Lezione 3: continuazione su AMINOACIDI E POLIPEPTIDIPer introdurre i polipeptidi e poi le proteine, bisogna dire qualcosa sulle propriet generali di ionizzazione degli amminoacidi.Propriet generali di ionizzazione degli amminoacidi

H H+ H H+ HH3N+ --- C --- COO H3N+ --- C --- COO H3N+ --- C --- COO R pK aC R pKaN R

Ricordatevi che la catena principale degli amminoacidi ha due ionizzazioni possibili: -una del gruppo carbossilico legato al carbonio il gruppo carbossilico legato al carbonio pu ionizzare a carbossilato (RCOO ), con un suo pK acido. Ricordate il pK dellacido acetico? 4.7. Ora, nel caso di un gruppo carbossilico legato al carbonio , succede che leffetto induttivo esercitato dal gruppo amminico cambia drasticamente lacidit del carbossile, tanto vero che la catena principale dellamminoacido ha un pK acido tra 2 e 2.5: questo perch tale carbonio legato al carbonio , che legato ad un gruppo carico positivamente, che quindi attrae su di s tutti gli elettroni, anche attraverso latomo di carbonio del carbonile, e rende pi facile la ionizzazione del protone.-una del gruppo amminico legato al carbonio anche lazoto amminico legato al carbonio ha una sua ionizzazione: lazoto amminico, ibridizzato sp3, con doppietto elettronico, accetta facilmente un protone e diventa uno ione ammonio quaternario (NH4+); questo succede con un pK variabile, ora vedremo, tra 7 e 8.

Naturalmente, poi, alla ionizzazione degli amminoacidi contribuisce la catena laterale; di catene laterali ne abbiamo viste tante. Nellimmagine vediamo un esempio di catena laterale acida.

H pKaC H pKaR H pKaN HH3N+ -- C -- COOH H3N+ -- C -- COO H3N+ -- C COO H3N+ -- C-- COO CH2 2.1 CH2 3.9 CH2 9.8 CH2 COOH COOH COOH COOH

Che amminoacido quello nella figura? Basti pensare che gli amminoacidi acidi sono due: lacido aspartico e lacido glutammico. Lacido aspartico pi corto, ha un solo metilene legato al carbonio , quindi come se fosse un acido acetico legato al carbonio . Si tratta dellacido aspartico. Ovviamente, quindi, anche questo gruppo carbossilico ha una sua ionizzazione. Quello che succede nel caso dellaspartato e del glutammato, che NON sono legati al carbonio e NON risentono delleffetto induttivo, che essi avranno un pK di ionizzazione simile a quello dellacido acetico: tra 4.5 e 5. Quindi, attenzione! Le ionizzazioni del gruppo amminico e carbossilico intorno al carbonio hanno valori unici, diversi, perch risentono delleffetto induttivo; le ionizzazioni delle catene laterali, invece, sono rappresentate dai valori tipici della ionizzazione del gruppo chimico in esame, perch qui non c pi leffetto induttivo.

Quindi vedete: il pK acido del carbossile qui addirittura 2.1; dopodich, la ionizzazione del carbossile situato a livello della catena laterale dellaspartato intorno a 3.9 (insomma, si avvicina a quella dellacido acetico). La ionizzazione del gruppo amminico addirittura 9.8. Vedremo, poi, che nei polipeptidi pi grandi, il pK di ionizzazione del gruppo amminico si abbassa.

Il valore medio del pKa di un gruppo -carbossilico di un amminoacido protonato 2.19. Quindi, questo gruppo acido risulta notevolmente pi forte dellacido acetico (pKa 4,76). Questa maggiore acidit dovuta alleffetto induttivo elettron-attrattore del gruppo adiacente -NH3+. Per lo stesso motivo, anche i gruppi carbossilici in catena laterale dellacido aspartico e dellacido glutammico protonati risultano essere pi forti dellacido acetico. Tuttavia, leffetto induttivo diminuisce con laumentare della distanza del COOH dal gruppo ammonio

Ricapitolando, un amminoacido come lacido aspartico ha 3 ionizzazioni diverse: -una per il gruppo amminico;-una per il gruppo carbossilico;-una per la catena laterale3 ionizzazioni diverse danno origine a 4 composti.Notate che tra tutti i 4 composti dellaspartato non ce n neanche uno che sia neutro: cio, se voi mi scrivete una formula con (NH2-COOH-COOH), non esiste, sbagliata! Tutte le ionizzazioni degli amminoacidi sono concetti importanti per spiegare poi la chimica delle proteine e la catalisi.

