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Sviluppo e validazione di un metodo multiresiduo per la determinazione dei pesticidi negli alimenti di

origine animale destinati all’infanzia

Graziella Amendola –ISS graziella.amendola@iss.it

IX Convegno Attività dell’Amministrazione Pubblica in materia di controllo dei Residui di Fitofarmaci negli alimenti

- 17 Novembre 2011 -

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Perché sviluppare questo metodo:

Ottimizzare un metodo già disponibile in reparto

Ottenere l’ accreditamento del metodo (attività del NRL-AO)

Programma Comunitario di Controllo

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Reg. 396/2005 Articolo 29

Programma comunitario di controllo 1. La Commissione elabora un programma comunitario coordinato di controllo pluriennale che specifica i campioni da inserire nei programmi nazionali di controllo e tiene conto dei problemi riscontrati in relazione all'osservanza degli LMR stabiliti nel presente regolamento, allo scopo di valutare l'esposizione dei consumatori e l'applicazione dell'attuale legislazione. 2. Il programma comunitario di controllo è adottato e aggiornato ogni anno secondo la procedura di cui all'articolo 45, paragrafo 2. Il progetto di programma comunitario di controllo è presentato al comitato di cui all'articolo 45, paragrafo 1, almeno sei mesi prima della fine di ogni anno civile.

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COMMISSION REGULATION (EU) No 915/2010

of 12 October 2010 concerning a coordinated multiannual control programme of the Union for 2011, 2012 and 2013 to ensure compliance with maximum levels of and to assess the consumer exposure to pesticide residues in and on food

of plant and animal origin

Allegato I: Tabella in cui sono riportate le combinazioni tra principi attivi e matrice che devono essere analizzati Allegato II: Numero di campioni relativi alle combinazioni riportate nella tabella 1 e il numero di campioni di alimenti per l’infanzia, che ciascun Paese Membro deve analizzare.

In dettaglio sono richieste le analisi su:

2012: 10 campioni di alimenti a base di cereali

2013: 10 campioni sugli alimenti per lattanti e per bambini

2014: 10 campioni sugli alimenti per lattanti e sugli alimenti di proseguimento

L’aggiornamento del Programma Comunitario per l’anno in corso non è stato ancora ufficialmente pubblicato, ma esiste già un draft: SANCO/11278/2011 nel quale vengono riconfermati il numero e la tipologia dei campioni che devono essere analizzati per quanto concerne gli alimenti destinati all’infanzia.

In particolare, in questo aggiornamento la tabella 1 dell’Allegato I è stata divisa in due parti, la parte A riguarda i prodotti di origine vegetale, la parte B i prodotti di origine animale. Nella parte B sono stati introdotti altri p.a. he possono essere analizzati su base volontaria a partire dal 2012.

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PERCHE’ L’INFANZIA

VULNERABILITA’ GENERALE

ELEVATO RAPPORTO QUANTITA’ DI CIBO INGERITA/ PESO CORPOREO

DIETA POCO DIVERSIFICATA

IMMATURITA’ DEI SISTEMI METABOLICI

SUSCETTIBILITA’ SPECIFICA

MATURAZIONE DI ORGANI E SISTEMI : NERVOSO, IMMUNITARIO, ENDOCRINO, RIPRODUTTIVO

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DIR. 2006/141/CE ALIMENTI PER LATTANTI E ALIMENTI DI PROSEGUIMENTO

Art.10 e Allegati VIII e IX

DIR. 2006/125/CE ALIMENTI A BASE DI CEREALI E ALTRI ALIMENTI DESTINATI AI BAMBINI

Art.7 e Allegati VI e VII

NORMATIVA SUI FITOFARMACI IN ALIMENTI DESTINATI ALL’INFANZIA

“...GLI ALIMENTI DESTINATI ALL’INFANZIA NON DEVONO CONTENERE RESIDUI DI SINGOLI ANTIPARASSITARI SUPERIORI A 0.01 mg/Kg ... ”

