LEZIONE 9Ingegneria cellulare II

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2010-11

Adriana Maggi

Applicazioni dell’ingegneria cellulare.

RICERCA DI BASE

Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans

Analisi struttura funzione delle proteine eucariote

Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

APPLICAZIONI INDUSTRIALI

Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS)Produzione di biofarmaci

Biological reporter: molecules acting as

surrogate, measurable, indicators of a given

molecular event

I geni reporter

Bassa sensibilità per mancanza di amplificazione

(non è una reazione enzimatica)

Monomerico, non richiede substrato, assente nei

mammiferi, varianti con diversa di fluorescenza.

fluorescent proteins (GFP, varianti RFP,

BFP)

Elevata attività endogena in alcuni tipi cellulari.

Proteina di secrezione, saggio colorimetrico

molto sensibile.

Fosfatasi alcalina (Umana)

Richiede l’aggiunta di cofattore, O2, ATP.

Alta attività specifica, mancanza di attività

endogena (basso background)

Luciferasi (Lucciola)

Presenza di attività endogena in cellule di mammifero, enzima

tetramerico (risposta non lineare)

Ben caratterizzata, stabile, rilevazione

automatizzabile

B-Galattosidasi (Batterica)

SVANTAGGIVANTAGGIGENE

fluorescent proteins

La green fluorescent protein è una proteina naturale (prodotta dalla medusa Aequorea victoria) di piccole dimensioni (238 aa 26,9 kd) che se eccitata da una radiazione nel campo dell’ultravioletto (395 nm), ma anche del visibile (475 nm, colore blu) emette una radiazione di colore verde (505 nm)

Osamu ShimomuraPremio Nobel 2008

Fluoroforo di GFP è un tripepide Ser-deidroTyr-Gly che è ciclizzato:

p-idrossibenzilidene-imidazolidone

Nella struttura tridimensionale della GFP alcuni residui basici fanno ponti a idrogeno con atomi di ossigeno (His148 con Tyr66 e Gln94 o Arg96 con l’ imidazolidone.) stabilizzando il fluoroforo

L’emissione di luce avviene tramite un meccanismo sequenziale di un processo autocatalitico in assenza di cofattori. La reazione inizia con una rapida ciclizzazione tra la Ser65 e la Gly67 per formare un intermediato (imidazolin-5-one) seguita da una reazione di ossidazione della Tyr66.

La reazione è termosensibile, ma una volta prodotta la GFP è molto stabile.

La proteina è stata cristallizzata e la sua struttura determinata. La GFP funziona in forma dimerica la struttura cilindrica è sostenuta da foglietti beta, le dimensioni del cilindro sono 30 Å di larghezza e 40 Å di lunghezza , segmenti ad alfa elica chiudono I cilindri da ambedue le parti e costituiscono lo scheletro per la formazione del fluoroforo che si trova al centro dei cilindri. Questa particolare struttura con fogietti beta esterni e alfa eliche interne forma una nuova classe di proteine denominata beta-can. Si tratta di una struttura molto stabile e difficilmente degradabile.

La conoscenza della struttura ha permesso di generare una serie di mutanti, il primo dei quali è stata una muazione puntiforme (S65T) descritta da Roger Tsien nel 1995 che migliora le caratteristiche dello spettro di emissione (509 nm) con una fluorescenza più sostenuta e più stabile nel tempo e lo spostamento del picco di eccitazione a 488 nm.

Negli anni a seguire, il gruppo di Tsien ha sviluppato una vastissima gamma di proteine fluorescenti (YFP, EBFP, EBFP2, citrine, Venus, ecc)Roger Tsien, premio Nobel 2008

Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine

fluorescenti (GFP e BFP).

Citosol BFP

Golgi GFP

Le luciferasi sono una classe di enzimi ossidativi che agendo su un substrato specifico causano la produzione ( luciferasi di lucciola, e suoi

derivati ricombinanti, Luc 2, ecc) ' (lucem ferre).

Luciferasi

luciferina + ATP → luciferil adenilato + PPi luciferil adenylato + O2 → ossiluciferina + AMP + fotoni

Utilizzo di proteine bioluminescenti o fluorescenti per studi di funzione geniche, di correlazioni-struttura-funzione, studi di

regolazione di espressione genica

Lo studio della regolazione dell’espressione genica. I sistemi reporter

X

Y

Gene reporterPromotore

Elementi di regolazione cis

Z

Elementi di regolazione trans

Prodotto genico

facilmente

quantizzabile

*** **

endo wt1-399

182-599

S122A

C241/244A

G525R

L543/544A0

1

2

3

4

ER

acti

vit

y(f

old

over

basal)

*** **

A AF-1 DBD AF-2D F -COOH

:wt

:1-399

:182-599

:S122-A

:C241/244-A

:G525-R

:L543/544-A

A AF-1 DBD AF-2D FNH2- -COOH

A AF-1 DBD

DBD AF-2D F -COOH

A AF-1 DBD AF-2D F- -COOH

A AF-1 DBD AF-2D F- -COOH

A AF-1 DBD AF-2D F- -COOH

A D F -COOH

:wt

:1-399

:182-599

:S122-A

:C241/244-A

:G525-R

:L543/544-A

NH2

NH2

NH2

NH2

NH2-

-

S236A

**

Effetto di mutazioni specifiche sulla attività trascrizionale del recettore degli estrogeni