Che vuol dire pKa?pKa il log della costante acida di dissociazione;la costante acida di dissociazione si esprime come rapporto tra concentrazione dei prodotti e concentrazione allequilibrio dellacido indissociato:[anione] [protoni][acido indissociato] allequilibrio

Quindi vi deve essere molto chiaro che i pK di ionizzazione del carbossile e dellamminico legati al carbonio sono unici: uno intorno a 2-2.5, laltro tra 8 e 10, perch il carbonio mette in comunicazione questi due gruppi chimici e c un forte effetto induttivo.

ACIDO BASE + H+

Non bisogna imparare a memoria i pK di tutte le catene laterali, per fondamentalmente ce ne sono solo 6 da ricordare: -laspartato ha un pK intorno a 4;-il glutammato un pK che si avvicina ancora di pi a quello dellacido acetico, intorno a 4.4;

ACIDO ASPARTICO/GLUTAMMICO: COOH COO + H+ pKa= 4.0 4.4

quelli importantissimi sono:-listidina: nellistidina c un gruppo imidazolo: limidazolo pu accettare un protone e cederlo; il punto che il pK intorno a 6, quindi il pK pi vicino al valore fisiologico: listidina importante proprio per questa sua propriet di riuscire a trasferire rapidamente protoni, quindi la ionizzazione dellistidina scrivetela correttamente:

CH2 CH2 + H+ pKa= 6.0HN+ NH N NH

lanello imidazolico va fatto come in figura;

-la cisteina pu ionizzare: -SH S + H+ pKa= 8.5Abbiamo visto le differenze tra le ionizzazioni degli alcoli e dei tioli, cio passare da alcol a ione alcossido O , in solvente acquoso quasi impossibile, cio non si riesce neanche a definire un valore di pK. Per fare lo ione alcossido ci vuole soda 2-3molare, cio molto concentrata per tirar via il protone allalcol; quindi, in condizioni fisiologiche, gli alcoli non rilasciano mai protoni (tranne la categoria dei fenoli). Invece i tioli rilasciano facilmente il protone: il pK intorno a 8.5. Ricordate le propriet della catena laterale della cisteina? Non c solo la ionizzazione, ma anche unaltra propriet, ovvero la cisteina pu andare incontro a reazione redox: 2 tioli danno un ponte disolfuro+ 2 protoni + 2 elettroni;

-la tirosina: propriet dei fenoli, quindi possibile ionizzazione, per con un pK intorno a 10; quindi, in condizioni fisiologiche, le tirosine saranno sempre protonate;

OH O + H+ pKa= 10.0 -la lisina molto importante: una carica positiva a pH fisiologico, quindi si presenta come ione ammonio quaternario. Il pK si ionizzazione anche qui intorno a 10. La catena laterale della lisina, quindi, praticamente sempre protonata; -NH3+ NH2 + H+ pKa=10

-larginina: possiede un gruppo guanidinico e ha un pK addirittura intorno a 12, quindi anche larginina, che lamminoacido pi diffuso nel regno animale, un amminoacido con carica positiva. H NH2 H NH N C N C + H+ pKa= 12.0 NH2 NH2+

Che succede quando iniziamo a costruire una catena polipeptidica?Il legame peptidico vede un carbonio carbonilico legato allazoto amminico del carbonio ; si ha formazione di un doppio legame delocalizzato, quindi c impossibilit di rotazione intorno al legame peptidico.

