La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle...

Sommario

La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni

sulla fitness Misurazione della barriera genetica

In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci

Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con

epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera

della combinazione

Sommario

La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle

mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica




della combinazione

Selezione dei mutanti resistenti

VARIBILITA' NATURALE

ESITO DELLA PRESSIONE SELETTIVA

Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza

La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di

replicazione del virus (fitness)

Devono essere selezionate una o

più mutazioni perché il virus non

sia bloccato dal farmaco (fenotipo

resistente)


Bassa barriera genetica

Barriera genetica

intermedia

Elevata barriera genetica

Virus resistente, terapia non più

efficace

Virus sensibile, terapia efficace







resistente)

Il bias di selezione fra transizioni e trasversioni

A

G

C

T,U

Purine

Pirimidine

trasversione

transizione

Le transizioni sono evolutivamente favorite rispetto alle trasversioni

Virus Rapporto transizione : trasversione

HIV 1.5:1

HCV 50:1

Il bias di ipermutazione G → A Il sistema cellulare APOBEC3 induce

mutazioni G → A in HIV come meccanismo di difesa (genetic meltdown) HIV ostacola questo meccanismo bloccando

APOBEC3 mediante la propria proteina “accessoria” Vif

Le transizioni G → A sono quindi favorite

Ipermutazione G → A

Ipermutazione G → AE138K: GAG → AAG M184I: ATG → ATA

Mutazioni di resistenza a Rilpivirina nei trial ECHO & THRIVE

Kulkarni, IHDRW 2011

M184I diminuisce la suscettibilità a Rilpivirina più di M184V

Kulkarni, JAIDS 2012







resistente)

Fitness dei mutanti virali

La fitness di una variante è definita dalla sua capacità di contribuire alla successiva generazione

La fitness è sempre funzione delle condizioni in cui la variante virale si moltiplica (es. variabili correlate ai farmaci e alla risposta immunitaria)

Le diverse varianti competono fra di loro con esiti dipendenti dalle condizioni esterne

Misurazione della fitness in vitro

La fitness di un mutante può essere misurata in vari tipi di sistemi virus-cellula in vitro

Non c’è un gold standard di metodo riconosciuto

http://bis.urmc.rochester.edu:8080/HIVViralFitness/

Pressione farmacologica

Sospensione / cambio terapia

Virus wild type

La cinetica di decadimento dei mutanti off-therapy come indice della fitness in vivo

Fast disappearance

Prolonged persistence

T20-resistance (HR1)

Most major PI mutations

65R 74V 184V

TAMs Most minor PI mutations

NNRTI mutations

RT 215 “revertants”

R5 → X4 Tropism switch

IN mutations

La cinetica di decadimento dei mutanti off-therapy come indice della fitness in vivo

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della combinazione

Misurazione dell'attività antivirale in vitro(IC = Inhibitory Concentration)

IC50, dose di farmaco che inibisce del 50% la produzione di virus Valore meno corrispondente alla reale inibizione ma misurazione più accurata (usato spesso)

IC90, dose di farmaco che inibisce del 90% la produzione di virus Valore più corrispondente alla reale inibizione ma misurazione poco accurata (usato raramente)

La terapia ha selezionato una variante virale farmacoresistente

TMC114: an increased genetic barrier to the development of resistance in vitro

De Meyer S, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49: 2314-21.De Meyer S, et al. XV IHDRW, 2006, Poster 19.

Time (days)

Incr

ease

i n P

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on

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a tio

n

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 100 300 500 700 900 1100

TMC114 (R41T, K70E)

RTV (G16E, M46I, V82F, I84V)SQV (G48V, A71V, G73S, I84V, L90M)NFV (L10F, D30N, R41K, K45I, M46I, V77I,

I84V, N88D)

APV (L10F, V32I, L33F, M46I, I47V, I50V)LPV (L10F, L23I, M46I, I50V, I54V, L63P, V82A)TPV (L33V, M46L, V82T)ATV (L10F, V32I, M46I, I62V, A71V, I84V, N88S)

Viru

s b

rea

kth

rou

gh

(%

)

Days post-infection0 4 8 11 15 18 21 24 27 31

0

20

40

60

80

100

NVP (1µM)

EFV (1µM)

Control

TMC125 (1µM)

TMC125 (0.2µM)

TMC125 suppresses the in vitro selection of resistant HIV-1 from wild-type, suggesting an increased genetic barrier to the development of HIV drug resistance

Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773-82

Selezione di resistenza in vitro a NVP, EFV, ETV a partire da wild type

Azijn, AAC 2010

Selezione di resistenza in vitro a RPV

Starting from wild type HIV (IIIB)

La barriera genetica verso la resistenza in vitro è più elevata per dolutegravir ripetto a raltegravir

Seki, CROI 2010

Barriera genetica dei singoli antiretrovirali

DRV/rtv TPV/rtv

Altri PI/rtv

NRTI non XTC / ETV RPV? / DTG?

RTG EVG?

