Validazione di metodi per la Validazione di metodi per la determinazione di residui di determinazione di residui di pesticipestici in matrici grasse tramite LCin matrici grasse tramite LC--MSMS--MS MS

secondo le linee guida SANTE secondo le linee guida SANTE 11945/201511945/2015

Dott. Chim. Cristian Marinelli

PromoFirenze

Riferimenti “europei”

• UNI EN 15662 del 03/2009;

• Variation of QuEChERS-method for Vegetable Oil Samples (quechers.cvua-stuttgart.de/pdf/q-oil.pdf);

• SANTE/11945. 1 december 2015 rev. 0. Guidance document on analytical quality control and validation procedures for pesticide residues;

• http://www.eurl-pesticides-datapool.eu/default.aspx?ziel=asp/en/validation.aspx

• TPP

• TDCP

Metodo estrazione

• Nella UNI EN 15662 “Determinazione dei residui di pesticidi utilizzando GC-MS e/o LC-MS/MS dopo estrazione con acetonitrile e purificazione mediante SPE dispersiva – Metodo QuEChERS”è illustrato il metodo per gli alimenti di origine vegetale.

• Tale metodo definisce le modalità di estrazione dei residui di pesticidi mediante il metodo QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe) e l’analisi degli estratti ottenuti anche mediante LC/MS-MS.

• Per gli oli vegetali esistono delle precisazioni della Comunità dei Laboratori di Riferimento per i residui dei pesticidi (http://quechers.cvua-stuttgart.de/pdf/q-oil.pdf ).

• I pesticidi sono estratti mediante estrazione liquido-liquido in acetonitrile (senza aggiunta di sali). Questo estratto detto ‘grezzo’ è purificato di residui lipidici attraverso SPE dispersiva (MgSO4/PSA/ODS 150/25/25 mg/mL). L’estratto finale può essere utilizzato direttamente mediante LC/MS-MS e/o in GC/MS.

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE

• Il rapporto in Q-oil consigliato è 2 g olio a 10 ml acetonitrile.

• L’acetonitrile deve essere neutro (acidificazione post-estrazione) per co-estrarre il minimo possibile di componenti della matrice.

• Tuttavia è consigliato acidificare (con acido formico) l’estratto post-estrazione perché a pH acido i pesticidi sono più stabili.

• La purificazione può essere fatta o con D-SPE con ODS o con la tecnica del freezing out (*).

• Il caso dello SPINOSAD.

(*) Place the vial containing the extract for at least 1.5 hr in the freezer. Immediately separate the frozen co-extractives (frozen lipids) by filtration through a clean cotton wool into a 15 ml screw capped centrifuge tube containing PSA (25 mg /ml extract).”

STRUMENTI E REATTIVI

• Cromatografo liquido Shimadzu Nexera, composto da: degaser; doppia pompa monocanale; autocampionatore; forno colonne;

• Rivelatore di massa triplo quadrupolo Shimadzu 8030, munito di un’interfaccia di ionizzazione ESI;

• Colonna UHPLC Shim-pack XR-ODS II, 150 mm x 2 mm i.d. x 2.2 µm particle size.

• Per la SPE dispersiva ogni provetta da centrifuga da 15 ml contiene 900 mg MgSO4 , 150 mg PSA (=Primary and secondary amine exchange material), 150 mg C18 (che considerando 6 ml di estratto equivale a MgSO4/PSA/ODS 150/25/25 mg/mL come richiesto nella nota del par. 5.4.1 della EN 15662);

• Standard Interno: soluzione Triphenyl Phosphate Standard, 20 μg/mL

• ESEMPIO Standard in acetone, analiti in concentrazione pari a 100 µg/ml±0.5 µg/ml contenente i principi attivi

MATRIX MATCHED STANDARD • Approccio usato per compensare l’effetto matrice.

• In LC-MS è meno efficace che in GC perché l’effetto matrice dipende dalla coeluizione di ogni singolo pesticida con componenti della matrice coestratti, che variano tra differenti prodotti.

• I modi migliori per compensare l’effetto matrice sono il metodo delle “aggiunte standard” o gli standard interni deuterati.

• In caso si vogliano ottenere standard ‘matrix matched’ la preparazione degli stessi avverrà utilizzando gli estratti acetonitrilici del bianco matrice.

