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ORMONI STEROIDEI SIERICI in LC/MS – Codice LC72310 (17-OH-Progesterone, Deidroepiandrosterone (DHEA), Deidroepiandrosterone solfato (DHEAS),

Androstenedione, Cortisolo, 11-Deossicortisolo, Corticosterone, Aldosterone, Testosterone, Diidrotestosterone, Androsterone, Estrone, Estradiolo, Pregnenolone, 17-OH-Pregnenolone,

Progesterone, 11-Deossicorticosterone) INTRODUZIONE Ormoni e meccanismi dell'azione ormonale

Il termine “ormone” indica una sostanza che, prodotta da una cellula endocrina, cioè a secrezione interna,

viene liberata nel circolo sanguigno, provocando risposte funzionali in cellule localizzate a varia distanza

dalla sua sede di produzione. Per l'espletamento dell'azione ormonale sono necessari, oltre alla sintesi e alla

secrezione, il trasporto nel circolo sanguigno e la destinazione nei tessuti bersaglio dove sono presenti i

recettori, strutture specializzate che riconoscono lo stimolo specifico e ne traducono il messaggio.

I recettori possono essere sulla membrana della cellula o all'interno di essa; l'ormone che non può

attraversare la membrana (per es., un peptide) si lega a recettori localizzati sulla membrana plasmatica,

mentre quello che diffonde attraverso la membrana plasmatica all'interno della cellula (steroidi, iodotironine)

si lega a recettori intracellulari (in genere situati nel nucleo). Indipendentemente dalla struttura e dal tipo di

ormone, i recettori hanno caratteristiche comuni: tutti presentano una regione in grado di riconoscere e

legare l'ormone e un'altra deputata alla generazione di un segnale intracellulare che traduce il messaggio

ormonale in risposte funzionali della cellula bersaglio; anche le proprietà che regolano il legame dell'ormone

(affinità, specificità, saturabilità, capacità di trasduzione, cioè di evocare effetti specifici) sono comuni per tutti

i recettori.

La comunicazione affidata agli ormoni avviene per la maggior parte attraverso il circolo ematico (azione

endocrina), ma, in parte minore, anche mediante altre modalità. Alcuni ormoni agiscono infatti sulle cellule

immediatamente circostanti la cellula che li produce (azione paracrina); in altre evenienze, invece,

interagiscono con la stessa cellula secretrice (azione autocrina); altri ormoni, infine, vengono prodotti dai

neuroni del sistema nervoso (azione neurocrina, che in realtà rappresenta una forma specializzata di azione

paracrina). Sono stati identificati più di cinquanta ormoni, le cui caratteristiche funzionali vengono

determinate dalla diversa struttura molecolare. In base a questa, essi vengono suddivisi in quattro grandi

categorie: proteine e peptidi; steroidi; derivati dagli amminoacidi; derivati dagli acidi grassi polinsaturi.

Gli ormoni, interagendo con i recettori localizzati a livello dei tessuti bersaglio, evocano risposte specifiche:

regolano le attività enzimatiche, l'espressione genica e la sintesi delle proteine.

Classificazione ormoni steroidei

Sono liposolubili, diffondono liberamente all'interno della cellula ed esercitano la loro azione dopo essersi

legati a recettori localizzati nel nucleo. La loro struttura chimica, che è policiclica, deriva dal colesterolo.

Sono suddivisi, in base alla sede di produzione, in steroidi gonadici e surrenalici; vengono inclusi in questa

categoria anche la vitamina D e i suoi analoghi. Gli ormoni steroidei prodotti dal surrene e dalle gonadi si

dividono in sottogruppi in base al numero di atomi di carbonio del nucleo steroideo: il progesterone, i

glucocorticoidi e i mineralcorticoidi derivano per sintesi successive dal pregnano, una sostanza semplice che

contiene 21 atomi di carbonio, mentre gli estrogeni provengono dal nucleo dell'estrano che ha 18 atomi di

carbonio, e gli androgeni dal nucleo dell'androstano, che contiene 19 atomi di carbonio.

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La sintesi degli ormoni steroidei segue tappe biosintetiche identiche sia nel surrene sia nell'ovaio o nel

testicolo e la differenziazione nelle tre ghiandole endocrine dipende da una diversa distribuzione tessuto-

specifica degli enzimi di sintesi. La steroidogenesi passa attraverso una serie di tappe enzimatiche, in

massima parte catalizzate dagli enzimi citocromo P450 (cP450) localizzati all'interno delle cellule, e inizia

dalla trasformazione del colesterolo in pregnenolone. Questa tappa enzimatica è la più importante in quanto

controlla la sintesi di tutti gli ormoni steroidei; anche in presenza di notevoli quantità di colesterolo, la

possibilità di proseguimento della via biosintetica appare limitata, poiché dipende dall'attività dagli enzimi

cP450. Il pregnenolone formato fuoriesce dal mitocondrio e viene trasferito sul reticolo endoplasmatico, dove

subisce le successive modificazioni enzimatiche da parte dei cP450. Il pregnenolone è quindi il precursore

comune dei principali ormoni steroidei.

