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LA VALIDAZIONE DEIMETODI ANALITICI

Graziano BonacchiARPAT

Agenzia regionale protezione ambientale della Toscana

Ancona 27 ottobre 2003

Validazione dei metodi ed incertezza di misura nei laboratori di prova:le linee guida della Agenzie Ambientali.

Graziano Bonacchi 2Ancona 27 ottobre 2003

Il Gruppo di lavoro ANPA - ARPA-APPA ha ritenutoutile proporre le Linee Guida sulla “ Validazione deimetodi ” e sulla “Stima dell’incertezza di misura”, dopoaver verificato che è condivisa l’esigenza di avereriferimenti comuni per affrontare questi temi , dasempre all’attenzione degli operatori delle Agenzieimpegnati nell’attività di prova, che devonoconfrontare i risultati con “ limiti di legge ” o produrrevalutazioni sui fattori di pressione e di rischioambientale supportate dalla qualità e dallaconfrontabilità dei dati ottenuti in laboratorio.


Il Gruppo di lavoro si è proposto come obiettivo quellodi tracciare delle linee guida generali, e di evidenziarele eventuali criticità nell’applicazione della metodologiadi validazione , che comprende evidentemente la stimadell’incertezza.

Le linee guida non trattano il tema del campionamento ,primario e secondario , e quindi non considerano“nel budget” dell’incertezza i contributi di questeimportanti e critiche fasi di prova.

La recente costituzione del Laboratorio di metrologia inAPAT consentirà di concertare il lavoro anche suquesti obiettivi.


La necessità di applicare la nuova norma UNI CEI ENISO/IEC 17025 :2000 “Requisiti generali per lacompetenza dei laboratori di prova e taratura”, perottenere l’accreditamento delle prove , previsto neiprogrammi di tutte le Agenzie, ha senz’altro contribuitoad alzare il livello dell’attenzione dei Responsabili deilaboratori e dei Direttori Generali delle Agenzie stesse.

D’altra parte , su questi temi , negli ultimi anni , sonostate prodotte Linee Guida da tutti i più importantiorganismi internazionali ed è anche aumentata laproduzione di articoli e pubblicazioni apparsi inqualificate riviste scientifiche nazionali ed internazionali


• Manuale UNICHIM 179/0 (Ed. 1999) “Linee guida per la validazione dei metodi analitici”

• Manuale UNICHIM 179/1 (Ed.2001) “Valutazione della precisione(ripetibilità) di un metodo analitico”• Manuale UNICHIM 197 (Ed.2003) Guida alla scelta ed all’uso dei materiali di riferimento”• EURACHEM/CITAC Guide (Ed.2000) “Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement”.

• IUPAC,ISO,AOAC International - TECHNICAL REPORT “ Harmonised guidelines for single-laboratory validation of analysis” ( Resulting from Symposium Budapest 1999 and published Pure Appl.Chem 74,pp835-855,2002).

• FAO / IAEA Training &Reference centre (1997) “Guidelines for single –laboratory validation of analytical methods for trace-level concentrations of organic chemicals”


La validazione di metodi dentro il processo di pianificazione/progettazione di un servizio.

La ISO 17025 prevede non solo che i metodi sviluppati dallaboratorio “devono essere validati in modo appropriato primadell’ uso” , ma anche che la loro introduzione nell’uso “ deveessere un’attività pianificata e deve essere affidata apersonale qualificato con risorse adeguate”

La validazione dei metodi : Conferma , sostenuta da evidenzeoggettive che i requisiti relativi ad una specifica utilizzazione oapplicazione prevista sono stati soddisfatti


La validazione dei metodi , oltre a costituire un processo tecnico, èanche un processo di sistema qualità , i cui requisiti sono definitidalla norma UNI EN ISO 9001:94 .La ISO 17025, al punto 1.6 , richiede infatti che i laboratori devonooperare “ secondo un sistema qualità per le loro attività di prova e ditaratura che soddisferà anche i requisiti della ISO 9001, quandocomprendono la progettazione/sviluppo di nuovi metodi ….”

La norma UNI EN ISO 9001:94 prevede ( punto 4.4) che la progettazionedi qualsiasi prodotto o servizio ( e quindi anche la progettazione di unnuovo metodo di prova) parta dall’esame delle richieste del cliente( nelcaso dei laboratori pubblici di controllo , molto spesso, il cliente è illegislatore) e si sviluppi attraverso diverse fasi :- pianificazione;- definizione delle interfaccie organizzative e tecniche;- riesame della progettazione;- verifica, validazione;- modifiche della progettazione.


Fasi della pianificazione della progettazione del metodo.

