubrificante specie in sede intestinale. Il muco è la prima barriera che i batteri intestinali incontrano e che i patogeni devono attraversare se vogliono raggiungere le cellule epiteliali. I batteri possono anche modificare la superficie glicosilata dell'epitelio intestinale mediante la modulazione dell’espressione della mucina.



PROBIOTICI

Pertanto per accedere agli strati più profondi del tessuto un patogeno deve degradare il muco, alcuni esempi riguardano Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Entamoeba histolytica che producono proteasi e glicosilasi o Helicobacter pylori che è in grado di rompere i legami di solfuro di questa glicoproteina enzimi che facilitano la disgregazione della mucina.



PROBIOTICI

Cellule epiteliali intestinali sono in grado di produrre peptidi con attività antimicrobica denominate defensine e catelicidine. Le catelicidine, peptidi cationici ad alfa elica, sono prodotte in modo continuo dalle cellule dell’epitelio intestinale e sono coinvolte nella difesa contro i patogeni. Lo stimolo infiammatorio che sembra indurre l’espressione delle catelicidine è il butirrato, prodotto dalla popolazione enterica residente. Le defensine sono classificate come alfa e beta defensine



PROBIOTICI

Le alfa defensine vengono espresse principalmente dalle cellule di Paneth mentre le beta defensine dalle cellule epiteliali di tutto l’intestino. Una diminuita produzione di defensine è associata con la malattia del colon irritabile (Irritable Bowel Syndrome, IBS) e con un’aumentata sensibilità nei confronti delle infezioni batteriche

Molecole lipofiliche, la cui natura è ancora da definire, che presentano un ampio spettro antibatterico.



PROBIOTICI

I probiotici possono contribuire alla funzione della barriera intestinale competendo per i siti di legame con i patogeni. Ad esempio Escherichia coli Nissle (EcN) produce un componente non battericida che compete con il recettore sulle cellule dell’ospite inibendo così l’adesione dei patogeni. L’inibizione dell’adesione batterica di patogeni è un altro dei meccanismi attraverso cui i probiotici prevengono le infezioni intestinali.



PROBIOTICI

La mucosa intestinale secerne Ig, in particolare IgA. Si calcola che ne siano prodotte dai 40 ai 60 mg al giorno per ogni kg di peso corporeo. Nelle placche del Peyer vengono prodotte anche IgM. Le IgA sono considerate l’elemento primario per la risposta immunitaria verso gli antigeni microbici. Le IgG fanno parte della risposta immunitaria innata della mucosa.



PROBIOTICI

Le IgA secretorie proteggono l’epitelio intestinale contro la colonizzazione e/o l’invasione che si attua attraverso il legame degli antigeni di patogeni o commensali, le IgA ricoprono il germe come uno scudo idrofilico che è repellente per l’epitelio intestinale, quindi è tenuto lontano dalle cellule dell’intestino



PROBIOTICI

Il trattamento con probiotici e prebiotici induce un aumento delle cellule che producono IgA e quindi IgA ma non dirette nei confronti del germe che ha attivato questo stimolo



PROBIOTICI

Citochine L. rhamnosus riduce la produzione di citochine infiammatorie. I batteri probiotici possono modulare la risposta immune innata sia in direzione anti-infiammatoria (IL-10) che pro-infiammatoria (IL-8)



PROBIOTICI

L’adesione delle cellule epiteliali tra loro è realizzato in modo da non permette il transito dei batteri ed è mediato da proteine definite occludine e claudine che mantengono le cellule perfettamente aderenti le une alle altre formando una barriera molto difficile da superare. Naturalmente il sistema di regolazione di queste giunzioni (TJ) è molto delicato e dipende da enzimi chiamati fosfatasi che intervengono sulle catene di miosina leggere che funzionano come elastici capaci di allentarsi o contrasi sulla base delle necessità.



