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Le mutazioni 3

Lezione 12

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MEMENTO

La cosidetta patologia molecolare ha come fine quello di spiegare se e come un particolare allele sia collegabile ad un fenotipo clinico, quindi ci si domanda: la mutazione che effetto ha sulla quantita', qualita', funzione del prodotto? cosi' si tenta di spiegare perche' sia o meno patogenetica

ormai vi saranno chiare le difficolta' che si incontrano e la portata della sfida per comprendere il funzionamento del genoma umano: le malattie genetiche sono il risultato di un complesso network di interazioni, ma costituiscono il fulcro per lo studio delle funzioni.

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Quando si trova una mutazione

Mutazione mai descritta in letteratura, ma che potrebbe essere patogenetica (il meccanismo di azione del prodotto e’ noto): e’ presente in altri soggetti sani della famiglia?

Mutazione mai descritta in letteratura, con effetto ignoto sulla funzionalita’: e’ presente in soggetti sani della famiglia?

Mutazione mai descritta in letteratura, ma il cui effetto si ritiene innocuo sulla funzionalita’: e’ presente in soggetti sani della famiglia?

Mutazione descritta in letteratura, il cui effetto e’ accertato essere innocuo sulla funzionalita’ (come?)

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esempio mutazione conservativa patologica: Distrofia dei cingoli LGMD2

gene Calpaina3: la mutazione e' in terza base e la nuova tripletta e' sinonimacodifica sempre per una glicina, ma origina un sito di splicing criptico che puo' portare alla perdita di parte dell'esone 16 con conseguente frameshift

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esempio mutazione potenzialmente patologica in un introne

sito preesistente puo' divenire un sito di splicing si origina un nuovo esone con conseguenze non prevedibili in quanto legate alle sequenze contenute nel nuovo esone : frameshift, stop, alterazione della conformazione…… o creazione di un nuovo prodotto funzionante.

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La perdita di funzione: non solo missenso/non senso. PAX3 sindrome di Waardenburg

Le mutazioni riportate in alto distruggono la struttura della proteina e sono abbastanza distribuite, mentre le missenso sono concentrate in due regioni, il risultato e' lo stesso e conferma che la perdita di funzione e' alla base della malattia

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Tabella riassuntiva di mutazioni che

provocano perdita di funzione

Chan ge Exam ple

Delete:

(i) the entire g en e Most -thalassemia m utations

(ii) part o f the g ene 60% of Duchenne m uscular d ystrophy

Insert a sequence into the gen eInsertion of LINE-1 repetitive sequen ce (see

into gene in hem ophili a A

Disrupt th e gene st ructure :

(i) by a translocatio nX-autosom e translocations in women wi th

Duchenne m uscul ar d ystrophy

(ii) by an inversion Inversion in gene

Prevent the prom oter working:

(i) by m utation -Globin -29A G mutation

(ii) by m ethylation Fragile-X full m utation ( )

Destabilize the mRNA :

(i) by a polyadenylation site m utation -globin AATAAA AATAGA m utation

(ii) by nonsense-m ediated RNA decay Fibrillin mutations ( )

Prevent correct splicing:

(i) by inactivating donor s plice si te 451 + 1G T m utation

(ii) by inactivating acceptor sp lice site 452-2A G m utation

(iii) by activating a cryptic splice site -Globin intron 1 -110G A m utation

Introduce a fram eshift in trans lation 874–875insG m utation

Convert a codon into a s top codo n Q254X m utation

Replace an essential aminoacid R271C m utation

Prevent post-trans criptional processingCleavage-resistant collagen N-terminal propeptide in Ehlers Danlos VII syndrom e

Prevent correct cel lular localization of pr oduct F508del m utation in cystic f ibrosis

F8C

F8C

FM R1

FBN1

PAX3

PAX3

PAX3

PAX3

PAX3

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Tabella conclusiva ma non esaustiva

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esempio mutazione missenso:Acondroplasia

2 mutazioni patogenetiche che vengono ritrovate (una sola!) nel 99% degli affetti. Entrambe sono a carico del codone 380 al nucleotide 1138 e provocano, a causa della sostituzione della prima base della tripletta, la sostituzione di una glicina con una arginina nel dominio transmembrana G380R.