La validazione di un metodo interno, così come la verificadell’applicabilità di un metodo normalizzato nell’uso del laboratoriofa parte di un processo che si sviluppa attraverso le seguenti fasicoordinate dal responsabile dell’attività di prova:

richiesta di introduzione/modifica di un metodo prova studio di fattibilità approvazione dello studio di fattibilità stesura del metodo sperimentazione (validazione metodo interno o verifica di applicabilità metodo

normalizzato) stesura del rapporto finale approvazione del metodo riesame del metodo eventuale rivalidazione del metodo.


Richiesta di introduzione/modifica del metodo

La richiesta deriva in genere da disposizioni di legge , ma può esserepromossa anche da organizzazioni pubbliche e/o private o da singoliclienti privati e può provenire anche dall’interno dell’Agenzia sia da partedi operatori impegnati in compiti di controllo territoriale istituzionale siadagli stessi operatori tecnici impegnati nell’attività di prova.La richiesta può essere motivata per:•estendere / modificare il campo di applicazione,•estendere/ modificare il campo di misura,•modificare / integrare i parametri qualità del metodo,•determinare un nuovo analita mai ricercato nella matrice/ matrici indicatenel metodo, •determinare un analita già ricercato, ma in una diversa matrice,•apportare modifiche a metodi (normalizzati e non) impiegati per ladeterminazione di uno o più analiti,•utilizzare tecniche diverse.


Il responsabile dell’attività di prova , dopo aver valutatoed accettato le richieste, deve assumere o assegnare adun collaboratore qualificato, il compito e la responsabilitàdi pianificare le attività di progetto relative alle diversefasi.

Il responsabile della pianificazione deciderà a chiassegnare i compiti di ogni fase ed informerà ilResponsabile della Garanzia della Qualità sull’andamentodell’intero processo.


Studio di fattibilità

Lo studio ha come presupposto la definizione dei requisiti che il metododeve avere per garantire il soddisfacimento della richiesta, anche inrapporto ai tempi ed ai costi.

Il responsabile dello studio deve verificare l’esistenza di metodinormalizzati adeguati e , in questo caso, valutare se propornel’impiego oppure proporre, sulla base di motivazioni documentate, disviluppare un metodo interno,

Lo studio di fattibilità deve comprendere anche una valutazione relativaalla sicurezza ed alla compatibilità ambientale.

Approvazione dello studio di fattibilità

Il responsabile dell’attività di prova approva lo studio congiuntamenteal responsabile del laboratorio


Stesura e sperimentazione del metodo di prova scelto

Tutti i metodi di nuova introduzione nell’uso di laboratorio, sianormalizzati che interni, devono essere sperimentati.

La sperimentazione deve prevedere le seguenti fasi:• controllo dello stato di manutenzione e taratura delle apparecchiature;• informazione e formazione degli operatori tecnici , sulle caratteristichedel metodo ( che deve essere consegnato scritto)• verifica , nel caso si tratti di un metodo normalizzato, che il laboratorio èin grado di applicarlo garantendone le prestazioni ( in particolareripetibilità ,riproducibilità ed esattezza). Se il metodo normalizzato nonriporta i parametri di validazione , il laboratorio deve progettare unostudio adeguato ad esprimere il risultato della prova , se richiesto, con ildato dell’incertezza.•verifica preliminare , nel caso sia scelto un metodo interno, della suaspecificità e successivamente degli altri parametri di validazione


Alcune caratteristiche di un metodo :

Limite di rivelabilità

Limite di determinazione o quantificazione

Incertezza

Sensibilità Campo di applicazione

Specificità (Selettività)

Linearità

PrecisioneRipetibilità

Riproducibilità

Campo di misura

Accuratezza

Esattezza Robustezza

Modalità , tipo e limiti della validazione di un metodo possonovariare in ragione all’applicazione , al settore o a quantospecificato in ambito regolamentato , sia esso volontario(es. metodi normati) o cogente (es. metodi ufficiali ).


Classificazione dei metodi analitici secondo UNICHIM (Manuale UNICHIM 179/0:1999 )

Parametro Prove identificazione

Titoli composti principali

Prove rispetto valore fissato

Saggi di purezza quantitativi

Saggi di purezzaal limite

Prove di comportamento

Tipo di prova

Accuratezza

Precisione

Specificità ; recupero

Limite dirivelabilità

Limite di quantificazione

Taratura

Campo di applicazione

Robustezza

* * *

* * * *

* * * * *

* *

*

* * *

* *

* * * * * *


Controllo qualità e riesame dei requisiti del metodo

Il metodo nuovo una volta introdotto nell’uso routinario, deveessere sottoposto al controllo qualità, ad esempio con l’uso dicarte di controllo che consentono di verificare se le prestazioni diprecisione ( ed anche di esattezza) stimate si mantengono neltempo.Il riesame dei metodi deve essere eseguito con periodicitàprogrammata.