PROBIOTICI

La produzione di occludina e di fosfatasi da parte di diverse specie di prebiotici viene aumentata. I ceppi probiotici prevengono la distruzione del citoscheletro e delle proteine delle giunzioni strette nelle cellule epiteliali causate dai patogeni, migliorando la funzione della barriera mucosale e prevenendo il fallimento della secrezione di elettroliti



PROBIOTICI

Inoltre L. acidophilus è stato scoperto inibire il danno alle proteine delle giunzioni strette e nell’insieme, le cellule di diversi probiotici con i loro mezzi di crescita sono stati identificati come capaci di aumentare la resistenza transepiteliale delle cellule monostrato indotta da patogeni e capaci di indurre l’espressione del gene della mucina.



PROBIOTICI

Ci sono meno dati disponibili riguardo al trattamento della diarrea causata da batteri patogeni, ma i risultati di studi su interventi umani, indicano che alcuni probiotici potrebbero ridurre la ricorrenza della diarrea cronica causata, per esempio, da Clostridium difficileUn’ altra ben documentata caratteristica dei probiotici è quella di bilanciare le funzioni gastro-intestinali durante il trattamento antibiotico sia per quanto riguarda i bambini che gli adulti.



PROBIOTICI

Lo stomaco può essere colonizzato dal batterio patogeno Helicobacter pylori, che è l’agente maggiormente responsabile di gastrite e ulcera gastrica e potrebbe aumentare il rischio di cancro allo stomaco. La colonizzazione e la attività di H. pylori può essere soppressa dalla regolare assunzione di prodotti caseari con batteri probiotici. I probiotici non eradicano il patogeno, ma sopprimono la sua crescita e riducono significativamente l’infiammazione nello stomaco



PROBIOTICI

Nel trattamento dietetico, l’eliminazione dell’antigene dalla dieta è stato in passato l’unico mezzo di cura per le allergie alimentari. Vi è una crescente prova che l’aggiunta di probiotici alla dieta di eliminazione può rendere più veloce la risoluzione dei sintomi e dell’infiammazione intestinale nei bambini I probiotici possono ridurre i sintomi dell’allergia oltre che delle dermatiti atopiche e dell’infiammazione intestinale



PROBIOTICI

La composizione della popolazione microbica intestinale durante coliti ulcerative attive ha mostrato la mancanza di quantità di lactobacilli rispetto al numero di lactobacilli in fase remissiva La diversità della popolazione è ridotta in modo significativo nei pazienti con IBD e ciò è dovuto alla perdita dei normali batteri anaerobi e quelli appartenenti ai generi Bacteroides, Eubacterium e Lactobacillus



PROBIOTICI

I probiotici possono migliorare la digestione del lattosio ed eliminare i sintomi dell’intolleranza. I meccanismi attraverso i quali questi possono esercitare i loro effetti non sono totalmente ancora chiari, ma potrebbero coinvolgere un modificato pH intestinale, l’espressione della β-galattosidasi, esercitando effetti positivi sulle funzioni intestinali e la flora del colon.



PROBIOTICI

Una possibile spiegazione degli effetti preventivi sullo sviluppo di tumori è data dalla capacità dei lactobacilli di sopprimere la crescita di quelle specie batteriche che convertono i precancerogeni in cancerogeni. Questa attività determina la riduzione della concentrazione di sostanze cancerogene nell’intestino. Inoltre i lactobacilli sequestrano a livello intestinale, composti potenzialmente mutageni, evitando che questi vengano assorbiti



PROBIOTICI

Il preciso meccanismo con il quale questi batteri sono in grado di svolgere un’attività antitumorale non è comunque certo, ma questi batteri potrebbero indurre modifiche nel pH dell’intestino e aumento nella produzione di SCFA



PROBIOTICI

In particolare l’acido butirrico (già visto) è un potente inibitore della crescita e induttore della differenziazione e apoptosi. E’ considerato importante in quanto esercita effetti benefici nella riduzione dei fattori di rischio coinvolti nell’eziologia dello sviluppo del cancro e dell’adenoma al colon