Il legame peptidico un legame abbastanza forte; nel mondo animale, per fare un legame peptidico, serve un ribosoma. Importante ricordare, per, che in alcuni batteri esiste una sintesi peptidica non ribosomiale: questultima molto importante: molti batteri fabbricano antibiotici utilizzando proprio la sintesi peptidica non ribosomiale; quindi esiste nella realt: un metabolismo complesso presente nei batteri e che permette la formazione di peptidi anche senza ribosoma.

Una volta formato il legame peptidico, il peptide risultante avr quindi un suo gruppo amminico, che noi chiamiamo N-terminale, e un gruppo carbossilico, che chiamiamo C-terminale. Quindi, iniziamo a contare il polipeptide a partire dallN-terminale: lamminoacido 1 quello che possiede il gruppo amminico libero; lultimo amminoacido quello che possiede il carbossile libero; quindi, quando andiamo a numerare gli amminoacidi sul polipeptide, il primo avr una carica positiva, quindi si chiamer N-terminale, lultimo avr una carica negativa e sar il C-terminale. H HH3N+ C CO NH C COO + H2O R1 R2

Insomma, quando andiamo a parlare di peptidi o polipeptidi, che quindi diventano polielettroliti quasi sempre (perch vari amminoacidi danno contributi diversi di cariche di ionizzazione), non ha pi molto senso considerare i singoli pK delle singole catene laterali: si utilizza un parametro che si chiama punto isoelettrico. Il punto isoelettrico, in un dipeptide, semplicemente la somma dei pK dei gruppi ionizzabili presenti diviso 2:pI= (pK1 + pK2) / 2

In generale, in un polipeptide, il punto isoelettrico diventa ovviamente una sommatoria pi complessa, per il punto isoelettrico ha anche unaltra definizione, importantissima e da sapere per lesame:il punto isoelettrico quel valore di pH al quale la somma delle cariche positive e negative di un polipeptide uguale a 0.Quindi, il punto isoelettrico ci d una misura dellacidit o della basicit di un polipeptide o di una proteina. Questo molto importante perch, come vedrete anche in biochimica clinica, le proteine del plasma si possono separare in base al loro punto isoelettrico. Ad esempio, quando noi diciamo che lalbumina, la proteina pi abbondante del plasma, ha un punto isoelettrico pari a 4.5, cosa intendiamo?Definizione del punto isoelettrico: quel valore di pH, cio 4.5, al quale la somma delle cariche positive e negative dellalbumina nulla. Quindi, a pH 4.5, lalbumina avr carica netta totale uguale a 0. Lalbumina normalmente si trova nel plasma a pH 7.2; se ha un punto isoelettrico di 4.5, a pH 7.2 come sar carica lalbumina? Sar carica negativamente, quindi sar un polianione. Il punto isoelettrico 4.5 praticamente il pK dellacido acetico, quindi lintera molecola dellalbumina ha un pK generale, che deriva dalla somma di tutte le cariche presenti sulla superficie, che uguale a quello dellacido acetico: ne deriva che lalbumina una proteina acida; acida vuol dire che avr una prevalenza di gruppi acidi sulla superficie, dunque aspartici e glutammici. Le immunoglobuline, invece, hanno punti isoelettrici basici, sono proteine basiche. Quindi, il concetto di punto isoelettrico molto importante per tutta lanalitica chimica, in particolare per la chimica clinica delle proteine, poich fondamentale per separare tra loro le proteine plasmatiche. Siccome possibile ed relativamente facile separare le proteine in base al loro punto isoelettrico, questo concetto di punto isoelettrico va tenuto a mente in maniera molto chiara. Lemoglobina ha un punto isoelettrico uguale a 7.0. Dato che il pH fisiologico pari a 7.2, come sar carica lemoglobina? Lemoglobina praticamente neutra, nel senso che la somma delle cariche positive e negative praticamente nulla, oppure si pu considerare lievemente acida, con un eccesso di 1 carica negativa su 100 amminoacidi.