Rivalidazione del metodo

La rivalidazione di un metodo interno deve essere eseguita se:• non è impiegato da tempo• vengono introdotte modificazioni significative:


MODIFICHE PARAMETRIAnalista diverso Verifica dell’adeguata qualificazione

(controllo interno della qualità dellaprestazione tramite campioni civettaecc.)

Modifica nella preparazione delcampione (diverso solvente, diversointervallo di concentrazione)

Verifica completa di tutti i parametri divalidazione

Modifica nella preparazione delcampione (stesso solvente, stessointervallo di concentrazione)

Verifica del recupero, esattezza,precisione, robustezza

Variazione dei prodotti e reagenti Specificità, esattezza, precisione

Modifiche strumentale Curva di taratura, precisione, LOD eLOQ


Stesura del rapporto finale della sperimentazione

Il responsabile del progettazione redige il rapporto finale , al quale sonoallegati :•la stesura definitiva del metodo interno o la eventuale proceduraintegrativa che dettaglia il metodo normalizzato•la stesura definitiva delle procedure operative per il controllo e lamanutenzione delle apparecchiature•Il riferimento alle schede di sicurezza relative a reattivi edapparecchiature .

Approvazione ed autorizzazione del metodo di prova

Il metodo di prova (o la procedura integrativa) è approvato dalresponsabile dell’attività di prova ed è autorizzato dal responsabile dellaboratorio.


Validazione di un metodo di prova:requisiti tecnici


PARAMETRI CARATTERISTICI DI UN METODOPARAMETRI CARATTERISTICI DI UN METODOANALITICOANALITICO* Specificit* Specificitàà e selettivit e selettivitàà* Limite di* Limite di rilevabilit rilevabilitàà (LOD) (LOD)* Limite di quantificazione o determinazione (LOQ)* Limite di quantificazione o determinazione (LOQ)* Intervallo di lavoro ed intervallo di linearit* Intervallo di lavoro ed intervallo di linearitàà* Accuratezza (Precisione+esattezza)* Accuratezza (Precisione+esattezza)* Precisione (* Precisione (ripetibilitripetibilitàà e riproducibilit e riproducibilitàà))* Sensibilit* Sensibilitàà* Robustezza* Robustezza* Incertezza* Incertezza* Recupero* Recupero


ACCURATEZZA

Il parametro dell’accuratezza è, quindi, il più importante tra quantivengono impiegati nella valutazione di un metodo d'analisi.

La valutazione dell’accuratezza si basa sul confronto tra il risultatoottenuto applicando il metodo stesso a un campione per la misurazionedi un certo analita e il valore atteso per quell'analita in quel campione.

Il parametro dell’accuratezza è definito in due modi :-grado di accordo tra il risultato di una misurazione e il valore vero delmisurando (VIM) ;

-grado di accordo tra il risultato di un procedimento analitico e il valore diriferimento accettato (IS0 5725:1994 “ Accuracy ( trueness and precision)of measurement methods and results”.


L’accuratezza di un risultato è espressa con la sua incertezza ,definita come l’intervallo di valori entro cui è stimato che ricada , adun definito livello di probabilità (es. p =0,95), il valore delmisurando.Le esigenze del cliente possono essere meglio soddisfatte da datimeno accurati, ma ottenuti con rapidità o a minor costo o conprocedimenti più sicuri per l’operatore e l’ambiente, ma, in ognicaso, l’accuratezza deve essere conosciuta, come richiedeesplicitamente la norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2000.

L’accuratezza dipende dalla combinazione di errori casuali esistematici .


Dalla considerazione appena riportata, nasce l'opportunità diripartire l'esposizione sul parametro accuratezza, come sopradefinito, in due parti:

una riguardante la precisione (ricavataquantitativamente dallo scarto aleatorio)

una riguardante l'accuratezza della media oesattezza (misurata quantitativamente dalloscostamento).


PRECISIONE

Definizione:

“ Grado di accordo tra i risultati indipendenti ottenuti con unprocedimento d’analisi in condizioni ben specificate ”.

Queste condizioni sono individuate da alcuni fattori : metodo, materialeesaminato , laboratorio, operatore, apparecchiatura, sua taratura ,intervallo di tempo tra le prove.

Premesso che il metodo ed il materiale esaminato devono , in ognicaso, essere sempre gli stessi , si possono avere, a seconda dellavariazione degli altri fattori, tre tipi di precisione:

- Ripetibilità stretta o ripetibilità

- Ripetibilità intermedia o riproducibilità intermedia

- Riproducibilità.