• Procurarsi un campione di olio privo dei residui da determinare, che verrà impiegato come matrice base per costituire i livelli di taratura nel caso di matrix matched standard. Questo viene sottoposto ad estrazione seguendo la normale procedura eccetto per l’aggiunta dell’ISTD. Tale operazione viene ripetuta su tante aliquote dello stesso campione, in modo da raccogliere almeno il volume di estratti acetonitrilici da impiegare negli standard matrix matched.

• Se la diluizione del bianco matrice per aggiunta delle working standard solution dei pesticidi è più del 20% può essere necessario un aggiustamento.

• Tali estratti sono essenziali per testare la selettività.

MATRIX MATCHED STANDARD

ESTRATTI DEL BIANCO MATRICE

ANALISI LC-MS/MS

Si usano le seguenti condizioni cromatografiche:

FASE MOBILE

Canale A Soluzione di acido formico 0,1% in H2O

Canale B Soluzione di acido formico 0,1% in MeOH

FLUSSO 0.3 ml/min

GRADIENTE Canale A Canale B

0 min 95 % 5%

1 min 95 % 5%

4 min 45% 55%

18 min 20 % 80 %

20 min 0 % 100 %

21 min 0 % 100%

21,5 min 100 % 0%

27,5 min 100 % 0%

TEMP. COLONNA 40°C

INJ. VOLUME 5 µl (3µl?)

CONDIZIONI RIVELATORE DI MASSA

Ionizzazione ESI + / ESI -

Nebulizer Gas N2

Drying gas N2

CID gas Ar

Acquisition mode MRM

CONDIZIONI DI ACQUISIZIONE

(MRM)

• L’acquisizione avviene in una finestra di ± 2 minuti dal tempo di ritenzione stabilito.

• Le tarature e i calcoli sono eseguite usando il picco quantificatore.

• Il picco qualificatore serve per confermare il picco in base al fatto che lo stesso “ion ratio” ottenuto negli standard sia ritrovato nei campioni: la SANTE prevede che per LC/MS in SMR sia sufficiente un qualificatore e la tolleranza massima relativa sull’ion ratio è stabilita nel ±30%.

• Il picco del pesticida nel campione deve rientrare entro ±0,1 minuti dal tempo di ritenzione dello standard.

Nome 1° Transizione (quantif.)

2° Transizione (qualific.)

Ratio Ret. Time

DIMETHOATE ESI+ [M+H]+ 229,8 -> 198,9 229,8 -> 125 75 5,7

PHOSMET ESI+ [M+H]+ 317,9 -> 160 317,9 -> 133 12 10,6

CHLORPYRIFOS ESI+ [M+H]+ 350 -> 97 350 -> 198 352-> 200

77 20,7

TARATURA E FORMULE DI

CALCOLO

• Tenendo la concentrazione di IST costante nei diversi livelli di taratura e nei campioni si può riportare il valore Peak Ratio PR (Apest/AISTD) di ogni livello di taratura contro la concentrazione di pesticida Cpest invece del rapporto Cpest/CISTD (cioè la CISTD è posta uguale a 1).

• La taratura è effettuata in bracket (prima e dopo la sequenza) e la differenza delle due aree deve essere inferiore del 30%. I residui devono essere minori del 20%. Nel caso queste condizioni non siano rispettate è possibile procedere se il pesticida è non rilevabile, altrimenti per la quantificazione è necessario ripetere la taratura.

• I punti sono interpolati da una retta con il metodo dei minimi quadrati usando una regressione lineare pesata (1/X) come da raccomandazione SANTE.

VALIDAZIONE

Batch di validazione

• Si procede con la analisi cromatografica delle seguenti soluzioni:

• 1. Curva standard in solvente;

• 2. Curva matrix marched standard (tecnica bracket);

• 3. Bianco campione e bianco reagente;

• 4. 5 fortificati alla concentrazione LOQ;

• 5. 5 fortificati alla concentrazione 2,5 x LOQ;

• 6. 5 fortificati alla concentrazione 10 x LOQ;

• 7. Curva matrix marched standard (tecnica bracket).