Cominciamo a schematizzare un peptide (fondamentalmente sarete chiamati a scrivere dipeptidi per lesame: dal dipeptide in su si usa il computer).Dovendo schematizzarlo, voi prima scriverete la sequenza di legami peptidici con la catena laterale, lasciando liberi i carboni , e poi aggiungete le catene laterali: questo il modo migliore per scriverli. Ad esempio, chi questo dipeptide? Come lo identifichiamo? H HH3N+ - C - CO- NH C - COO CH CH2 H3C OH :N NHIl primo amminoacido la treonina, il secondo listidina, quindi questo dipeptide sar THR-HIS, oppure, nel codice a una lettera, sar TH. Ecco, i codici degli amminoacidi piano piano li impareremo. Il codice a una lettera particolarmente utile per fare paragoni tra sequenze di amminoacidi, quindi uno la sequenza genica la traduce in sequenza amminoacidi con il codice a una lettera, e va avanti.Un esempio di un peptide molto semplice: questo un peptide molto semplice, fisiologico, che si chiama bradichinina, ed un mediatore dellinfiammazione. Dov e chi lamminoacido 1?

Arg- Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-ArgQuesto peptide inizia e finisce con unarginina (da riconoscere per il suo gruppo guanidinico); ci sono infatti due gruppi guanidinici. Come fate a dire qual lN- terminale e qual il C-terminale? Per dire quali sono lN-terminale e il C-terminale, dovete trovare nella struttura i carboni N- terminale e C-terminale. Qual il carbonio N- terminale? Sar quello che avr un gruppo amminico libero, non posso sbagliare; quindi, da qui riconosco la catena laterale dellarginina e lamminoacido numero 1 della bradichinina. Lamminoacido numero 2 una prolina, numero 3 una prolina, numero 4 una glicina, numero 5 fenilalanina, poi di nuovo prolina, fenilalanina e cos via, fino a terminare con unarginina. Voi non sarete mai chiamati a scrivere sul foglio la formula di un polipeptide di questo tipo, per sarete chiamati a sapere che quella formula un polipeptide, a capire come si orienta quella molecola, dove sono i legami peptidici, dove sono i carboni , dove sono le catene laterali. Faremo una serie di esempi e quando passeremo alle proteine vi sar ancora pi evidente. Quindi questo un tipico polipeptide. Non ancora una proteina perch per avere una proteina ci vogliono (o almeno, nella vecchia classificazione di volevano) gli elementi di struttura secondaria delle proteine, che in genere i peptidi non hanno. Strutture secondarie e terziarie le facciamo nella prossima lezione per voi gi conoscete gli elementi delle strutture secondarie, che sono le -eliche e i foglietti . Naturalmente, nella classificazione moderna non pi cos ovvia questa distinzione, poich noto che ci sono anche famiglie importanti di proteine che non presentano alcun elemento di struttura secondaria: sono proteine scoperte recentemente, ma proprio nel genoma umano, e quindi sfuggono un po. Allo stesso tempo vengono chiamate proteine perch delle volte hanno anche 1000 amminoacidi.

Quali sono i 3 fondamentali fattori di interazione tra le catene laterali degli amminoacidi che poi determinano la struttura tridimensionale del polipeptide?Le forze che portano alla formazione di un polipeptide, e che quindi tengono insieme le strutture di amminoacidi e proteine, sono 3: 1) Legame a idrogeno: per avere un legame a idrogeno ci vuole un atomo donatore, che possegga un idrogeno legato covalentemente, e un atomo accettore, che possegga un doppietto elettronico. Senza questi elementi, il legame a idrogeno non si fa.