• La Ripetibilità stretta o ripetibilità( Sr ) = precisione ottenuta nelle

condizioni in cui tutti i fattori sopra indicati cono mantenuti costanti.

• La Ripetibilità intermedia ( SI ) o riproducibilità intermedia (“ Longterm repeatibility ”) = precisione ottenuta nelle condizioni in cui quattrofattori:

1) operatore,

2) apparecchiatura,

3) taratura,

4) tempi di esecuzione variano con diverse modalità.

• La Riproducibilità ( SR) = precisione ottenuta nelle condizioni in cui ,oltre ai fattori sopra indicati, varia anche il laboratorio.

La riproducibilità è stimabile soltanto da prove interlaboratorio.Rimanendo all’interno del laboratorio è quindi possibile stimaresoltanto la ripetibilità stretta o intermedia.


La precisione di un metodo “ misura” la dispersione dei risultati di proveripetute sullo stesso campione dovuta a fattori casuali.

La distribuzione è assunta di tipo normale o gaussiana e la dispersione“random” intorno al valore medio è misurato dallo scarto tipo di ripetibilità( “standard deviation”) :

( )1

1

2

−

−=

∑=

n

XXS

n

ii

r

Con n = numero delle prove e Xi = valore della prova singola

n

XX

n

ii∑

== 1

Scarto tipo di ripetibilità

Media


Il quadrato dello scarto tipo è la varianza.

Tutte le operazioni relative alla composizione dei diversi contributi delleincertezze ( “ Legge di propagazione degli errori”) devono essereeffettuate sommando le varianze e non gli scarti tipo.

( )1

1

2

2

−

−==

∑=

n

XXSV

n

ii

rr

Con n = numero delle prove e Xi = valore della prova singola

n

XX

n

ii∑

== 1


Lo scarto tipo della media delle n prove di ripetibilità è espressa dallarelazione :

( ) nSS r

mediar =

Il limite di ripetibilità è definito come il parametro con il quale si deveconfrontare la differenza tra dati in doppio ottenuti in condizioni diripetibilità.La definizione vale anche per il limite riferito alle condizioni di ripetibilitàintermedia o riproducibilità).

212 ××=−= rStXXr

212 ××=−= Ii StXXr

212 ××=−= RStXXR

Limite di ripetibilità

Limite di ripetibilitàintermedia

Limite di riproducibilità


Nella relazione del limite di ripetibilità è considerato un fattore dicopertura : il “ t di Student ” che accompagna tutti i calcoli statisticiimpiegati nella gestione dei dati di prova .

2)1;95,0( ××= −== rnp Str ν

Serve una premessa.Lo scarto tipo, ottenuto con un numero elevato di prove documenta chel’oscillazione intorno al valore medio definita dall’intervallo ±1S copre il68% dei dati dentro la distribuzione gaussiana (a due code), mentrel’oscillazione dentro l’intervallo ± 2S copre il 95 % ( vedi slide n.21).Il laboratorio fa riferimento ad un intervallo di fiducia del 95%, , per cui ilvalore di t, se il numero di prove è sufficientemente elevato (diciamon>20), dovrebbe essere 2 ed il limite di riipetibilità diventa :

rr SSr ×=××= 8,222


Inserendo il t di student,il cui valore si trova riportato in tabelle , chefanno riferimento al grado di libertà (ν =n-1) ed al livello di fiducia(“confidence limits”), es . p=0,95, da considerare nel calcolo deirisultato, il laboratorio tiene conto delle correzioni necessarie per il fattoche le n prove eseguite non rappresentano con efficacia la popolazionecampione .Ad esempio , se la ripetibilità è stata stimata con n= 10 prove , il t diStudent per ν = n-1=9 è = 2,26 ed il limite di ripetibilità sarà :

rr SSr ×=××= 2,32 26,2Il t di Student è utilizzato anche nell’espressione dell’intervallo diconfidenza (I.C). stimato per il valore medio delle n prove di ripetibilitàad un livello di fiducia del 95% (p=0,95):

nStXRisultato ×±=


La stima corretta dello scarto tipo di ripetibilità ha una importanza decisivanella gestione dei dati non solo di precisione , ma anche di esattezza e diincertezza.

Il valore dello scarto tipo di ripetibilità stretta dei risultati ottenutiapplicando il metodo, consente di confrontare le prestazioni dellaboratorio con quelle dichiarate nel metodo ufficiale oppure riportate nelladocumentazione di un circuito interlaboratorio od anche definite dallaboratorio stesso come adeguate a “ soddisfare le esigenze del cliente”.