Un esempio storico. L’analisi del promotore del gene tk del virus Herpes Simplex

+1

-20-40-60-80-100

GC CCAAT GC TATA

++

++----

Generazione di mutanti

Trascrizione in oociti di Xenopus laevis

+ + + +- - - -

Analisi di Northern

Studio di funzione genica:

l’esempio della identificazione della funzione

di Nip-2 e protimosina

01234567

c nip 0.5 nip 1.5 nip 2.5Ce

ll d

ea

th (

de

ad

ce

lls

/dis

h)x

1

0 2

16 h 24h 48h

0

5

10

15

20

0 1 4 16 24 48

nip

2 m

RN

A

Hours after Locke

bnip-2 expression associates to cell death

• Nip-2 pro-apoptotic activity is blocked by overexpression of Bcl-2• mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding domani fail to cause apoptosis

Meda et al. 2001

CTRL

BNIP2

BNIP2CTRL

100

75

50

25

BNIP2CTRL

200

150

100

50

CTRL

BNIP2

%su

rviv

al%

pro

lifer

atio

n

0

0

TRANSFEZIONE DI bnip2/PROT-A cDNA IN MCF-7 CELLS

ap

op

tosi

pro

life

razio

ne

STUDI DI STRUTTURA-FUNZIONE

Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

Structure of TFMPV-E2/ER ligand-binding domain. (A) The structure of one monomer of ER is shown as a ribbon diagram, with the bound GRIP1 coactivator peptide coloured red. The compound is shown in a stick representation, with carbon atoms coloured green, oxygen atoms coloured red and fluorine atoms coloured pink. (B) A stereo view of part of the ligand-binding pocket bound to oestradiol (top panels; Protein Data Bank code 1ERE), or TFMPV-E2 (bottom panels). The ligands are coloured green and are shown in a stick representation. (C) TFMPV-E2 is shown in a 2F o–F c electron density map, contoured to 1.5 . ER , oestrogen receptor ; GRIP, glutamate receptor interacting protein; TFMPV-E2, trifluoromethyl-substituted phenylvinyl oestradiol compound

Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

Applicazioni dell’ingegneria cellulare.

RICERCA DI BASE

APPLICAZIONI INDUSTRIALI

Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS)Produzione di biofarmaci

Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans

Analisi struttura funzione delle proteine eucariote

Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

Screening di molecole farmacologicamente attive.

ER cDNA

ERE LUC Potenziali ligandi

CTR CTRE2LU

C

Un

its

LUC

ERER

High-throughput Screening (1)

La possibilità di automatizzare la detezione del reporter consente uno screening ad “alto flusso”.

Library di molecole

Saggio biologico automatizzabile

Piattaforma Robotizzata

Elaborazione digitale dei

dati

High-throughput Screening (2)

1990. 20 ricercatori

1.5 milioni di molecole/anno

Oggi. 4 ricercatori

2.5 milioni di molecole/anno

I più moderni saggi di screening consentono la determinazione della POTENZA e della

SPECIFICITA’ della sostanza testata.

Applicazioni dell’ingegneria cellulare.

RICERCA DI BASE

APPLICAZIONI INDUSTRIALI

Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS)Produzione di biofarmaci

Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans

Analisi struttura funzione delle proteine eucariote

Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori)

Produzione di biofarmaci

La produzione delle proteine terapeutiche in microorganismi non è sempre possibile soprattutto per le modificazioni post-

traduzionali

L’utilizzo di cellule animali consente di ottenere prodotti proteici

strutturalmente più simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà tecniche e costi

più elevati.

IMPIANTO DI FERMENTAZIONE PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE

Difficoltà nella produzione di biofarmaciIstituzione di Master cell banks caratterizzate in

dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene.

Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamente nell’impianto pilota

Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks.Controllo delle condizioni di produzione

Recupero e produzione

Caratterizzazione del prodottoCONTROLLO

QUALITA’

Controllo di qualità di proteine terapeutiche

Spettrometria di massa

Presenza di DNA cellulare

Presenza pirogeni

Presenza di proteine cellulari

Presenza di proteine seriche

HPLC

SDS PAGE/Western

Determinazione dello stato di purezza

Composizione in acido sialico

Composizione in carboidrati

Sequenziamento N-terminale

Mappa peptidica

HPLC

Isoelectrofocusing

SDS PAGE Western

Saggio immunologico

Saggio biologico

Caratterizzazione della proteina

TPA ricombinante

Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di mammifero

Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary)

Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini

Assenza di attività tossica per l’uomo

Stabile integrazione di geni eterologhi

Crescita in sospensione o monostrato

Modificazioni post-traduzionali corrette

Alcuni esempi di proteine terapeutiche in commercio

BHK (Baby Hamster Kidney

cells)

Fattore VIICHOGlucocerebrosidasiCHOEritropoietinaCHOInterferone betaCHOFSHE.ColiG-CSFE.ColiIL-2E.ColihGHE.ColiInterferone alfaE.ColiInsulina

E.Coli, CHOTPA