Linearità • Dall’analisi della retta di taratura attraverso il

metodo delle regressione lineare pesata (1/X) si

possono calcolare i residui % (si definisce

residuo e=y-ŷ dove y è il valore osservato e ŷ è

il valore predetto). Questi residui espressi in

percentuali devono essere minori ±20%. LINEARITA' (Residui%)

Conc. Standard (ug/ml) Residuo% 1 Residuo % 2

Residui <±20%

0,0020 6,9 10,4

0,0050 -10,5 0,7

0,0100 -10,1 -0,9

0,0200 -5,2 9,7

0,0500 -6,5 3,9

0,1000 -3,7 5,4

o Esempio linearità phosmet

o Limiti prova in doppio

o Uso QC del software LabSolution (Accuracy)

Effetto matrice • In fase di validazione si esegue le rette con gli

standard a Xconcentrazioni sia con standard in acetonitrile sia standard matrix matched. Di queste rette si calcola il coefficiente angolare e si fa il rapporto. Questo può indicare un effetto matrice di accrescimento (enhancement) o si soppressione (suppression) più o meno significativo.

EFFETTO MATRICE

Standard acetonitrile Standard matrice

Coefficiente angolare 229,88 243,14

Effetto matrice (%) 106

o Esempio effetto

matrice

phosmet

SANTE 2016 più morbido: Confronto tra risposta di std

in solvente e degli standard matrix matched +/- 20%.

Definizioni della guida SANTE 11945 TheThe LowestLowest CalibrationCalibration LevelLevel (LCL)(LCL) mustmust bebe equalequal toto,, oror

lowerlower thanthan,, thethe calibrationcalibration levellevel correspondingcorresponding toto thethe

ReportingReporting LimitLimit (RL)(RL).. TheThe RLRL mustmust notnot bebe lowerlower thanthan thethe

LOQLOQ..

LCL Lowest Calibration Level: la concentrazione più bassa di analita con

la quale lo strumento è tarato con successo, durante la serie analitica

RL Reporting Limit: il livello più basso al quale i residui saranno riportati

come numeri assoluti

LOQ Limit di Quantification: la concentrazione più bassa di analita che è

stata validata con accuratezza accettabile applicando il metodo analitico

completo.

LOD Limit of Determination, usato nel Reg. 396/2005: la concentrazione

di residuo più bassa validata che può essere quantificata e riportata con il

monitoraggio di routine di metodo di controllo validati -> sinonimo di

LOQ e non è il Limit of Detection

Es. Clorpyriphos. 0,05 mg/g (1)

(1) Indica il limte inferiore di determinazione analitica

LOQ

• Cosa è prioritario definire operativamente:

Il limite di quantificazione è definito come il

livello di spike (recuperi) più basso che

rispetta i criteri di esattezza e precisione del

metodo.

Specificità

• Iniettando il bianco reagenti (una estrazione

intera eseguita senza olio) e il bianco

campione (una estrazione eseguita su olio

che non contiene pesticidi) i picchi

eventualmente rilevati devono essere minore

del 30% del limite di quantificazione.

3. SPECIFICITA' (BIANCO REAGENTI E BIANCO CAMPIONE)

Conc. (ug/ml) <30% del LOQ

Bianco reagente -----

Bianco campione -----

Esattezza e precisione (recuperi)

• Secondo la SANTE si deve procedere alla stima del recupero almeno a due livelli e questi sono accettabili se compresi tra il 70% e il 120%. Lo scarto tipo di ripetibilità, espresso in %, deve essere minore o uguale del 20%.

• Come da schema batch di validazione si procede a 3 livelli di recuperi (1x, 2,5x, 10x).

• In vial da 20 ml (p.es. di vetro) pesare l’olio e aggiungere la miscela dei pesticidi a concentrazione nota utilizzando pipette automatiche da 200 µl e 20 µl, tappare e mettere in bagno a ultrasuoni potenza 99%, temperatura ambiente, per 30 minuti. L’olio si può conservare in frigorifero (a 5°C +/- 3°C) per 3 mesi (dipende dai pesticidi!).