La statistica insegna che il rapporto tra scarto tipo Sr del laboratorio escarto tipo “ target ” indicato con σ è funzione del numero delle prove n :

BSAr

r ≤≤σ


Gradi di libertà ν=n-1 A B1 0.0316 2,2412 0.160 1,9213 0,268 1,7654 0,348 1,6695 0,408 1,6026 0,454 1,5517 0,491 1,5128 0,522 1,4809 0,548 1,45410 0,570 1,43111 0,589 1,41215 0.646 1,35420 0,692 1,30730 0,748 1,251

BSAr

r ≤≤σ

p =0,95

Limite inferiore Limite superiore


IL MODULO STATISTICO 30, disponibile nel CD distribuito opera inautomatico tutti i calcoli necessari a stimare lo scarto tipo di ripetibilità dopoaver controllato l’esistenza di normalità della distribuzione e di “outliers” datianomali operando gli opportuni e previsti test statistici.

Il confronto tra scarti tipo può essere eseguito , sostanzialmente con glistessi risultati, utilizzando il test di Fischer che confronta le varianze :

( )

( )( )95,0;1;12

1min,

2)1max,

=−=−=−=

−= ≤ pmnmr

nr FSS

ννν

ν


La relazione dello scarto tipo di ripetibilità rappresenta un esempio dipropagazione degli errori, ed infatti, se la consideriamo senza fattore dicopertura, possiamo vedere che la differenza tra i due valori ha una incertezzadata dalla somma delle due varianze, che si assumono entrambi uguali a quellastimata con le n prove di ripetibilità

212 ×=−= rSXXr

222rrrdifferenza SSSS =+=

La cosa più importante da considerare e da ricordare è questa:• la relazione, per essere valida, comporta che lo scarto tipo diripetibilità , calcolato, ad esempio, sei mesi prima, sia ancora valido eche, quindi, i risultati delle due prove , eseguite “oggi” appartenganoalla stessa popolazione dei risultati delle n prove di ripetibilità iniziali.Per poter essere sicuri di questo , il laboratorio deve assicurare ilcontrollo statistico del metodo:

DEVE AVERE LE CARTE DI CONTROLLO


La stima della precisione inizia sempre con le prove eseguite incondizioni di ripetibilità, perchè l’acquisizione del dato di scarto tipoSr risulta fondamentale nel processo di validazione del metodo e nelprocesso di controllo del mantenimento nel tempo delle prestazionidegli operatori e del metodo stesso.

Il parametro della ripetibilità potrebbe essere stimato anche senzaconoscere il valore presunto vero del parametro da determinare.

Nella pratica del laboratorio, tuttavia, sono scelti, come campioni diprova, materiali di riferimento , certificati o preparati dal laboratorio,che siano rappresentativi delle prestazioni ( campo di applicazione ecampo di misura) del metodo di prova sotto indagine, sia per il tipo dimatrice che per il livello , presunto noto, dell’analita da determinare.


Dal momento che il laboratorio esegue le n prove diripetibilità su un campione rappresentativo conoscendo ilvalore presunto vero dell’analita da determinare , il valoremedio delle prove definisce il valore dell’ eventualedifferenza (“ scostamento”) rispetto al valore diriferimento.

Se non esiste differenza significativa ( ossia se il metodoè esatto) , l’incertezza del risultato ottenuto coincide conl’imprecisione del risultato ed è esprimibile con lo scartotipo di ripetibilità, di ripetibilità intermedia o diriproducibilità


Se esiste una differenza significativa tra il valore medio delle nprove ed il valore di riferimento, e tale differenza permanenonostante che il laboratorio abbia cercato di migliorare leprestazioni del metodo, il laboratorio stesso può decidere dicorreggere i risultati ottenuti inserendo nel calcolo un fattore dicorrezione , per tener conto dello scostamento.

In questo caso , l’incertezza composta del risultato non è stimatasoltanto con il parametro dell’imprecisione (espresso dallo scartotipo di ripetibilità , stretta o intermedia, o di riproducibilità) , madovrà tener conto anche del contributo dell’incertezza del fattore dicorrezione , ossia del valore dello scostamento.

Il valore dello scostamento varierà infatti da sequenza a sequenzadi n prove e tale variazione sarà tanto più casuale quanto più ivalori medi ottenuti saranno indipendenti tra di loro , come avvieneappunto nelle condizioni di riproducibilità.