Gli androgeni vengono sintetizzati dalle cellule di Leydig del testicolo, dalla zona reticolare del surrene e

dalle cellule della teca del follicolo e dall'interstizio dell'ovaio. La via biosintetica che procede dal

pregnenolone segue due possibili direzioni: la prima via consiste nella trasformazione del pregnenolone in

17-idrossipregnenolone, di questo in deidroepiandrosterone, quindi in androstenediolo, e infine in

testosterone, che è il principale ormone maschile. La seconda via consiste nella trasformazione del

pregnenolone in progesterone, di questo in 17-idrossiprogesterone e quindi nella formazione di

androstenedione, a sua volta successivamente trasformato in testosterone. In alcuni tessuti il testosterone

necessita di un'ulteriore reazione di trasformazione in 5α-diidrotestosterone per esplicare la sua attività. Nel

surrene dove, rispetto al testicolo, vi è una diversa distribuzione degli enzimi che catalizzano queste vie

biosintetiche, la maggior parte della produzione di androgeni surrenali è diretta verso l'elaborazione di

precursori del testosterone e, in maniera particolare, di deidroepiandrosterone e androstenedione, che

hanno un'attività ormonale di più modesta entità. Circa il 50% del pregnenolone metabolizzato nella

corteccia surrenale viene convertito in deidroepiandrosterone.

Gli estrogeni e il progesterone, i principali ormoni femminili, sono gli steroidi prodotti in maggiore quantità

dall'ovaio e sono coinvolti nella regolazione del ciclo mestruale e nella gravidanza. La formazione di questi

steroidi deriva da tappe enzimatiche diversificate nei compartimenti cellulari dell'ovaio: follicoli e cellule

interstiziali. Le cellule della granulosa, che contornano l'ovulo nel contesto del follicolo, subiscono la

trasformazione in cellule luteiniche dopo l'ovulazione e il prodotto della trasformazione del pregnenolone è

rappresentato dal progesterone. Le cellule della teca del follicolo e quelle interstiziali producono in

prevalenza androstenedione attraverso le vie biosintetiche che sono già state descritte per gli androgeni.

Anche le tappe enzimatiche coinvolte nel successivo destino metabolico dell'androstenedione hanno una

caratteristica localizzazione cellulare: infatti il testosterone è sintetizzato solamente nelle cellule dell'ilo,

mentre all'interno delle cellule della granulosa l'androstenedione viene trasformato in testosterone e a sua

volta in estrone e estradiolo. Le cellule interstiziali hanno anche la capacità di trasformare il testosterone in

diidrotestosterone.

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Al contrario degli ormoni peptidici, la secrezione degli steroidi in circolo non procede attraverso un loro

immagazzinamento all'interno delle cellule ma segue immediatamente la sintesi. Essi viaggiano nel plasma

legati a proteine di trasporto specifiche, dotate di alta affinità, quali la globulina legante il cortisolo (CBG,

Cortisol binding protein), le globuline leganti gli steroidi sessuali (SHBG, Sex hormone binding protein) e la

proteina legante la vitamina D (DBP, Vitamin D binding protein). La CBG è una glicoproteina in grado di

legare con uguale affinità cortisolo e progesterone. Le SHGB sono globuline che legano con elevata affinità

il testosterone, mentre l'estradiolo è legato in prevalenza all'albumina. Il 98% degli steroidi gonadici, il 95%

del cortisolo e il 50% dell'aldosterone circolano legati alle rispettive proteine di trasporto. Poiché solo

l'ormone libero è in grado d'interagire con i recettori, e quindi di esprimere l'attività biologica, il legame

plasmatico costituisce un'importante fase di riserva nel metabolismo di questi ormoni. Gli steroidi sintetici

impiegati in terapia solitamente non contraggono legame con le proteine di trasporto e sono quindi in grado

di esercitare effetti biologici immediati. I glucocorticoidi e i mineralcorticoidi vengono metabolizzati attraverso

reazioni enzimatiche che determinano la perdita della loro attività ormonale oppure attraverso coniugazione

con gruppi chimici che li rendono idrosolubili e ne determinano l'eliminazione con le urine. L'unica reazione

metabolica che non si traduce in una perdita dell'attività biologica è rappresentata dalla conversione del