Nel 98% e’ una transizione G>A

nell’1% e’ una trasversione G>C

2

2

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Il collagene di Tipo I e piu abbondante in pelle, tendini, ossa e arterie. Questi sono anche i tessuti maggiormente interessati dalla OI

Il collagene

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Esistono tipi diversi di collagene nei vari tessuti . Essi si differenziano perlunghezza, sequenza dei diversi domini, per composizione e dimensione deipeptidi C e N terminali e per proprieta fisiche. (vedi tabella nel libro)

N-term Dominio a tripla elica C-term

’

’ ’

α1

α1α2

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OGNI CATENA DEL COLLAGENE E’ CODIFICATA DA UN GENE DISTINTO. QUESTI GENI PRESENTANO OMOLOGIA DI SEQUENZA ELEVATA.

TRAMITE SCREENING DI LIBRARY GENOMICHE E’ STATO POSSIBILE ISOLARE DIVERSI GENI PER IL COLLAGENE.

ESISTONO DIVERSE CLASSI DI COLLAGENE:COLLAGENI FIBRILLARI(DI TIPO I II III V E XI)COLLAGENI NON FIBRILLARI(i domini a tripla elica sonointerrotti da domini non a tripla elica) COLLAGENI A CATENA BREVE (TIPO VII)

I GENI PER IL COLLAGENE FANNO PARTE DI UNA FAMIGLIA GENICA (insieme di geni con un elevato grado di omologia di sequenza e codificanti per prodotti con funzione simile o correlata. Possono contenere elemeni non funzionanti detti PSEUDOGENI)

I tipi di collagene

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M

M

I

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Nonostante un solo allele del gene COL1A1 e’ mutato ben il 75% delle triple eliche sono anomale.

MUTAZIONE IN UN ALLELE DEL GENE PER LA CATENA

La mutazione riguarda il 50% del prodotto genico, ma influenza il 75% della proteina..L’EFFETTO E’ DOMINANTE anche in caso di eterozigosi

Perche’ la patologia dominante

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E’ POSSIBILE RICONOSCERE MUTAZIONI PIU’ FREQUENTI PER CIASCUN TIPI DIVERSO DI OI

DEGRADATE

α1

α2

α1

α1

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Mutazioni di grosse dimensioni(delezioni o inserzioni multiesoniche) sono rareperche’ compromettono la stabilita’ di gran parte delle molecole di collagene .Questo tipo di mutazioni si riscontra spesso in casi di OI di tipo II nelle formeletali in fase perinatale .

Piu’ frequenti sono le mutazioni puntiformi . Queste sono anche piu’ difficili datrovare viste le dimensioni della molecola del collagene . nei geni COL1A1 e COL1A2sono state trovate numerose mutazioni che causano una sostituzione di una glicinacon un altro amminoacido . A seconda del sito di sostituzione si manifestano diversifenotipi OI. Questi ultimi sono piu’ gravi quando la sostituzione si verifica piu’ vicinoall’estremita’ carbossi terminale .

GRAZIE A TALI STUDI MOLECOLARI E BIOCHIMICI E’ STATO POSSIBILE IDENTIFICARE MUTAZIONI NEI DIVERSI GENI DEL COLLAGENE CAUSA DELLE DIVERSE FORME DI OI

Relazione genotipo-fenotipo

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M

M

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Tutte le sostituzioni Gly-Asp sono risultate letali .Mutazioni in siti di splicing possono provocare delezioni di esoni o

splicing anomali con conseguente sintesi di molecole anomale di collagene .Le mutazioni nel COL1A1 sono generalmente associate a fenotipi piu’

gravi rispetto a quelle che colpiscono il gene COL1A2 e i fenotipi piu’ gravinel caso di mutazioni vicine all’estremita’ 3’ della tripla elica .

Relazione genotipo-fenotipo

L APPROCCIO DI STUDI O DELL OI E STATO QUELLO DELLA GENETICA DIRETTAIN CUI SI PARTE DA UN PRODOTTO PROTEICO PER ARRIVARE AL GENE E ALLO STUDIO DELLE MUTAZIONI AD ESSO ASSOCIATO

IN OGNI CASO IL PRIMO PASSO PER LO STUDIO DI QUALSIASI PATOLOGIA

E L ANALISI DEL FENOTIPO! 14

MM

M

M

’ ’ ’

’ ’

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TIPO III: e’ una forma geneticamente eterogenea, si riscontrano mutazioni in geni diversi . A voltesono presenti anche piu’ mutazioni in geni diversi contemporaneamente . E’ l’unica forma per la quale e’stata dimostrata anche trasmissione ditipo autosomico recessiva, frequente solo in alcune popolazionicome quella sud africana dove, pero’ di riconosce un EFFETTO DEL FONDATORE(prevalenza di un allelenella popolazione dovuta alla sua presenza in uno dei membri originari della popolazione stessa ed allatendenza dei membri della popolazione ad accoppiarsi tra loro). In questo caso sono piu’ frequentisoggetti omozigoti per mutazioni in geni COL1A1 e COL1A2 .