RIPRODUCIBILITA’Lo scarto tipo di riproducibilità è ricavato dallo scartotipo di ripetibilità dei p laboratori partecipanti e dalloscarto tipo interlaboratorio , che è a sua volta ricavatodallo scarto tipo delle medie dei risultati ottenuti nelle nprove ripetute dai singoli laboratori:

222rLR σσσ +=

p

Sp

jj

r

∑== 1

2

2σ

nr

ML

222 σσσ −=

( )2

1

2

)1(1 ∑

=

−−

=p

jjM XX

pσ

mSr

RL

222 −= σσ Media delle

prove in doppioNumero prove effettuate inroutine

Numero repliche effettuate dailaboratori


RIPRODUCIBILITA’Dallo scarto tipo di riproducibilità si ricava direttamente ilvalore dell’incertezza dei risultati del metodo, consideratanaturalmente al livello di concentrazione studiato nel circuito.Un laboratorio che non ha partecipato al circuito , puòappropriarsi dei dati di riproducibilità del circuito stesso se ,operando su un campione simile a quello studiato , ottiene dam prove di ripetibilità un valore di scarto tipo coerente conquello determinato dai laboratori partecipanti.La coerenza è definita dal rapporto tra gli scarti tipo giàriportato precedentemente.Se così è,esprimerà l’incertezza, al 95% di confidenza (p=0,95),in uno dei due modi:

RIncertezza σ×= 2mSIncertezza r

L

222 +×= σ


ESATTEZZA ( ACCURATEZZA DELLA MEDIA )

Definizione : “ Grado di accordo tra il valore medio ottenuto da una largaserie di risultati ed il valore di riferimento accettato ”

Se laboratorio ha eseguito le n prove di ripetibilità su un materiale diriferimento in cui è noto il valore , presunto vero, dell’analita, la differenzatra la media dei valori trovati ed il valore noto misura l’esattezza delrisultato , che viene espressa con il termine “ scostamento” ( “bias”).

Lo scostamento quindi misura “il recupero” dell’analita dalla matrice.

Se il laboratorio esegue sullo stesso materiale di riferimento unasuccessiva serie di n prove , è certo che troverà dei valori diversi discostamento.

In questo senso è necessario tener conto anche della variabilità

( “incertezza”) del recupero.


con CCRM = valore certificato del CRMcon Xmedio = valore medio delle n prove di ripetibilità

ESATTEZZAConfronto con un materiale di riferimento

Si eseguono n prove replicate ( almeno 6 ; possibilmente 10) indipendenti suun materiale di riferimento o su una matrice bianca fortificata e , dopo avervalutato che lo scarto tipo trovato è in linea con le aspettative di ripetibilità, siconfronta il valore medio trovato con il valore di riferimento e si verifica se laloro differenza è significativa o meno al 95 % (p=0,95).Se è conosciuta l’incertezza del materiale di riferimento la verifica è eseguitacon il seguente test statistico :

ν,2

2 p

CRMr

CRM tu

ns

XC≤

+

−


e concludere che lo scostamento riferibile al metodo e quello riferibile al laboratoriosono trascurabili.

Se ne potrebbe concludere che il metodo è esatto ,che l’incertezza del recupero ècompresa nella ripetibilità del metodo e che , l’incertezza del risultato della prova,ottenuto ad esempio come valor medio di m replicati è esprimibile dalla relazione:

Con m = numero delle prove eseguite sul campione vero . Per prova singola m =1.

N.B. La relazione non tiene conto di altri contributi all’incertezza , quali ad esempio,l’incertezza di taratura ecc.

( )122

22

2

−×

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

= n

nS

un

S

r

CRMr

ν

22

, CRMr

p umStU += ν


ESATTEZZAConfronto con un materiale di riferimento

Se si verifica che il valore medio trovato con le prove di ripetibilità ha unoscostamento, stimato con la relazione precedente, significativo rispetto alvalore di riferimento, il laboratorio ne verifica , se applicabile, la significativitàtenendo conto, nella stima dell’esattezza, anche della variabilità riferibile acondizioni di riproducibilità.

Se sono conosciute l’incertezza del materiale di riferimento ed anche lavarianza interlaboratorio , la verifica è eseguita con il seguente teststatistico :

ν

σ,

22

2p

CRMr

L

CRM tu

ms

XC≤

++

−


ESATTEZZA Confronto con un metodo normalizzato

Il metodo da validare viene confrontato con uno normalizzato che dispone di dati discarto tipo di ripetibilità e di riproducibilità . Se il laboratorio esegue sullo stessocampione due serie di prove na e nb , con il metodo da validare e con quellonormalizzato , ottenendo due valori medi e due valori di scarto tipo sa e sb nonsignificativamente diversi tra loro ed entrambi compatibili con gli scarti tipo ( vediPG 99-022) del metodo normalizzato allora il metodo interno può essere consideratoesatto se :

con t = valore della variabile di Student al livello di probabilità p( al 95%) e con ν=gradi di libertà.

ν,11 p

ba

ba t

nnS

xx≤

+×

−

( ) ( )( )2

11 22

−+−+−

=ba

bbaa

nnSnSnS


Precisione – Esattezza - Incertezza

Incertezza: “Parametro associato al risultato di una misurazioneo prova, che caratterizza la dispersione dei valoriragionevolmente attribuibili al misurando ”.