testosterone in diidrotestosterone nelle cellule bersaglio. *

*Bibliografia Enciclopedia della Scienza e della Tecnica (2007) Andreani, Cassano 1977: Andreani, Domenico - Cassano, Cataldo, Trattato italiano di endocrinologia, Roma, SEU, 1977. Becker 1995: Becker, Kenneth L., Principles and practice of endocrinology and metabolism, 2. ed., Philadelphia, Lippincott, 1995 (1. ed.: 1990). Faglia 1998: Faglia, Giovanni, Malattie del sistema endocrino e del metabolismo, 2. ed., Milano, McGraw-Hill, 1998 (1. ed.: 1993). Felig 1995: Felig, Philip - Baxter, John D. - Frohman, Lawrence A., Endocrinology and metabolism, 3. ed., New York, McGraw-Hill, 1995 (1. ed.: 1981). Giusti, Serio 1988: Giusti, Giorgio - Serio, Mario, Endocrinologia, fisiopatologia e clinica, Firenze, USES, 1988. Pinchera 1991: Pinchera, Aldo e altri, Endocrinologia e metabolismo. Fisiopatologia e clinica, Milano, Ambrosiana, 1991. Williams 1998: Williams, Robert H., Williams textbook of endocrinology, 9. ed., edited by Jean D. Wilson e altri, Philadelphia-London, Saunders, 1998 (1. ed.: 1950).

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Schema della via biosintetica

Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE del 27/10/1998 e del Dl.ivo n.332 del 08/09/2000 sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta.

Release N° 004 Ormoni steroidei sierici in LC/MS Febbraio 2015

EUREKA srl – LAB DIVISION VAT N° 01547310423 E-mail:info@eurekaone.com www.eurekaone.com

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CARATTERISTICHE DEL METODO

Principio del Metodo: Gli Ormoni steroidei vengono deproteinizzati con un opportuno reagente contenente lo standard interno, centrifugati, essiccato il surnatante che poi viene ripreso con opportuna soluzione prima di venire iniettato in LC/MS. Recupero del Metodo : 100%

Sensibilità del Metodo (LLOD) : 17-OH-Progesterone 0,005 ng/ml ESI

Androstenedione 0,005 ng/ml ESI DHEAS 10 ng/ml ESI DHEA 0,05 ng/ml ESI Testosterone 0,002 ng/ml ESI Cortisolo 0,005 ng/ml ESI Corticosterone 0,05 ng/ml APCI Aldosterone 0,01 ng/ml APCI 11-Deossicortisolo 0,007 ng/ml ESI Diidrotestosterone 0,03 ng/ml APCI Androsterone 0,05 ng/ml APCI Estrone 0,03 ng/ml ESI Estradiolo 0,01 ng/ml APCI Pregnenolone 0,02 ng/ml ESI 17-OH-Pregnenolone 0,02 ng/ml APCI Progesterone 0,002 ng/ml ESI 11-Deossicorticosterone 0,007 ng/ml ESI

Sensibilità del Metodo (LLOQ) :

ESI 17-OH-Progesterone 0,02 ng/ml Androstenedione 0,016 ng/ml DHEAS 15 ng/ml DHEA 0,1 ng/ml Testosterone 0,006 ng/ml Cortisolo 0,015 ng/ml Corticosterone 0,036 ng/ml Aldosterone 0,02 ng/ml 11-Deossicortisolo 0,02 ng/ml Diidrotestosterone 0,08 ng/ml Androsterone 0,13 ng/ml Estrone 0,01 ng/ml Estradiolo 0,01 ng/ml Pregnenolone 0,06 ng/ml 17-OH-Pregnenolone 0,06 ng/ml Progesterone 0,005 ng/ml 11-Deossicorticosterone 0,02 mg/ml

APCI 17-OH-Progesterone 0,08 ng/ml Androstenedione 0,05 ng/ml DHEAS 35 ng/ml DHEA 0,27 ng/ml Testosterone 0,04 ng/ml Cortisolo 3,5 ng/ml Corticosterone 0,16 ng/ml Aldosterone 0,04 ng/ml 11-Deossicortisolo 0,07 ng/ml Diidrotestosterone 0,08 ng/ml Androsterone 0,13 ng/ml Estrone 0,1 ng/ml Estradiolo 0,03 ng/ml Pregnenolone 0,06 ng/ml 17-OH-Pregnenolone 0,06 ng/ml Progesterone 0,5 ng/ml 11-Deossicorticosterone 0,23 mg/ml

Range di Linearità : 17-OH-Progesterone 0,02 – 570 ng/ml ESI

Androstenedione 0,016 - 1060 ng/ml ESI DHEAS 0,15 – 852.900 ng/ml ESI DHEA 0,1 - 500 ng/ml ESI Testosterone 0,006 - 260 ng/ml ESI Cortisolo 0,015 – 3.020 ng/ml ESI Corticosterone 0,16 – 3.020 ng/ml APCI Aldosterone 0,04 – 560 ng/ml APCI 11-Deossicortisolo 0,02 – 250 ng/ml ESI Diidrotestosterone 0,08 – 1.630 ng/ml APCI Androsterone 0,13 – 2.200 ng/ml APCI Estrone 0,01 - 510 ng/ml ESI Estradiolo 0,03 - 510 ng/ml APCI Pregnenolone 0,06 - 64 ng/ml ESI 17-OH-Pregnenolone 0,06 - 250 ng/ml APCI Progesterone 0,005 – 4.000 ng/ml ESI 11-Deossicorticosterone 0,02 – 6.000 ng/ml ESI