Eccezione per alcuni pesticidi MRLs 0.003-0.006-0.008 mg/Kg

DIRETTIVE COMUNITARIE

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ALLEGATO VI

QUANTITÀ MASSIME SPECIFICHE DEI RESIDUI DI ANTIPARASSITARI O DEI METABOLITI DI

ANTIPARASSITARI NEGLI ALIMENTI A BASE DI CEREALI E NEGLI ALTRI ALIMENTI DESTINATI AI

LATTANTI

Denominazione chimica della sostanza (definizione del residuo) Quantità

massime

dei residui

(mg/kg) Cadusafos 0,006 Demeton-S-metile/demeton-S-metile-solfone/oxidemeton-metile (isolatamente o assieme, espressi in demeton-S-

metile) 0,006

Etoprofos 0,008 Fipronil (somma di fipronil e fipronil-desulfinyl, espressa in fipronil) 0,004 Propineb/propilentiourea (somma di propineb e propilentiourea) 0,006

ALLEGATO VII

ANTIPARASSITARI CHE NON DEVONO ESSERE UTILIZZATI IN PRODOTTI AGRICOLI DESTINATI ALLA

PRODUZIONE DI ALIMENTI A BASE DI CEREALI E DEGLI ALTRI ALIMENTI PER LATTANTI

Tabella 1

Tabella 2

Denominazione chimica della sostanza (definizione del residuo)

Disulfoton (somma di disulfoton, solfossido di disulfoton e solfone di disulfoton, espressa in

disulfoton)

Fensulfothion (somma di fensulfothion, del suo analogo d'ossigeno e dei loro solfoni, espressa

in fensulfothion)

Fentin, espresso in cationi di trifenilstagno

Alossifop (somma di alossifop, dei suoi sali ed esteri, compresi i composti, espressa in

alossifop)

Eptacloro e trans-eptacloro epossido, espressi in eptacloro

Esaclorobenzene

Nitrofen

Ometoato

Terbufos (somma di terbufos, del suo solfosside e solfone, espressa in terbufos)

Denominazione chimica della sostanza (definizione del residuo) Aldrin e dieldrin, espressi in dieldrin Endrin

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Attività svolte dal Reparto inerenti gli alimenti destinati all’infanzia

2000 - 2001: Convenzione progetto 1% “ Valutazione dell’assunzione di residui di pesticidi tramite la dieta, indagini analitiche sui livelli di residui di pesticidi in alimenti per bambini”

2003-2005: Piani triennali per la sorveglianza sanitaria dei fitofarmaci (Art. 17, comma 4, del D.L.vo n. 194/95)

2005: Controllo alimenti per l’infanzia nell’ambito del procedimento N° 9013/04 della Procura della Repubblica

Sviluppo metodi prodotti di origine vegetale: 88 composti

OC/PYR/OP/NMC prodotti di origine animale: 50 composti OC/OP/PYR

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Alimenti di origine animale: confronto metodo vecchio con metodo nuovo

Campione

Estrazione

1° Clean up

2° Clean up

OC/PYR GC-2xECD

OP GC-FPD

Metodo vecchio Metodo nuovo

Campione

Estrazione

1° Clean up 1° Clean up

OP/PYR/OC GC-MS/MS

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Estrazione 25 g campione + 100 ml Esano/Acetone 1:1 2 min UltraTurrex Centrifuga 15 min Si ripete l’estrazione con 2 aliquote da 50

ml di esano (altri 2 steps di centrifugazione da 15 min ciascuno)

Gli estratti si disidratano su colonna sodio solfato anidro (25 g) e lavaggio con 15 ml esano

Evaporazione dell’estratto fino a secchezza

Estrazione

5 g di campione + 35 mL di acetonitrile

2 min UltaTurrex

+ 5 g Solfato di Magnesio anidro

Filtrazione sotto vuoto su Bukner, con lavaggio del filtrato con 15 ml acetonitrile

Evaporazione a circa 1 ml

Metodo vecchio Metodo nuovo

Clean up Clean up

Tempo = 1h/campione Sale = 25g Solvente = 215ml

Tempo = 15min/campione Sale = 5g Solvente = 50ml

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COMPOSIZIONE DEGLI OMOGENEIZZATI DI ORIGINE ANIMALE

CARNE, PESCE, FORMAGGIO

Acqua = 60%

Proteine 3-12%

Carboidrati 4-9%

Grassi 1.5-7.5%

In 25 g di campione Grassi: 0.4 -1.9 g Acqua: 15 g

In 5 g di campione Grassi: 0.1 - 0.6 g Acqua: 5 g

40%

estratto:

Residuo grasso: 0.4 -1.5g

Elevate tracce di acqua

ESTRAZIONE

Metodo vecchio Metodo nuovo

estratto:

Residuo grasso: 0.05g

Scarse tracce di acqua

Esano/Acetone

Acetonitrile

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1° Clean up:

Estratto in esano su cartuccia Extrelut NT3

30 min sotto soffio di azoto

Cartuccia Extrelut 1 modificata contenente C18 (0.36g)

Eluizione con 20 ml acetonitrile

Metodo vecchio Metodo nuovo

Clean up:

Estratto in acetonitrile su cartuccia di C18 (2g)

Eluizione con 20 ml acetonitrile

2°Clean up: Florisil/miscele Suzuki

Analisi OC/PYR GC-2xECD (GC-MS)

Analisi per tutte le classi di composti GC-MS/MS (QQQ) Agilent 7000

(Grasso residuo: 5-15 mg)

(Grasso residuo: 2-4 mg)

(Grasso residuo: 5-12 mg)

(28 p.a.)

(22 p.a.)

(65 p.a.)

Analisi OP GC-FPD (GC-MS)

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GC-MS/MS Agilent 7000 (QQQ)

.

GC- MS/MS: Iniettore Programmed Temperature Vaporizer (PTV) modalità solvent vent Colonna HP 5MS (450°C, 30m x 250 m x 0.25 m); temperatura del forno: 50-

280°C Sistema backflush (0.8m x 180 m x 0 m) MS-MS: triplo quadrupolo (sorgente EI, temp. 280°C) Determinazione in Multiple Reaction Monitoring MRM (alta selettività) Software Muss Hunter

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PTV:

modalità solvent vent permette l’iniezione in acetonitrile, non c’è bisogno di cambiare il solvente. Volume di iniezione: da 2 a 5 L, consente di analizzare concentrazioni molto basse dei composti, come ad esempio richiesto dalla normativa per gli alimenti destinati all’infanzia (MRL=0.003 mg/Kg)

Sistema Backflush: lavaggio della colonna capillare in controcorrente. Determina molti vantaggi: Aumenta la vita della colonna capillare, riducendo il tempo di esposizione ad alte temperature (bake out) riduce il run time Riduce la frequenza della manutenzione della sorgente, poiché previene il deposito di componenti alto bollenti sulla sorgente

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Multiple Reaction Monitoring MRM: La funzione MRM permette di analizzare matrici difficili a bassi limiti di determinazione Velocità di acquisizione fino a 500 transizioni MRM al secondo consente di quantificare e confermare in modo automatico molti composti in un singolo metodo Con una corsa di 42 min sono stati analizzati 65 p.a appartenenti a differenti classe di composti Si può aumentare in numero di composti fino a circa 200

GC-MS/MS: Triplo quadrupolo

Ionizzazione del campione nella sorgente inerte: si forma lo ione precursore

1°quadrupolo: isolamento dello ione precursore cella di collisione: ione precursore viene dissociato con azoto, si generano gli ioni figli 2° quadrupolo: gli ioni figli vengono separati dagli interferenti di matrice analizzati in un rivelatore a triplo asse

Muss Hunter:

un software più sofisticato che permette una rapida elaborazione dei dati, che si traduce in minori possibilità di errore e in un risparmio notevole di tempo.

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Composti di interesse per le matrici di origine animale: organofosforati, organoclorurati, piretroidi (lista EURL-PT-AO)

Composti con valori specifici di MRL indicati in normativa

Composti nuovi inseriti nel piano triennale

Quali pesticidi sono stati considerati:

In totale sono stati studiati e validati 65 principi attivi

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1) Aldrin

2) Bifenthrin

3) Boscalid

4) Cadusafos

5) Chlordane cis

6) Chlordane trans

7) Chlorfenvinphos

8) Chlorobenzilate

9) Chlorpyrifos

10) Chlorpyrifos-methyl

11) Cyfluthrin

12) Cyhalothrin lambda

13) Cypermethrin

14) DDD o,p'

15) DDD p,p'

16) DDE o,p'

17) DDE p,p'

18) Deltamethrin

19) Demeton-S-methyl

20) Demeton-S-methylsulfon(oxy)

21) Diazinon

22) Diclorvos

23) Dieldrin

24) Disulfoton

25) Disulfoton sulfone

26) Endosulfan (alpha isomer)

27) Endosulfan (beta isomer)