Precisione: “ Grado di accordo tra i risultati indipendenti ottenuticon un procedimento d’analisi in condizioni ben specificate”.

Esattezza: “ Grado di accordo tra il valore medio ottenuto dauna larga serie di risultati ed il valore di riferimento accettato ”

Se la precisione è stimata eseguendo n prove su un campionedi cui si conosca la concentrazione dell’analita ed in condizioniche garantiscano l’indipendenza dei dati ( RIPRODUCIBILTA’ OANCHE RIPETIBILITA’ INTERMEDIA ), lo scarto tipo esprimeanche il valore dell’incertezza se il valore medio delle prove nonsi discosta significativamente dal valore di riferimento , ossia seil metodo è esatto.


PRECISIONE ed ESATTEZZA

PRECISIONE = Differenza (scarto aleatorio) tra un singolo valore e la media degli n valori

ESATTEZZA ( accuratezza della media) = Differenza (scostamento) tra il valore presunto vero ed il valoremedio degli n. valori

ACCURATEZZA = Differenza ( scarto) tra il valore presunto vero ed il valore singolo del misurando


Riepilogo:

Scarto aleatorio: differenza tra il risultato della singola prova e lamedia dei risultati delle n prove di ripetibilità ( PRECISIONE);

Scostamento :differenza tra il valore medio delle n prove ed ilvalore presunto vero (ESATTEZZA - trueness);

Scarto :differenza tra il risultato della singola prova ed il valorepresunto vero ( ACCURATEZZA - accuracy).

Dalla definizione di accuratezza sopra riportata, si comprende chequesto parametro racchiude in sé sia il concetto di esattezza che quellodi precisione.

scarto = scostamento ± scarto aleatorio


+ 0,80 1015

20 25

xM = media delle misurexR = valore di riferimento accettato

14,210,0

ESATTEZZAScostamento = ( XM – XR ) = + 4,2

x1, x2, x3, x4…. xn = risultati singole misuse

PRECISIONEScarto aleatorio = (Xi – XM)= + 4,8

- 9,2

xMxR

+ 9,0

+ 6,0+ 5,0

+ 4,0

ACCURATEZZAScarto = ( Xi – XR ) = + 9,0

ACCURATEZZA = ESATTEZZA + PRECISIONE ( Scarto = Scostamento ± Scarto aleatorio )

5

+ 2,5

+ 7,0+ 8,0

+ 8,5

- 2,0

- 5,0

+ 1,8+ 2,8

+ 3,8+ 4,3

+ 4,8

- 0,2- 7,2

+ 4,2

* *

Dati distribuiti normalmente test Shapiro-Wilks ( α = 0,05 %) n<40

* Dati anomali per test di Grupps coppia di dati ( α = 0,05 %)


Parametri statistici tutti i valori senza anomali

Numero misure 10 8 Intervallo valori (range) 14 6,5 Valore minima misura 5 12,5 Valore massima misura 19 19 Mediana 15,5 16,5 Media 14,2 16,2 Scarto tipo ( Sr ) 4,8 2,3 Coeff. Variazione % (CVr ) 33,8 14,1 Gradi libertà ( ν = n-1) 9 7 t di student ( ν = n-1 ; p =0,95) 2,262 2,364 Intervallo confidenza media ( p = 0,95 ) 3,4 1,92 Limite inferiore intervallo 10,8 14,3 Limite superiore intervallo 17,6 18,2 Limite di ripetibilità metodo ( r ) ( p = 0,95) 15,3 7,7

Esattezza Scostamento (bias) 4,2 6,2 Scostamento (bias) % 42,0 62,5 Verifica esattezza per confronto t di student NON ESATTO NON ESATTO t calcolato ( ν = n-1 ; p=0,95) > t tabulato 2,769 > 2,262 7,689 > 2,364

DATI SPERIMENTALI RIPORTATI NEL GRAFICO

=−

=

nSr

XXmt Rcalcolato

RXXmbias −=

100% ×−

=R

R

XXXmbias


LIMITE DI RIVELABILITA’

Determinazione del limite di rivelabilità del metodo di prova

La determinazione del limite di rivelabilità rappresenta spesso unrequisito importante , soprattutto nel caso di analisi in tracce.

Il limite di rivelabilità può essere calcolato , per via empirica,analizzando campioni preparati per aggiunta del misurando allamatrice in quantità via via decrescenti , fino ad identificare il valoredel misurando in grado di dare un rapporto segnale / rumore (S/N)=3.