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ANALITA Precisione intra-giorno Precisione inter-giorno (CV%) (CV %) Calibratore Calibratore Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore

17-OH-Progesterone ESI 10,6% 4,5% 3,7% 9,0% 4,8% 3,9% Androstenedione ESI 5,7% 5,1% 4,6% 8,2% 6,1% 6,3%

DHEAS ESI 9,1% 8,4% 4,0% 9,2% 6,8% 3,3% DHEA ESI 10,2% 3,3% 1,3% 11,5% 6,1% 5,3%

Testosterone ESI 4,7% 2,1% 3,6% 5,2% 4,8% 3,0% Cortisolo ESI 2,3% 2,0% 0,8% 9,0% 3,9% 1,4%

Corticosterone APCI 7,3% 8,0% 4,4% 8,1% 7,9% 4,1% Aldosterone APCI 11,0% 4,2% 3,5% 13,2% 7,7% 3,2%

11-Deossicortisolo ESI 11,4% 6,0% 4,9% 12,4% 5,0% 4,5% Diidrotestosterone APCI 8,7% 7,0% 1,8% 11,1% 5,9% 3,5%

Androsterone APCI 14,5% 3,1% 2,8% 17,4% 3,8% 2,8% Estrone ESI 3,5% 2,2% 1,4% 3,0% 3,5% 2,4%

Estradiolo APCI 9,3% 3,9% 3,0% 7,8% 6,5% 2,7% Pregnenolone ESI 12,8% 7,8% 5,1% 11,6% 9,1% 4,5%

17-OH-Pregnenolone APCI 9,3% 6,3% 1,0% 8,0% 6,3% 2,4% Progesterone ESI 5,9% 3,9% 2,2% 5,9% 4,1% 3,3%

11-Deossicorticosterone ESI 10,1% 4,5% 4,3% 11,9% 7,6% 6,7%

ANALITA R2

17-OH-Progesterone ESI 0,9979 + 0,0026 Androstenedione ESI 0,9943 + 0,0007

DHEAS ESI 0,9967 + 0,0004 DHEA ESI 0,9952 + 0,0003

Testosterone ESI 0,9980 + 0,0007 Cortisolo ESI 0,9932 + 0,0064

Corticosterone APCI 0,9968 + 0,0020 Aldosterone APCI 0,9970 + 0,0014

11-Deossicortisolo ESI 0,9971 + 0,0004 Diidrotestosterone APCI 0,9957 + 0,0034

Androsterone APCI 0,9962 + 0,0026 Estrone ESI 0,9972 + 0,0016

Estradiolo APCI 0,9946 + 0,0049 Pregnenolone ESI 0,9951 + 0,0051

17-OH-Pregnenolone APCI 0,9986 + 0,0016 Progesterone ESI 0,9981 + 0,0001

11-Deossicorticosterone ESI 0,9926 + 0,0086

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ANALITA Accuratezza intra-giorno Accuratezza inter-giorno (Errore %) (Errore %) Calibratore Calibratore

Basso

Alto Basso Alto

17-OH-Progesterone ESI 16,4% 7,6% 13,7% 7,8% Androstenedione ESI 8,1% 2,8% 11,0% 7,1%

DHEAS ESI 12,9% 4,0% 13,6% 4,2% DHEA ESI 9,0% 3,9% 9,0% 5,5%

Testosterone ESI 7,3% 4,1% 7,6% 4,4% Cortisolo ESI 5,4% 2,2% 6,5% 2,7%

Corticosterone APCI 7,4% 5,3% 11,2% 5,3% Aldosterone APCI 7,1% 3,8% 10,2% 5,1%

11-Deossicortisolo ESI 4,5% 3,1% 5,1% 3,9% Diidrotestosterone APCI 7,0% 4,7% 7,0% 2,9%

Androsterone APCI 6,5% 3,9% 12,9% 5,5% Estrone ESI 6,4% 3,6% 6,8% 4,2%

Estradiolo APCI 6,8% 4,5% 8,6% 5,1% Pregnenolone ESI 9,9% 3,1% 12,1% 4,5%

17-OH-Pregnenolone APCI 4,6% 4,0% 6,9% 4,2% Progesterone ESI 4,4% 2,6% 4,3% 4,0%

11-Deossicorticosterone ESI 11,3% 4,6% 11,5% 5,6%

ANALITA Concentrazioni utilizzate per calcolare Precisione e Accuratezza Calibratore (ng/ml)

Inferiore Basso Medio Alto Superiore

17-OH-Progesterone ESI 0,08 0,09 1,3 7,1 15,5 Androstenedione ESI 0,05 0,1 0,8 4,1 10,6