AccettoreDonatore

O

Bastano questi elementi? No: serve un protone che venga messo in comune tra latomo donatore e latomo accettore. Il legame a idrogeno anche un fenomeno quantistico: il protone si posiziona tra i due atomi e questinterazione tra protone e doppietto elettronico genera una forza attrattiva che determina una certa distanza tra donatore e accettore: tale distanza (d) varia tra 2.3 ed addirittura 3, quindi si verificano grosse variazioni di lunghezza, che dipendono da che cosa? Dipendono dalle propriet del legame a idrogeno: il legame a idrogeno lunico che ha delle forti propriet direzionali: lenergia del legame a idrogeno massima quando il protone giace nellasse che congiunge il nucleo del donatore al nucleo dellaccettore; se il protone giace esattamente sullasse, il legame a idrogeno un legame forte e avr una distanza breve di circa 2.3-2.4 . In realt, la distanza di 2.3 nel mondo biologico non si vede; per intenderci, per, lacido fluoridrico (HF) costituito da un legame a idrogeno con una distanza di 2.3 tra idrogeno e fluoro. Nel mondo biologico, un legame con distanza di 2.4-2.5 gi un legame molto forte. Se lidrogeno, per, fuori asse, il legame a idrogeno diventa pi debole; se lidrogeno arriva a 90, il legame a idrogeno non si forma pi. Quindi, una propriet importante del legame a idrogeno che ha propriet direzionali: il protone si deve trovare lungo lasse che congiunge il nucleo del donatore a quello dellaccettore. Le distanze sono molto variabili e quindi anche le energie del legame a idrogeno sono molto variabili, perch dipendono: -dalla forza del donatore e dellaccettore: ci sono forti donatori di legame a idrogeno, come ad esempio il gruppo fenolico (OH) della tirosina, e deboli donatori di legame a idrogeno, come il carbonio alifatico (CH alifatico); per quanto riguarda gli accettori, i doppietti elettronici del gruppo amminico sono forti accettori di legame a idrogeno, i doppietti elettronici liberi di un gruppo alcolico sono buoni accettori di legame a idrogeno; anche lossigeno del doppio legame, in un carbonile, un buon accettore di legame a idrogeno, perch ?

O

C

Il carbonile ha un ossigeno legato con un doppio legame ad un carbonio. Lossigeno del carbonile possiede 2 doppietti elettronici: lossigeno qui ibridizzato sp2, quindi sar un accettore di legami a idrogeno con queste specifiche propriet direzionali: il donatore far un legame a idrogeno preferenziale con lossigeno carbonilico lungo le bisettrici del triangolo identificato dal piano su cui giace lossigeno sp2. Quindi, tutti questi atomi sono ottimi accettori di legame a idrogeno. Le energie variano in funzione di questo: un legame a idrogeno forte pu arrivare addirittura allenergia di 8-10 Kcal/mole, che quasi quanto un legame covalente debole! I legami covalenti, infatti, sono compresi tra 10 e 100 Kcal/mole. A 10 Kcal/mole ci sono dei legami a idrogeno talmente forti che arrivano vicino al valore di un legame covalente debole. Altres, vi sono legami a idrogeno debolissimi, con energia di 0.1 Kcal/mole. Quando ce ne sono tanti, per, determinano il ripiegamento della struttura tridimensionale della proteina.

2) Interazioni elettrostatiche: tra carica positiva e carica negativa. Quali sono le propriet di uninterazione elettrostatica? Linterazione elettrostatica obbedisce alla legge di Coulomb: La forza uguale al prodotto delle cariche fratto il quadrato della distanza tra le due cariche, il tutto mediato da una costante dielettrica del mezzo:

Linterazione elettrostatica ha propriet direzionali? No, sferosimmetrica. Quindi, la differenza fondamentale dal legame a idrogeno che linterazione elettrostatica NON direzionale ma sferosimmetrica. Linterazione elettrostatica, quella che si forma nei cristalli dei sali, intatti, totalmente sferosimmetrica: non ha propriet direzionali. Ci devono essere una carica positiva e una carica negativa. Lenergia dellinterazione elettrostatica in genere bassa, ma fortemente dipendente dal mezzo in cui si trovano: in acqua, le interazioni elettrostatiche valgono poco, al massimo 1 Kcal/mole. Le interazioni elettrostatiche, per, sono altres importanti nel determinare le interazioni tra amminoacidi, anche se alla fine coinvolgono solo 4 amminoacidi, quali? -Acido aspartico e Acido glutammico per le cariche negative; -Lisina e Asparagina per le cariche positive.Quando combinate questi amminoacidi nelle varie combinazioni possibili, avete fatto tutte le possibili interazioni elettrostatiche consentite nelle proteine; volendo, potete aggiungere lN-terminale e il C-terminale.