Esattezza e precisione (recuperi) 4. ESATTEZZA (BIAS) E PRECISIONE (RSDr)

(1)4. ESATTEZZA (BIAS) E PRECISIONE (RSDr) (1)

Recupero 0,01 mg/kg

Peso olio Recupero µg/kg Recupero%

Recupero

medio 70-

120%

RSDr≤20%

2,0206 0,0095 95,3

2,0084 0,0099 99,3

2,0169 0,0090 90,2

2,0094 0,0105 104,6

2,0132 0,0103 102,7

RECUPERO MEDIO 0,0098 98,4

RSDr 5,9

Recupero 0,025 mg/kg

Peso olio Recupero µg/kg Recupero%

Recupero

medio 70-

120%

RSDr≤20%

2,0095 0,0238 95,0

2,0007 0,0237 95,0

2,0238 0,0235 94,1

2,0119 0,0250 99,9

2,0272 0,0230 92,2

RECUPERO MEDIO 0,0238 95,2

RSDr 3,0

Recupero 0,1 mg/kg

Peso olio Recupero µg/kg Recupero%

Recupero

medio 70-

120%

RSDr≤20%

2,0123 0,0899 89,9

2,0158 0,0926 92,6

2,0004 0,0924 92,4

2,0108 0,0904 90,4

2,0066 0,0894 89,4

RECUPERO MEDIO 0,0909 90,9

RSDr 1,6

(1) Dati ottenuti in condizioni di ripetibilità stretta (stesso metodo, materiale esaminato , laboratorio, operatore,

apparecchiatura, sua taratura , intervallo di tempo tra le prove).

o Esempio

recuperi

phosmet

ON GOING VALIDATION

• Lo scopo della validazione ‘in itinere’ è di:

• Dimostrare la robustezza attraverso la valutazione del ricovero medio e della ‘reproducibility within-laboratory’ (RSDwR)

• Dimostrare che aggiustamenti minori fatti al metodo nel tempo non influenzano in modo inaccettabile le performance del metodo

• Dimostrare l’applicabilità a altri prodotti della stessa categoria di prodotto

• Determinare i limiti accettabili per i risultati del recupero durante le analisi di routine.

ON GOING VALIDATION

Precisione intermedia e robustezza • La SANTE distingue la validazione iniziale dalla “on-

going validation”.

• Per testare questa si calcola i recuperi almeno al LOQ in diversi giorni, in condizioni di taratura diversi e su estratti diversi, potenzialmente anche da operatori diversi.

• Il recupero medio è accettabile se compreso tra il 70% e il 120%. Lo scarto tipo di ripetibilità, espresso in %, deve essere minore o uguale del 20%.

• Il singolo recupero condotto nella analisi di routine dovrebbe essere compreso tra recupero medio +/-2xRSD. Un range pratico è tra il 60 e il 140%.

• Rielaborazione periodica (annuale). Carta di controllo?

5. PRECISIONE INTERMEDIA (RSDwR)(2)

e ROBUSTEZZA

Recupero 0,01 mg/kg

Data Peso olio Conc.

(ug/ml) Recupero µg/kg Recupero%

22/02/2015 2,0206 0,001925 0,0095 95,3

26/02/2015 2,0025 0,002137 0,0107 106,7

06/03/2015 2,0017 0,002000 0,0100 99,9

16/03/2015 1,9943 0,001636 0,0082 82,0

2,0132 0,002099 0,0104 104,3

RECUPERO MEDIO 0,0098 97,6

RSDwR 10,0

(2) Dati ottenuti in condizioni di riproducibilità intralaboratorio: variando taratura dell'apparecchiatura,

giorno di esecuzione, e, opzionalmente, l'operatore.

o Esempio

precisione

intermedia

Phosmet

ON GOING VALIDATION

Precisione intermedia e robustezza

ON GOING VALIDATION

Estensione dello scopo del metodo • Nuovi analiti -> validazione iniziale

• Alternativamente la validazione di nuovi analiti

può essere integrata nella validazione in itinere.

Per esempio: prodotto spiked al LOQ e un altro

livello. Recuperi- interferenze. Quando si hanno 5

punti recupero medio e RSDwR.

• Nuove matrici. Un modo pragmatico per testare

l’applicabilità del metodo ad altra matrice dello

stesso gruppo di prodotti è usare il controllo

qualità in itinere eseguito insieme alle analisi dei

campioni.

INCERTEZZA DI MISURA

• La SANTE AQC 2015 basandosi su incertezze calcolate con approcci diversi (circuiti interlaboratorio, Horwitz, stima basata su validazioni interne, stima una incertezza relativa del 50%). [Medina-Pastor et al. J. Agric. Food Chem., 59(2011) 7609-7619]

• Le stime ottenute con approccio GUM basato sui dati di validazione del singolo laboratorio possono sottostimare il dato.