TIPO IV: pur essendo generalmente lieve, puo’ presentare variazioni notevoli anche nella stessafamiglia(non e’ noto il perche’ di questa variabilita’) . Si trovano frequentemente mutazioni puntiformi neigeni COL1A1 o COL1A2 .

Relazione genotipo-fenotipo riepilogoTIPO I: e’ causato da mutazioni nel COL1A1, in generale si tratta di mutazioni non senso (sostituzione diun codone di senso con un codone di stop) o mutazioni di splicing . QuesteQueste provocanoprovocano unauna riduzioneriduzione nellanellasintesisintesi deldel collagene,collagene, mama lele molecolemolecole cheche vengonovengono sintetizzatesintetizzate hannohanno unauna strutturastruttura normalenormale ..

TIPO II:e’ causato o da mutazioni multiesoniche(nei casi di forme letali) o da mutazioni missenso sostituzione di un codone per un AA con uno per un AA diverso) che non comportano mancata produzione della proteina, ma produzione di catene (I)anomale. queste aggregandosi con catene normali portano alla formazione di triple eliche anomale causando il fenomeno dell’ effetto dominante negativo.

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α1

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Iperplasticita’ della cute.

Esistono diversi tipi Vengono ereditati con modalita’ diverse.

Ipersensibilita’ delle articolazioni

COL5A1 o COL5A2 Sindrome di Ehlers-Danlos

Sono dovuti a mutazioni in locus diversi

interessano principalmente cute earticolazioni . sono state trovate mutazioninel collagene di tipo V (mutazioni inCOL5A1 o COL5A2 ).

Tipo I : piu’ grave

tipo II: piu’ lieve

TIPO IV vascolare : pelle traslucida con vene chiaramente visibili e facilmenteescoriabile . Minima ipersensibilita’ delle articolazioni . Gravi rischi di rottura diarterie, del colon e utero. Attesa di vita non superiore ai 50 anni. E’ causata damutazioni nel gene COL3A1 che codifica per le catene di tipo III (mancataproduzione del collagene di tipo III) di cui sono particolarmente ricche le paretiarteriose, dell’intestino e utero .

DOMINANTI

16

LM

LM

***

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Iperplasticita’ della cute.

TIPOTIPO VIVI::cutecute sofficesoffice ee iperelasticita’,iperelasticita’, ipersensibilita’ipersensibilita’ delledelle articolazioniarticolazioni eefragilita’fragilita’ oculareoculare (distacco(distacco delladella retina)retina).. AutosomicaAutosomica recessiva,recessiva, causatacausata dadamutazionimutazioni nelnel genegene perper lala lisillisil idrossilasiidrossilasi responsabileresponsabile delledelle modifichemodifiche postposttraduzionalitraduzionali deldel collagenecollagene ..

TIPOTIPO VIIVII:: dislocazionedislocazione congenitacongenita delledelle ancheanche ee altrealtre articolazioniarticolazioni eded estremaestremaipersensibilita’ipersensibilita’ articolarearticolare .. AutosomicaAutosomica recessivarecessiva causatacausata dada mutazionimutazioni nelnel genegene perperlala ProcollageneProcollagene peptidasipeptidasi responsabileresponsabile deldel processamentoprocessamento extracellulareextracellulare deldelcollagenecollagene

Ipersensibilita’ delle articolazioni

TIPOTIPO IXIX:: RECESSIVA X-LINKED cute lassa, diverticoli e rottura della vescica edeformita’ scheletriche . Colpisce gravemente i soggetti di sesso maschile . E’causata da un difetto del metabolismo del rame. ( L’attivita’ della lisil idrossilasi e’coadiuvata dal rame)

Sindrome di Ehlers-Danlos

RECESSIVE

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L L

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