3) Interazioni idrofobiche: attenzione, non le ho chiamate forze. In realt c una formula per la forza di uninterazioni idrofobica, che per una formula difficile perch deriva dalle cosiddette interazioni diplo indotto - diplo indotto; quindi, la forza di attrazione, in queste interazioni, nasce dalla media (pesata nel tempo) di permanenza del diplo indotto. Il diplo indotto si forma ad esempio in un sistema aromatico, ma transientemente, perch gli elettroni non stanno fermi; transientemente, dunque, si generano variazioni di carica: quella la generazione del cosiddetto diplo indotto diplo indotto. Questa forza di interazione, per, debolissima, mentre si sa che le interazioni idrofobiche sono molto importanti per tenere insieme la struttura di una proteina. La forza di uninterazione idrofobica, infatti, varia tra 0.1 e 0.2 Kcal/moli, per uninterazione idrofobica tra due polipeptidi li fa stare insieme, come si spiega? Qui la termodinamica che parla: chi domina linterazione idrofobica non tanto la forza di interazione diplo indotto diplo indotto, che proporzionale allentalpia di reazione, ma c soprattutto un fattore entropico: il fattore entropico deriva dal fatto che tutte queste catene laterali non hanno alcuna interazione col solvente, cio con lacqua, mentre sia legame a idrogeno sia i ponti elettrostatici possono avere interazione con lacqua. Quindi, il fatto che le interazioni idrofobiche non abbiano interazioni con lacqua favorisce linterazione, con le medesime caratteristiche idrofobiche; cio gli alifatici e gli aromatici stanno bene tra loro in assenza di acqua allinterno. La non partecipazione dellacqua, quindi, favorisce laggregazione di questi composti: si tratta di un fenomeno di natura puramente entropica. Dal punto di vista meccanicistico si pu spiegare anche meglio: consideriamo il benzene; si scioglie il benzene nellacqua? Anche se vi hanno insegnato che i composti aromatici non si sciolgono in acqua: questa informazione sbagliata! S, il benzene si scioglie in acqua: arriva addirittura a concentrazioni di 1 M (1micromolare). Un micromolare, certo, poco, per cui quando i chimici del passato facevano soluzioni acquose con composti aromatici dicevano che non si scioglievano; in realt, il benzene si scioglie eccome, tant vero che la contaminazione delle falde acquifere col benzene e suoi derivati un problema serissimo. Quindi il benzene si scioglie, certo pochissimo, 10 alla -6 molare, poi trasformatelo in grammi/litro e vi accorgete che poco, ma nella tossicologia il benzene si dosa eccome! Il problema che il benzene si scioglie nellacqua in maniera del tutto anomala: non solvatato; il benzene in acqua fa s che le molecole dellacqua si ordinino secondo legami a idrogeno disposti a formare una cavit ordinata di molecole dacqua e tale cavit accoglie una molecola di benzene allinterno: cio non c nessun legame a idrogeno e nessuna interazione tra acqua e benzene, si forma solo una cavit ordinata di molecole dacqua, che tra loro formano una serie di legami a idrogeno, tali da formare una cavit; in questa cavit sono contenuti i legami idrofobici. Quindi, dal punto di vista entropico che succede? Il benzene ha causato un incremento di ordine, cio una diminuzione di entropia locale, dellacqua. Ripeto: locale, altrimenti violerebbe il secondo principio della termodinamica. Sistemi come questi cosa fanno? Certo lacqua, per fattori entropici, tender a spingere il benzene fuori dalla soluzione; che vuol dire spingere via dalla soluzione in termini meccanicistici? Vuol dire formare cavit sempre pi grandi con tante molecole di benzene. Quando vi pi di un certo numero di molecole di benzene nella cavit, si forma una gocciolina di benzene e a quel punto diciamo che il benzene non pi in soluzione (per fino a 10 alla -6 molare in soluzione eccome). Applicate questo alle proteine e tutto torna: amminoacidi e proteine sono stabilizzate da interazioni idrofobiche in cui lacqua confina una serie di catene laterali idrofobiche (aromatiche o alifatiche) in una zona precisa, ristretta, in maniera da compensare quella diminuzione di entropia che deriva dalla strutturazione dellacqua intorno ai residui idrofobici.