DHEAS ESI 37,2 96,2 550,5 2.978,6 8.529,0 DHEA ESI 0,27 0,71 5,7 21,6 51,0

Testosterone ESI 0,09 0,1 1,0 6,8 13,9 Cortisolo ESI 3,7 5,7 45,4 305,6 618,7

Corticosterone APCI 0,18 0,4 2,5 15,7 30,2 Aldosterone APCI 0,04 0,05 0,5 3,3 5,6

11-Deossicortisolo ESI 0,07 0,14 0,9 7,2 16,5 Diidrotestosterone APCI 0,08 0,2 1,2 6,6 16,3

Androsterone APCI 0,13 0,2 1,9 10,5 22,2 Estrone ESI 0,03 0,07 0,4 2,5 5,1

Estradiolo APCI 0,03 0,06 0,4 2,8 5,1 Pregnenolone ESI 0,06 0,07 0,33 1,24 2,1

17-OH-Pregnenolone APCI 0,06 0,18 1,1 5,5 16,8 Progesterone ESI 3,0 5,8 42,0 260,1 402,3

11-Deossicorticosterone ESI 0,23 0,7 5,0 28,0 60,0

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Contenuto della confezione (50 tests) :

Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a 2–8 °C.

Reagente A – Soluzione Deproteinizzante, 2 x 25 ml

Reagente B – Soluzione Standard Interni, 1 x 500 µl

Stoccare a –20 °C Vedere Avvertenze

Reagente C – Soluzione Diluente, 1 x 3 ml

Reagente D1 – Calibratore liofilo sierico – Livello 1, 1 x 1 ml

Vedi Avvertenze

Reagente D2 – Calibratore liofilo sierico – Livello 2, 1 x 1 ml

Vedi Avvertenze

Reagente D3 – Calibratore liofilo sierico – Livello 3, 1 x 1 ml

Vedi Avvertenze

Reagente D4 – Calibratore liofilo sierico – Livello 4, 1 x 1 ml

Vedi Avvertenze

Reagente D5 – Calibratore liofilo sierico – Livello 5, 1 x 1 ml

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Reagente D6 – Calibratore liofilo sierico – Livello 6, 1 x 1 ml

Vedi Avvertenze

Reagente M1 – Fase Mobile M1, 1 x 500 ml

Reagente M2 – Fase Mobile M2, 2 x 500 ml

Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento LC-MS triplo quadrupolo ESI+ e/o APCI a

seconda delle molecole che si necessita analizzare Evaporatore a centrifuga

Modalità per il prelievo ematico : Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta con EDTA come anticoagulante. Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Separare il plasma e stoccarlo a – 20 °C. Stabile 4 settimane.

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PROCEDURA ANALITICA IMPORTANTE: NON VANNO USATE PROVETTE O VIALS DI VETRO DURANTE NESSUNO STEP PREPARATIVO. FASE 1 : Ricostituzione del Reagente Deproteinizzante Aggiungere al Reagente A – Sol. Deproteinizzante 250 µl di Reagente B – Sol. Standard interno

(Stabile 3 mesi a - 20 °C) FASE 2 : In provette eppendorf dispensare in sequenza.

Calibratore Campione Controlli

Reagente D1-D6 – Calibratore

400 µl

Campione 400 µl Controlli 400 µl Reagente A – Soluzione Deproteinizzante (come ricostituito nella Fase 1)

1000 µl 1000 µl 1000 µl

Deproteinizzare direttamente sul vortex per 10 secondi

FASE 3 : Centrifugare a 14.000 giri per 10 minuti. FASE 4 : Prelevare il surnatante e portare a secco con l’ausilio di un evaporatore (temperatura massima 55 °C) (stabile 1 mese a – 20 °C) FASE 5 : Aggiungere nelle eppendorf portate a secco 50 µl di Reagente C – Soluzione Diluente

Vortex per 20 secondi

FASE 6 : Centrifugare a 14.000 giri per 5 minuti. FASE 7 : Trasferire il surnatante in vial in polipropilene da 250 µl INIEZIONE :

Iniettare 15 µl della soluzione nel sistema LC

N.B: il campione è stabile 2 giorni a 2-8 °C. Release N° 004 Ormoni steroidei sierici in LC/MS Febbraio 2015

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ORMONI STEROIDEI - Avvertenze