Il limite di rivelabilità può essere statisticamente definito (considerando un livello di fiducia del 95%) come il valore delmisurando che produce un segnale Y equivalente al segnaleprodotto da un bianco ( ottenuto dal trattamento della matrice privadel misurando) YB più il triplo dello scarto tipo determinato sulsegnale del bianco 3SB; ( METODO IUPAC ) Y=YB+3SB;

Da un punto di vista statistico la relazione corretta, ad un livello difiducia del 95%, è: Y= YB +3,28 SB.


• il limite di rivelabilità può essere stimato dai dati della retta di taratura,assumendo che lo scarto tipo del bianco coincida con lo scarto tipo deiresidui :

con yi = valori sperimentali ed valori stimati dalla retta di regressione ed n = numero complessivo delle determinazioni eseguite per costruire laretta di regressioneNel caso il metodo preveda la costruzione di una retta di taratura e sidisponga di opportuni programmi statistici, il limite di rivelabilità può essereagevolmente stimato , utilizzando opportuni programmi statistici cheapplicano la relazione che fornisce l’incertezza della retta:

( )

2

ˆ 2

−

−=

∑n

yys i

ii

xy

( )( )∑ −

−++= 22

211xxb

yynmb

xyS

Sxi

Dalle considerazioni precedenti si desume l’importanza di conoscere lemodalità di stima del limite di ripetibilità . Il metodo progettato dal laboratoriodeve quindi dare evidenza a questa informazione.


LIMITE di QUANTIFICAZIONE:Il limite di quantificazione = limite di determinazione : minimo valore deldeterminando che può essere rivelato e calcolato con accettabileprecisioneIl limite di quantificazione può essere stimato dai dati della retta di taratura,disponendo di opportuni programmi statistici, impostando il livello diprecisione desiderato: ad esempio una precisione non inferiore al 10%.

IUPAC stima ,ad un livello di fiducia del 95%, il limite di quantificazione come il livello di concentrazione corrispondente al segnale del bianco + 10volte lo scarto tipo del bianco.

LIMITE di DECISIONEIl limite di decisione non deve essere confuso con il limite di rivelabilità:esso è definito come il livello di segnale con una probabilità del 50% diessere confuso con quello del bianco e quindi con la stessa probabilità diappartenere al determinando.


STIMA DELL’INCERTEZZA

Qualsiasi sia il criterio scelto per la stima dell’incertezza, è chiaro , dallecose dette finora, che essa può essere intrapresa solo dopo avereliminato o corretto tutti gli effetti sistematici conosciuti, perché il valoredel risultato deve rappresentare la miglior stima possibile della grandezzada misurare .

Nella parte della relazione relativa all’esattezza, è stato visto comestimare la significatività o meno degli effetti sistematici.


INCERTEZZAModalità di stima

Approccio chimico /olistico- Impiego dello scarto tipo di ripetibilità intermedia( R Chart)- Impiego dello scarto tipo di riproducibilità Ricavato da metodi ufficiali Ricavato dal confronto con metodi validati Ricavato da dati riportati nei certificati dei MRC Ricavato dalla relazione di Horwitz (C : espressa in m/m):

( ) ( )CRCV log5,012% −=

Ricavato dalla relazione di Thompson ( valida sotto 120 ppb; C: espressa in m/m)

CR ×= 22,0σ


INCERTEZZA Modalità di stima

Approccio metrologico-Legge di propagazione degli errori

La norma ENV 13005/2000 considera due fonti di incertezza:-quelle valutabili dallo scarto tipo di ripetibilità (categoria A):-quelle valutabili attraverso informazioni o stime di provenienza interna (incertezza di taratura ) o esterna ( incertezza dei materiali di riferimento;incertezza di pesata ; incertezza di diluizione ecc) – (categoria B).

In entrambi i casi si utilizza un modello matematico ,che descrive larelazione funzionale tra grandezze da quantificare Y e le grandezze Xeffettivamente misurate (grandezze di ingresso)


INCERTEZZAModalità di stima

Approccio metrologico-Legge di propagazione degli errori

( )Ni xxxxfy ...,..., 21= ( ) ( ) ( )∑= ⎥

⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

N

ii

i

ic xu

xxfyu

1

22

.δ

δ

Nella maggior parte dei casi che interessano i calcoli sono semplificabili,come risulta dai due esempi:

321 xxxy ++= ( ) ( ) ( ) ( )32

22

12 xuxuxuyuc ++=

4

321 ..x

xxxy = ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )4

42

3

32

2

22

1

12

xxu

xxu

xxu

xxu

yyuyu c

c +++==&


Fine presentazione

LA VALIDAZIONE DEI METODI ANALITICI - ARPA-MARCHE · La validazione di un metodo interno, così...

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