28) Endosulfan sulfate

29) Endrin

30) Ethion

31) Ethoprophos

32) Fenamiphos

33) Fenitrothion

34) Fenthion

35) Fenvalerate

36) Fipronil

37) Fluvalinate-tau

38) HCH (alpha isomer)

39) Heptachlor

40) Heptachlor Epoxide cis

41) Heptachlor Epoxide trans

42) Hexachlorobenzene

43) Lindane

44) Malathion

45) Metacrifos

46) Methoxychlor

47) Methyl parathion

48) Nitrofen

49) Oxychlordane

50) Parathion

51) Pendimethalin

52) Permethrin

53) Pirimiphos-methyl

54) Profenofos

55) Pyrazophos

56) Quinalphos

57) Quintozene

58) Resmethrin

59) Tecnazene

60) Terbufos

61) terbufos sulfone

62) Tolclofos-methyl

63) Triazophos

64) Trifluralin

65) Vinclozolin

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GC-MS/MS: ALTA SELETTIVITA’

BIANCO PESCE BIANCO CARNE

BIANCO FORMAGGIO Standard in matrice (65 composti)

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ALTA SENSIBILITA’

TERBUFOS e TERBUFOS SULFONE

Transizioni Terbufos: Quantifier 231.0 128.9 Qualifier 231.0 174.9 Spiking level: 0.003mg/Kg (LOQ=MRL) Rec.= 106% RSD=3%

Transizioni Terbufos sulfone: Quantifier 199.0 143.0 Qualifier 231.0 174.9 Spiking level: 0.003mg/Kg (LOQ=MRL) Rec.= 82% RSD=9%

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Dir. 2006/125/CE

DEFINIZIONE DEL MRL:

TERBUFOS = (Somma di Terbufos, del suo sulfosside e del suo sulfone, espressi come Terbufos)

DEMETON-S-METILE, DEMETON-S-METILE SULFONE, DEMETON-S-METILE SULFOSSIDE (isolatamente o assieme, espresi in Demeton-S-Metile)

DISULFOTON = (Somma di Disulfoton, del suo sulfosside e del suo sulfone, espressi come disulfoton)

SULFOSSIDI

non sono analizzabili in GC-MS/MS, ma possono essere analizzati in LC-MS/MS.

Questa parte di lavoro rientra nei nostri obiettivi futuri

21 (mainlib) Heptachlor epoxide

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 4000

50

100

27

36

53

61 73

81

8597

109

115123

143

151

167183

193 204

217

229

237

253

263

274282 289 317

353

388

Cl

Cl

Cl

Cl

O

Cl

ClCl

(mainlib) 2,5-Methano-2H-indeno[1,2-b]oxirene, 2,3,4,5,6,6a,7,7-octachloro-1a,1b,5,5a,6,6a-hexahydro-, (1aα,1bβ,2α,5α,5aβ,6β,6aα)-

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 4400

50

100

29 36

51

61 7387

97

109

115

121

127

143

149

157167

185

204 217

229

237

253

263

275287

299

310323 351

359

387

422

Cl

Cl

Cl

Cl

O

Cl

ClCl

Cl

OSSICLORDANO (a) O cis-HEPTACLORO EPOSSIDO (b)?

(a)

(b)

22

Ossiclordano

(a)

Cis-Eptacloro Epossido (b)

OSSICLORDANO (a) O cis-EPTACLORO EPOSSIDO (b)?

Transizioni OSSICLORDANO: Quantifier 388.6 352.9 Qualifier 388.6 264.7

Transizioni EPTACLORO EPOSSIDO: Quantifier 352.9 262.8 Qualifier 352.9 281.9 Quantifier 81.0 53.1 E.c= 15

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VALIDAZIONE METODO

SANCO 10684/2009

MATRICI RAPPRESENTATIVE: OMOGENEIZZATI DI CARNE, FORMAGGINO E PESCE

PROVE DI RECUPERO: CAMPIONI BIANCHI ADDIZIONATI

2 LIVELLI DI SPIKING: basso= LOQ; alto= 10XLOQ

RIPETIZIONI: n= 5 PER OGNI LIVELLO E PER TUTTI I COMPOSTI STUDIATI

DETERMINAZIONE DEL LOQ

DETERMINAZIONE DELLA LINEARITA’

RISULTATI DELLA VALIDAZIONE:

RIENTRANO NEI CRITERI DI ACETTABILITA’ INDICATI NELLA SANCO 10684/2009

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GRAZIE PER L’ATTENZIONE