REAGENTE D1-D2-D3-D4-D5-D6 : CALIBRATORI LIOFILI Lot. 006

LIVELLO 1 LIVELLO 2 LIVELLO 3 LIVELLO 4 LIVELLO 5

LIVELLO 6

17-OH-PROGESTERONE (ng/ml) 0,08 0,76 1,3 2,7 5,7 15,5 ANDROSTENEDIONE (ng/ml) 0,05 0,45 0,8 2,1 4,3 10,6 DHEAS (ng/ml) 37,2 499,9 558,5 1.585,3 3.472,3 8.529,0 DHEA (ng/ml) 0,27 4,5 5,7 11,9 20,2 51,0 TESTOSTERONE (ng/ml) 0,09 0,74 1,0 2,6 5,4 13,9 CORTISOLO (ng/ml) 3,7 33,6 45,4 114,7 244,0 618,7 CORTICOSTERONE (ng/ml) 0,18 1,65 2,5 6,2 11,9 30,2 ALDOSTERONE (ng/ml) 0,04 0,3 0,5 1,0 2,5 5,6 11-DEOSSICORTISOLO (ng/ml) 0,07 0,6 0,9 2,5 6,0 16,5 DIIDROTESTOSTERONE (ng/ml) 0,08 0,9 1,2 3,1 5,6 16,3 ANDROSTERONE (ng/ml) 0,13 1,37 1,9 5,1 7,6 22,2 ESTRONE (ng/ml) 0,01 0,09 0,16 0,4 0,8 2,1 ESTRADIOLO (ng/ml) 0,03 0,3 0,4 1,1 2,0 5,1 PREGNENOLONE (ng/ml) 0,06 0,19 0,33 0,64 1,16 2,1 17-OH-PREGNENOLONE (ng/ml) 0,06 0,75 1,1 2,7 5,3 16,8 PROGESTERONE (ng/ml) 3,0 30,0 42,0 110,0 213,7 402,3 11-DEOSSICORTICOSTERONE (ng/ml)

0,23 3,3 5,0 11,6 26,0 60,0

Modalità d’uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema LC. Aggiungere esattamente 1 ml di H2O di grado HPLC e agitare delicatamente per 30 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l’omogeneità.

Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se conservati a 2-8 °C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 – 8 °C e 6 mesi a – 20 °C. Non usarli dopo la data di scadenza.

Confezionamento : 6 x 1 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo.

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REAGENTE B – SOLUZIONE STANDARD INTERNI:

Soluzione contenente: Aldosterone-d7, Cortisolo-d4, Testosterone-d3. Stoccare a – 20 °C. Ormoni: Standard interno da utilizzare per la calibrazione: ANDROSTENEDIONE Testosterone-d3 DHEAS Testosterone-d3 DHEA Testosterone-d3 TESTOSTERONE Testosterone-d3 DIIDROTESTOSTERONE Testosterone-d3 ANDROSTERONE Testosterone-d3 ESTRONE Testosterone-d3 ESTRADIOLO Testosterone-d3 PROGESTERONE Aldosterone-d7 11-DEOSSICORTICOSTERONE Aldosterone-d7 CORTICOSTERONE Aldosterone-d7 ALDOSTERONE Aldosterone-d7 11-DEOSSICORTISOLO Cortisolo-d4 PREGNENOLONE Cortisolo-d4 17-OH-PREGNENOLONE Cortisolo-d4 CORTISOLO Cortisolo-d4 17-OH-PROGESTERONE Cortisolo-d4

CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA

Installare la colonna analitica nuova RRHD Eclipse Plus C18 (50 x 2,1 mm, 1,8 um), termostatata a 90 °C Disconnettere il detector e far passare una soluzione di Acetonitrile : Acqua (95 : 5 v/v) al flusso di 600 ul / minuto per 15 minuti. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con una soluzione di Fase Mobile M1 : Acqua (85 : 15 v/v) al flusso di 600 ul / minuto per 15 minuti. Effettuare due iniezioni di Acqua di grado HPLC prima di procedere con la serie analitica.

NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è 25°C si consiglia di conservare a 2-8°C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l’altra.

PULIZIA DELLA COLONNA

Lavare con una soluzione contenente Fase Mobile M2 : Acqua (95 : 5 v/v) al flusso di 600 ul / minuto per 15 minuti. La colonna va stoccata in una soluzione contenente Fase Mobile M2 : Acqua (95 : 5 v/v).

LAVAGGIO AGO DI INIEZIONE

Lavare con una soluzione contenente Metanolo.

12

PARAMETRI SETTATI SU TRIPLO QUADRUPOLO AGILENT 6460 Parametri ESI 6460

Gas Temperature 290 °C Gas Flow 11 L/min Nebulizer 60 psi Sheath Gas Heater 400 °C Sheath Gas Flow 12 L/min Capillary 4500 V

Parametri APCI 6460

Gas Temperature 325 °C APCI heater 500 °C Gas Flow 8 L/min Nebulizer 40 psi Capillary 4500 V

SETTAGGIO DEI FLUSSI

GRADIENTE

Tempo (min)

% M1 (POMPA A)

% M2 (POMPA B)

Flusso (µl/min)

0

85 15 600

0.25

85 15 600

0.50

75 25 600

1.70

71.5 28.5 600

3.80

60 40 600

4.20

50 50 600

5.00

5 95 600

5.50 5

95 600

5.60

85 15 600

7.00 85 15

600

13

Frammentazioni (ottimizzate su TRIPLO QUADRUPOLO AGILENT 6460)