XTC / NVP EFV / T20

Slow dissociation of DRV as a major contribution to tight binding to HIV protease

Binding affinity of DRV to HIV-1 protease >100-fold higher compared with PIs due to much slower dissociation

Decrease in binding affinity of all PIs on MDR protease mainly caused by increased dissociation rate

In contrast to other PIs, decreases in DRV binding affinity of up to 1000-fold do not compromise antiviral activity

Multiple simultaneous mutations required to make the virus resistant to DRV (i. e. increased genetic barrier)

Dierynck, JV 2007

Model HIV evolution under therapy from longitudinal and cross-sectional sequence

data

For any defined genotype, neighbor mutants can be computed in silico and the

contribution of the expected mutants to resistance can be calculated

Functions weight for probability and expected time for mutants to occur

Probability to remain susceptible to a drug (below a defined phenotypic threshold)

GENETIC BARRIER Altmann et al, AVT 2007

EuResist – Evolutionary engine

Il sistema predittivo bioinformatico della risposta al trattamento EuResist (www.euresist.org) si basa su tre diverse engine, una delle quali calcola la barriera genetica della variante virale

http://www.euresist.org/

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Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni

con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera

della combinazione

The Calculated Genetic Barrier for Antiretroviral DrugResistance Substitutions Is Largely Similar for DifferentHIV-1 Subtypes (van de Vijver et al., JAIDS 2006)Mutation Subtypes with

increased barrier*Subtypes with decreased barrier*

PR I82A C G

PR I82T C G

RT V106M C

RT V108I G

RT V118I G

RT Q151M D F

RT L210W C F G AG

RT P225H A

Based on analysis of 68 A, 1299 B, 209 C, 24 D, 26 F, 86 G, 20 J, 51 AE, 71 AG sequences from drug-naïve individuals

*With respect to subtype B. Example:subB 86% Q151M: CAG ATG (2 transversions)

12% Q151M: CAA ATG (1 transition, 2 transversions)subF 13% Q151M: CAG ATG (2 transversions)

83% Q151M: CAA ATG (1 transition, 2 transversions)

Mutations contributing to resistance to high genetic barrier PIs in different subtypes

The prevalence of TPV-RAMs* in HIV-1 subtype A/E and subtype B. *K20M, E35G, K43T, I47V, I54A/M/V, Q58E, T74P, V82L/T, N83D and I84V were not found (Sungkanuparph, JCV 2007).

Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773–82

Selezione di resistenza in vitro a ETV a partire da Y181C o da K103N

Wild type

Y181C

K103N

Control TMC125 (0.2µM)

TMC125 40nM TMC125 (1µM)

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33

Days post-infection

100

80

60

40

20

0

Viru

s b

rea

kth

rou

gh

(%

)

Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773-82

Selezione di resistenza in vitro a ETV a partire da Y181C + K103N

Azijn, AAC 2010

Selezione di resistenza in vitro a RPV

Reference data on wild type virus

I fallimenti di terapia abbassano la barriera genetica

1st failure

2nd failure

3rd failure

Nth failure


Le mutazioni selezionate dai precedenti regimi terapeutici abbassano la barriera Resistenza

acquisita Resistenza

trasmessa

Risposta virologica a 24 settimane di regime terapeutico contenente Darunavir

nei trial DUET e POWER (pazienti pretrattati con altri PI)


Le mutazioni selezionate dai precedenti regimi terapeutici abbassano la barriera Resistenza

acquisita Resistenza

trasmessa

Escape dalla pressione immunologica

Kent, Trends Microbiol 2005

Impatto delle mutazioni di resistenza sul riconoscimento immunologico

Epitopi B/T possono includere siti di mutazioni di resistenza A seconda dell’aplotipo HLA

del paziente, queste mutazioni possono essere favorite oppure ostacolate dalla pressione selettiva immunologica

Possibili alterazioni della barriera di un farmaco a livello di individuo Ancora un’area di indagine

KMIGGIGGF (KF9) è un epitopo CTL HLA-B*1501-ristretto che comprende diverse mutazioni di resistenza

ai PI (M46I/L, I47A/V, G48V, I50V)

Mueller, JAIDS 2011

Impatto delle mutazioni di resistenza sul riconoscimento immunologico

Epitopi B/T possono includere siti di mutazioni di resistenza A seconda dell’aplotipo HLA

del paziente, queste mutazioni possono essere favorite oppure ostacolate dalla pressione selettiva immunologica

Possibili alterazioni della barriera di un farmaco a livello di individuo Ancora un’area di indagine

Gatanaga, AIDS 2010

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epitopi La barriera del singolo farmaco e la

barriera della combinazione

La terapia combinata rallenta la selezione della resistenza

Resistance to AZT develops quickly

AZT AZT

3TC

IDV

Resistance to whole regimen develops slowly

Monotherapy vs. combination therapy and risk of resistance

Initial resistance (3TC)

Combination therapy (e.g. AZT+3TC+IDV)

AZT

Third step (AZT+3TC+IDV)

Second step (AZT+3TC)

3TC

IDV

AZT

3TC

IDV

AZT

3TC

IDV

Combination therapy and risk of resistance

Initial resistance (3TC)

“Combination” therapy (e.g. AZT+3TC+IDV)

Third step (AZT+3TC+IDV)

Second step (AZT+3TC)

AZT

3TC

IDV

AZT

3TC

IDV

AZT

3TC

IDV

Local ‘dissociation’ of combination therapy: stepwise accumulation of resistance

Combination therapy and risk of resistance

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