LEZIONE 10Ingegneria animale I

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

AA 208-09Adriana Maggi

ANIMALE TRANSGENICO:

• animale nel cui genoma e’ stato introdotto un frammento di DNA esogeno

TRANSGENE • frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali

METODI DI INGEGNERIA ANIMALE

1 Iniezione di DNA esogeno nella cellula uovo (TRANSGENESI STANDARD)

2 Ingegneria di cellule staminali in coltura e loro iniezione in blastocisti (GENE TARGETING)

3 Enucleazione della cellula uovo e inserzione di un nucleo di una cellula somatica (CLONAZIONE)

TRANSGENESI STANDARD

GENE TARGETING

Microiniezionedel DNA clonato

zigote

Embrionestadio 2 cellule

Impianto nellafemmina

pseudogravida

10-20% dei nascituricontiene il transgene

Trasfezione del DNA clonato

in cellule ES

Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti

Impianto della blastocisti in femmina

pseudogravida

Topo chimerico

Ibrido F1

25-75% della progenieportano il transgene

CLONAZIONE

Pecore con muso nero

Cellula somatica con nucleo

Pecore con muso giallo

Oocita enucleato

Trasferimento del nucleo nell’oocita

Impianto nella pecora

Nascita della pecora dal muso giallo

METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Transgenesi standard

SCOPO -GUADAGNO DI FUNZIONE-

esprimere un gene esogeno (transgene) in uno o piu’ tessuti dell’animale.

(Eccezionalmente si puo’ avereperdita di funzione dovuta allaintegrazione del transgenein una sequenza codificante.)

Preparazione oociti fecondati

Preparazione ‘pseudo pregnant’

Screening della progenie

Preparazione costrutti

microiniezione

Transgenesi standard METODO nel dettaglio

Preparazione oociti fecondati

Cocktail ormonale

Incrocio

Recupero uova fecondate

Preparazione del costrutto

Purificazione del transgene

propagazione del transgene

transgene Vettore di clonaggio

Impianto degli oociti microiniettati

Preparazione delle ‘pseudo pregnant’

FemminaMaschio

vasectomizzato

Incrocio

Prelievo delle uova fecondate

MicroiniezioneTrasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida

Microiniezione e reimpiantodegli oociti microiniettati

Screening della progenie

Analisi del DNA estratto dalle code della progenie per :

Southern blot

PCR

Tecniche utilizzate per la verifica del genotipo

Southern Blot

Ciclo di base Amplificazione

Tecniche utilizzate per la verifica del genotipo

Polymerase chain reaction

Incroci per l’omozigosi

F2Omozigoti 1:4Eterozigoti 1:2Wild type 1:4

Founder/wild type

F1/F1

Transgenesi standard - riepilogo procedura -

• microiniezione del transgene negli oociti fecondati

• impianto nella femmina pseudogravida

• gravidanza e nascita dei ‘Founder’

• Screening dei ‘founder’

• incroci successivi per ottenere l’animale omozigote

METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Transgenesi standard

Destino del DNA dopo la microiniezione

• integrazione stabile nel genoma della linea germinale dell’animale • integrazione in singola copia o con maggior frequenza in copie multiple distribuite secondo un tipico arrangiamento ‘in tandem’

• integrazione nel genoma in posizione casuale tramite

RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA

METODI DI INGEGNERIA ANIMALE

Gene targeting

SCOPO -PERDITA DI FUNZIONE-

ablare un gene endogeno attraverso l’inserzione mirata di un transgene

GENE TARGETING

Trasfezione del DNA clonato

in cellule ES

Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti

Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti

Topo chimerico

Ibrido F1

25-75% della progenieportano il transgene

GENE TARGETING - procedura -

• generazione di cellule staminali (Embryonic Stem cells o cellule ES)

• preparazione del vettore

• trasfezione delle cellule ES con il vettore

• iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti

• generazione di topi mosaico

• incroci successivi per ottenere l’animale con il transgene nella linea germinale

Generazione di cellule staminali ES

Femmine dopo 3-4 giornidal concepimento

Blastocisti

Espianto e messa in coltura

Crescita in terreno selettivo per le ES

Disaggregazione

1 passaggio

Linea pura

Trasfezione del vettore (elettroporazione)

Cellule ES

Selezione dellecellule knock out

Trasfezione delle ES

Strategia di selezione delle ES knock out

Destino del DNA

Integrazione randomIntegrazione sito specifica

Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000

Ricombinazione omologaEs. di gene targeting

Verifica del genotipo

Southern blot

PCR

Iniezione delle cellule ES nella blastocisti

- generazione di animali mosaico -

Incroci per l’omozigosi

F2Omozigoti 1:4Eterozigoti 1:2Wild type 1:4

Founder/wild type

F1/F1

METODI DI INGEGNERIA ANIMALE

Gene targeting

Destino del DNA dopo la microiniezione

• integrazione stabile nel genoma della linea germinale dell’animale • integrazione in singola copia

• integrazione nel genoma in un sito specifico tramite

RICOMBINAZIONE OMOLOGA

METODI DI INGEGNERIA ANIMALE

Clonazione - procedura -

Il nucleo di cellule somatiche (ghiandola mammaria) arrestate nella fase G0 del ciclo cellulare e’ impiantato in un oocita enucleato nella metafase II della meiosi

CLONAZIONE

Pecore con muso nero

Cellula somatica con nucleo

Pecore con muso giallo

Oocita enucleato

Trasferimento del nucleo nell’oocita

Impianto nella pecora

Nascita della pecora dal muso giallo

METODI DI INGEGNERIA ANIMALE

Clonazione

SCOPI

• ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse

• nuovo metodo di transgenesi possibilita’ di ingegnerizzare le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo per il reimpianto

METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Riepilogo

• transgenesi standard - guadagno di funzione

• gene targeting - perdita di funzione

• clonazione- generazione clonale di individui

GENERAZIONE DI MUTANTI CONDIZIONALI

Il sistema cre-loxP

Gene bersaglio LoxP

LoxP

CRE RICOMBINASI

GENERATION OF THE LID/ERE-Luc MOUSE

Luciferase

ERE sequences

Luciferase

LID (liver-specific IGF-I gene-deficient)

ERE-Luciferase

Albumin promoter

Esone 4

LoxP

CreX

X Ex 4

80% plasma IGF-I

CRE

LID/ERE-Luc

APPLICAZIONI FARMACOLOGICHEDELL’INGEGNERIA ANIMALE

• Studio di funzione genica (ricerca di base)

• Modelli di patologia umana

• Produzione di biofarmaci

• Modelli per lo screening di farmaci

Studi di funzione genica(ricerca di base)

Es. Knock-out dei recettori per le lipoproteine a bassa densita’ e implicazione nei meccanismi patogenetici di insorgenza dell’aterosclerosi

Transgenici per i ligandi dei recettori sopracitati (ApoE e ApoB) e implicazione neimeccanismi patogenetici di insorgenza dell’aterosclerosi

Modelli di patologia umana

Utilizzi in farmacologia

• studio dei meccanismi patogenetici e identificazione di nuovi bersagli farmacologici

• test dell’attivita’ farmacologica di composti

Modelli di patologia umana

• Malattie virali

• Malattie ereditarie

• Malattie neoplastiche

Per approfondimenti Bedell et al. Genes & Development (1997) 11: p. 11-43

Modelli di malattie virali

virus umani spesso non infettano altri mammiferi

Si generano modelli transgenici

Es. Papovavirus JC responsabile della leucoencefalopatia multifocale sviluppo di una patologia simile nel topo transgenico per il virus

Modelli di malattie ereditarie monogeniche

• Es. Knock out per il cluster genicodella beta-globina provoca beta-talassemianel topo

Ciavatta, D. J.; Ryan, T. M.; Farmer, S. C.; Townes, T. M. : Mouse model of human beta-0-thalassemia: targeted deletion of the mouse beta(maj)- and beta(min)-globin genes in embryonic stem cells. Proc. Nat. Acad. Sci. 92: 9259-9263, 1995. PubMed ID : 7568113

Goldberg, Y. et al., Absence of disease phenotype and intergenerational stability of the CAG repeat in transgenic mice expressing the human Huntington disease transcript. Hum. Molec. Genet. 5: 177-185, 1996. PubMed ID : 8824873

• Es. Transgeenico per l’huntightina mutataprovoca la malattia di Huntighton nel topo

Modelli di malattie neoplastiche

Es. Mutazioni nel gene che codifica per APC (ADENOMATOUS POLYPOSIS OF THE COLON)

predispongono ai tumori del colon.La mutazione introdotta per gene targeting anche nel topo provocainsorgenza di tumori intestinali.

Produzione di biofarmaci

Utilizzo di vettori tessuto specifici per esprimere proteine terapeutiche nel latte

o nel siero di animali transgenici

Modelli per lo screening di farmaci

• Topo Transgenico ERE-Luciferasi Modello per lo screening di farmaci attivisul recettore degli estrogeni.

ER cDNACMV

ER

trascrizione

traduzione

SERMS

ER ER

Co-Fact. RNA pol

Luciferasi

trascrizione

traduzione

ER

Attivazionedi ER

SCREENING OF COMPOUNDS MODULATING ERs ACTIVITY

ER

RNA pol

NO trascrizione

prom.ERE LUCIFERASI prom.ERE LUCIFERASI

Strategia per la generazione del topo reporter ER-luc

INTERESSE FARMACOLOGICO DEGLI ESTROGENI

• Terapia endocrina dei tumori

• (Malattie neurodegeneragive)

• (Rischi cardiovascolari)

• Controllo della ferilita’ Disfunzioni endocrine

• Prevenzione dell’osteoporosi

fold

in

du

ctio

n

E2 0 0.5 5 50 250

(g/Kg)

20

10

0

30

300

150

0fold

in

du

ctio

n

E2 0 0.5 5 50 250

(g/Kg)

TIME

20

10

0fold

in

du

ctio

n

E2 0h 3h 6h 16h

30

fold

in

du

ctio

n

E2 0h 3h 6h 16h

10

0

20

250

200

fold

in

du

ctio

n

25

0

250

50

200

E2C

T + E

2T

ICI +

E2

*°

°

fold

in

du

ctio

n

20

10

0

30

E2C

T + E

2T

ICI +

E2

°°

*

DOSE ANTAGONISTS

LIVER

BONE

LUCIFERASE EXPRESSION IN LIVER AND BONE

IMAGING OF ESTROGENIC ACTIVITY

6 h

24h pharmacologicaltreatmentwith E2

6h3h

0h

CYCLING FEMALES

Est

rad

iol

(pg

/ml)

0

25

50DIEST.-1 DIEST-2 PROEST. ESTRUS

13 13 13 13

0

200

400LIVER

0

200

100

E D-1 D-2 P

OVARIES

0

40

80

120BONE

100

200

300

E D-1 D-2 P

BRAIN

PROES. ESTR. DIEST.

P E D