Analita Q1 Q3 ENERGIA DI COLLISIONE

17-OH-Progesterone * 331 109 32

Androstenedione 271,1 109 20

DHEAS** 271,1 253 8

DHEA** 271,1 253 8

Cortisolo 363,1 105,1 44

11-Deossicortisolo 347,1 109 28

Testosterone 289,1 97 25

Corticosterone 347,1 97,1 36

Aldosterone 361,1 109 40

Diidrotestosterone 273,1 255 8

Androsterone 273,1 161 20

Estrone** 271,1 253 8

Estradiolo 255 159,1 16

Pregnenolone 299,1 85,1 8

17-OH-Pregnenolone 297,1 105,1 36

Progesterone 315,1 97 20

11-Deossicorticosterone* 331 97 28

* ** LE MOLECOLE CONTRASSEGNATE DALLO STESSO NUMERO DI ASTERISCHI HANNO LE MEDESIME TRANSIZIONI, PERTANTO VA POSTA ATTENZIONE AI TEMPI DI RITENZIONE ACCESSORI E CONSUMABILI

CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE LC72316 Calibratore sierico per Ormoni Steroidei 6 x 2 x 1 ml LC72317 Controllo sierico per Ormoni Steroidei – Livello 1 5 x 1 ml LC72318 Controllo sierico per Ormoni Steroidei – Livello 2 5 x 1 ml LC72319 Controllo sierico per Ormoni Steroidei – Livelli 1 e 2 2 x 5 x 1 ml SK72310 Starter kit Ormoni Steroidei 1 Pz

Z959757902 Colonna analitica RRHD Eclipse Plus C 18 (50 x 2.1 mm. 1.8 um) 1 Pz S29057U Vial di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 100 Pz S24722 Riduttori di volume in polipropilene per vials da 2 ml 1 x 100 Pz

14

BIBLIOGRAFIA: Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography-thermospray mass spectrometry using stable isotope dilution Hiromi Shibasaki, Takashi Furuta, Yasuji Kasuya Steroid Hormone Analysis by Tandem Mass Spectrometry Steven J. Soldin and Offie P.Soldin Quantification of anabolic hormones and their metabolites in bovine serum and urine by liquid chromatography-tandem mass spectroscophy R. Draisci, L. Palleschi, E. Ferretti, L.Lucentini, P. Cammarata Identification of ten corticosteroids in human hair by liquid chromatography-ionspray mass spectrometry V. Cirimele, P.Kintz, J.P. Goullè, B. Ludes A Confirmatory HPLC-MS/MS Method for Ten Synthetic Corticosteroids in Bovine Urines, JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY S. Rhea Savu, L. Silvestro, A. Haag and F. Sorgel, VOL. 31, 1351-1363 (1996). Automated solid-phase extraction for concentration and clean-up of female steroid hormones prior to liquid chromatography–electrospray ionization–tandem mass spectrometry. B. Alvarez Sanchez, F. Priego Capote, J. Ruiz Jimenez, M.D. Luque de Castro. An approach to lipidomics, Journal of Chromatography A, 1207 (2008) 46–54. Detection, quantification and confirmation of anabolic steroids in equine plasma by liquid chromatography and tandem mass spectrometry Fuyu Guan, Cornelius E. Uboh, Lawrence R. Soma, Yi Luo, Jeffery Rudy, Thomas Tobin., Journal of Chromatography B, 829 (2005) 56–68. Liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometric analysis of corticosterone in rat plasma using selected ion monitoring, Ashok Marwah, Padma Marwah, Henry Lardy. Journal of Chromatography B, 757 (2001) 333–342. Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography–thermospray mass spectrometry using stable isotope dilution, Ashok Marwah, Padma Marwah, Henry Lardy, Journal of Chromatography B, 692 (1997) 7–14

15

ORMONI STEROIDEI SIERICI ( Cromatogrammi di Riferimento, Calibratore livello 3 )

TESTOSTERONE PROGESTERONE ESTRADIOLO

2x10

-0.1

-0.075

-0.05

-0.025

0

0.025

0.05

0.075

0.1

0.125

0.15

0.175

0.2

0.225

0.25

0.275

0.3

0.325

0.35

0.375

0.4

0.425

0.45

0.475

0.5

0.525

0.55

0.575

0.6

0.625

0.65

0.675

0.7

0.725

0.75

0.775

0.8

0.825

0.85

0.875

0.9

0.925

0.95

0.975

1

1.025

1.05

1.075

1.1Cpd 18: TESTOSTERONE-1: +ESI MRM Frag=150.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@20.0 (289.1000 -> 109.1000) K6-2.d

3.930

Counts (%) vs. Acquisition Time (min)3.75 3.8 3.85 3.9 3.95 4 4.05 4.1 4.15 4.2 4.25 4.3 4.35 4.4 4.45 4.5 4.55 4.6 4.65