• Il Laboratorio valuta l’incertezza di misura a diversi livelli attraverso l’approccio GUM o attraverso approccio olistico (per es. ripetibilità intermedia lab + bias).

• Verificata che questa rientra nel 50% si potrebbe adottare conservativamente come incertezza il 50% del valore del pesticida valutando il superamento di un LMR di conseguenza.

INCERTEZZA DI MISURA INCERTEZZA DI MISURA (approccio GUM)

Incertezza di categoria A livello 0,01 mg/kg

Valore medio Ym 0,00984

Scarto tipo (o deviazione standard) s 5,79E-04

Incertezza di ripetibilità (o scarto tipo della media) u(Ym)A 2,59E-04

Incertezza di ripetibilità relativa u(Ym)A/Ym 2,63E-02

Incertezza RELATIVA al quadrato (u(Ym)B/Ym)2 6,93E-04

Incertezza di categoria B

Recupero(bias

%)

Peso olio

(g)

Std

0,002

Volume Std

interno Volume cleanup

Contributo all' incertezza di categoria

B 1,60E+00 1,40E-03 5,00E-04 2,80E+00 7,00E+01

Valore di incertezza associata u(Ym)B 9,21E-01 8,08E-04 2,89E-04 1,62E+00 4,04E+01

Incertezza RELATIVA (u(Ym)B/Ym) 9,21E-03 4,04E-04 1,44E-01 5,39E-02 1,35E-02

Incertezza RELATIVA al quadrato

(u(Ym)B/Ym)2 8,49E-05 1,63E-07 4,00E-07 2,90E-03 1,81E-04

Incertezza composta relativa per

prova in singolo 6,22E-02

Fattore di copertura k (2<k<3)

(*) 2

Incertezza estesa relativa per prova

in singolo 0,1243

Incertezza estesa per prova in

singolo 0,0012

Incertezza % 12,4

≤50%

LIMITI DI LEGGE

• I limiti di legge per oli di oliva applicati sono ricavati dai limiti per le olive da produzione di olio (0402010 Olives for oil production sito Pesticides Web Version - EU MRLs- http://ec.europa.eu/SANTE_pesticides/public/?event=homepage&language=EN ) moltiplicati per un fattore 5 come da Reg Ue 400/2014 che recita: “Olio d'oliva vergine: in mancanza di un fattore di trasformazione specifico per l'olio, il fattore di trasformazione da utilizzare è 5, tenendo conto di una resa standard della produzione di olio d'oliva del 20 % della raccolta di olive.”

RELAZIONE TRA INCERTEZZA

E LIMITI DI LEGGE

Per approfondire aspetti di cui non ho parlato (tecnica strumentale)

• PD CEN/TR 15641:2007 Food analysis. Determination of pesticide residues by LC-MS/MS. Tandem mass spectrometric parameters

• Mass Spectrom Rev. 2006 Nov-Dec;25(6):838-65. Residue analysis of 500 high priority pesticides: better by GC-MS or LC-MS/MS? Alder L, Greulich K, Kempe G, Vieth B.

• Analytical and Bioanalytical Chemistry November 2007, Volume 389, Issue 6, pp 1697-1714. Analysis of pesticide residues using the Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe (QuEChERS) pesticide multiresidue method in combination with gas and liquid chromatography and tandem mass spectrometric detectionPaula Payá, Michelangelo Anastassiades , Dorothea Mack, Irina Sigalova, Bünyamin Tasdelen, José Oliva, Alberto Barba

• J Agric Food Chem. 2011 Jul 27;59(14):7636-46. Multiresidue pesticide analysis of agricultural commodities using acetonitrile salt-out extraction, dispersive solid-phase sample clean-up, and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Zhang K1, Wong JW, Yang P, Tech K, Dibenedetto AL, Lee NS, Hayward DG, Makovi CM, Krynitsky AJ, Banerjee K, Jao L, Dasgupta S, Smoker MS, Simonds R, Schreiber A.

Per approfondire aspetti di cui non ho parlato (transizioni e ottimizzazioni)

Dott. Chim. Cristian Marinelli via Orcagna 70 – Firenze

055 674027