PROBIOTICI

Sono stati condotti diversi esperimenti, sia in vitro che in vivo, per dimostrare l’efficacia della combinazione di probiotici e prebiotici nella sopravvivenza e nell’attività dell’organismo; ad esempio la combinazione di frutto-oligosaccaridi con ceppi di bifidobatteri oppure lattitolo combinato con Lactobacilli E’ stato dimostrato che la combinazione di Bifidobacterium e frutto-oligosaccaridi induce nei ratti un ritardo nello svilluppo del cancro al colon rispetto a quando sono stati somministrati individualmente



PROBIOTICI

È stato osservato che con l’avanzare dell’età il numero dei Bifidobatteri decresce mentre quello specialmente del Clostridium perfringens,ma anche dei lattobacilli, coliformi ed enterococchi aumenta. Diversi studi hanno confrontato la composizione della microflora fecale in gruppi di età diversa. È stato osservato che i livelli dei Bifidobatteri e dei Lattobacilli sono più bassi nei soggetti anziani rispetto agli adulti più giovani



PROBIOTICI

I probiotici, prebiotici e loro combinazioni portano a un cambiamento della composizione e dell’attività dei batteri intestinali Ceppi probiotici selezionati hanno mostrato di influenzare la composizione della microflora batterica intestinale negli anziani portando ad un aumento dei livelli di Bifidobatteri nelle feci.



PROBIOTICI

Un altro comune problema della popolazione anziana è la ridotta funzione intestinale che può essere causata da ridotta attività fisica, ridotto consumo di fibre, di acqua o ridotta mobilità intestinale o, presumibilmente una combinazione di questi fattori. I Probiotici sono in grado di alleviare la costipazione con successo, infatti è stato osservato che la consumazione di una combinazione di probiotici aumentava la defecazione in frequenza da 2.1 a 2.6 movimenti intestinali a settimana



PROBIOTICI

Al fine di discriminare tra patogeni e commensali, e probiotici i TLR sono posizionate all’interno delle cellule o lateralmente sulla parete cellulare o in limitato numero su enterociti non stimolatiQuindi sono individuati ma non attivano reazioni infiammatorie



PROBIOTICI ATTIVITÀ SUI RECETTORI CELLULARI

1) Accessibilità dei probiotici ai TLR in differenti posizioni sulle cellule intestinali

2) Probiotici posso contenere componenti unici diversi dai patogeni che inducono una differente attivazione dei TLR

(Diversità tra LPS dei patogeni e non che induce infiammazione solo con questi ultimi)

3) Probiotici inducono una risposta che può essere sinergica sui TLR che è regolata in modo diverso dai patogeni

effetto regolatorio sul sistema immune



PROBIOTICII COMPONENTI DELL’INVOLUCRO CAMBIANO CON L’AMBIENTE

La struttura esterna dei batteri è molto variabileL’ambiente condiziona la sintesi di componenti di superficieAcidità dello stomaco l’azione detergente di Sali biliariInfluenzano la sintesi del parete (PG, LTA e CPS e proteine esterne multifunzionaliLa disponibilità e il tipo di nutrienti dell’intestino può aver un ruolo fondamentale.(Bacteroides thetaiotaomicron)



PROBIOTICIPER COLONIZZARE DEVO EVADERE IL SISTEMA

IMMUNE

Involucro esterno per minimizzare I recettori dell’ospite (PPR), resistensa alle Ig e defensine alla’attivazione del complemento e fagocitosi (CPS)

CPS proteggono contro le defensine e se poco prodotte aiutano l’adereaza alle cellule intestinali ( L. rhamnosus) GG41) .

In B. thetaiotaomicron, iIgA modulano la sintesi di CPS

I germi residenti sono in grado di modulare il loro involucro continuamente



Conclusioni

Il probiotico viene identificato da tutti i sistemi di difesa dell'ospite, non essendo dotato di

catatteri di patogenicità e virulenza (es. QS) che causano danni alle cellule attiva i tutti i meccanismi di difesa senza esasperarli

(batteri morti)

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