2x10

-0.1

-0.075

-0.05

-0.025

0

0.025

0.05

0.075

0.1

0.125

0.15

0.175

0.2

0.225

0.25

0.275

0.3

0.325

0.35

0.375

0.4

0.425

0.45

0.475

0.5

0.525

0.55

0.575

0.6

0.625

0.65

0.675

0.7

0.725

0.75

0.775

0.8

0.825

0.85

0.875

0.9

0.925

0.95

0.975

1

1.025

1.05

1.075

1.1Cpd 26: PROGESTERONE-1: +ESI MRM Frag=150.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@24.0 (315.1000 -> 109.0000) K6-2.d

5.282

Counts (%) vs. Acquisition Time (min)4.65 4.7 4.75 4.8 4.85 4.9 4.95 5 5.05 5.1 5.15 5.2 5.25 5.3 5.35 5.4 5.45 5.5 5.55

2x10

-0.1

-0.075

-0.05

-0.025

0

0.025

0.05

0.075

0.1

0.125

0.15

0.175

0.2

0.225

0.25

0.275

0.3

0.325

0.35

0.375

0.4

0.425

0.45

0.475

0.5

0.525

0.55

0.575

0.6

0.625

0.65

0.675

0.7

0.725

0.75

0.775

0.8

0.825

0.85

0.875

0.9

0.925

0.95

0.975

1

1.025

1.05

1.075

1.1Cpd 20: ESTRADIOLO-1: +ESI MRM Frag=100.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@16.0 (255.1000 -> 159.0000) K6-2.d

3.966

Counts (%) vs. Acquisition Time (min)3.75 3.8 3.85 3.9 3.95 4 4.05 4.1 4.15 4.2 4.25 4.3 4.35 4.4 4.45 4.5 4.55 4.6 4.65

16

ORMONI STEROIDEI SIERICI

( Cromatogrammi di Riferimento, Calibratore livello 3 )

CORTISOLO ANDROSTENEDIONE 11-DEOSSICORTICOSTERONE e 17-OH-PROGESTERONE

2x10

-0.1

-0.075

-0.05

-0.025

0

0.025

0.05

0.075

0.1

0.125

0.15

0.175

0.2

0.225

0.25

0.275

0.3

0.325

0.35

0.375

0.4

0.425

0.45

0.475

0.5

0.525

0.55

0.575

0.6

0.625

0.65

0.675

0.7

0.725

0.75

0.775

0.8

0.825

0.85

0.875

0.9

0.925

0.95

0.975

1

1.025

1.05

1.075

Cpd 5: CORTISOLO-1: +ESI MRM Frag=100.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@48.0 (363.1000 -> 105.1000) K6-2.d

2.124

Counts (%) vs. Acquisition Time (min)1.75 1.8 1.85 1.9 1.95 2 2.05 2.1 2.15 2.2 2.25 2.3 2.35 2.4 2.45 2.5 2.55 2.6 2.65

2x10

-0.1

-0.075

-0.05

-0.025

0

0.025

0.05

0.075

0.1

0.125

0.15

0.175

0.2

0.225

0.25

0.275

0.3

0.325

0.35

0.375

0.4

0.425

0.45

0.475

0.5

0.525

0.55

0.575

0.6

0.625

0.65

0.675

0.7

0.725

0.75

0.775

0.8

0.825

0.85

0.875

0.9

0.925

0.95

0.975

1

1.025

1.05

1.075

1.1Cpd 22: ANDROSTENEDIONE-1: +ESI MRM Frag=150.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@20.0 (287.1000 -> 109.0000) K6-2.d

4.311

Counts (%) vs. Acquisition Time (min)4.05 4.1 4.15 4.2 4.25 4.3 4.35 4.4 4.45 4.5 4.55 4.6 4.65 4.7 4.75 4.8 4.85 4.9 4.95

2x10

-0.1

-0.075

-0.05

-0.025

0

0.025

0.05

0.075

0.1

0.125

0.15

0.175

0.2

0.225

0.25

0.275

0.3

0.325

0.35

0.375

0.4

0.425

0.45

0.475

0.5

0.525

0.55

0.575

0.6

0.625

0.65

0.675

0.7

0.725

0.75

0.775

0.8

0.825

0.85

0.875

0.9

0.925

0.95

0.975

1

1.025

1.05

1.075

1.1Cpd 15: 17 OH PROGESTERONE-11 DEOSSICORTICOSTERONE -1: +ESI MRM Frag=150.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@32.0 (331.0000 -> 109.…

4.181

4.567

Counts (%) vs. Acquisition Time (min)3.6 3.7 3.8 3.9 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5 5.1 5.2 5.3 5.4

17

Ormoni Tempi di ritenzione

Min Aldosterone 1.80 Androstenedione 4.34 Androsterone 5.26 Corticosterone 2.99 Cortisolo 2.10 11-Deossicortisolo 3.15 11-Deossicorticosterone 4.20 DHEA 4.0 DHEAS 4.55 Diidrotestosterone 5.16 Estradiolo 4.0 Estrone 4.45 17-OH-Pregnenolone 5.26 17-OH-Progesterone 4.60 Pregnenolone 4.90 Progesterone 5.26 Testosterone 3.93