Validazione di un metodo di analisi

Dott. Lorenzo Catani

Argomenti trattati

❧ Introduzione alla validazione dei metodi analitici

❧ Parametri che caratterizzano un metodo analitico

❧ esempio pratico

Validazione

❧ Validazione di un metodo analitico:

❧ “Conferma attraverso l’esame e l’apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l’utilizzazione prevista siano soddisfatti”

Quando validare un metodo?❧ Quando un metodo è

❧ non normato

❧ sviluppato e/o progettato dal laboratorio

❧ normato ma utilizzato al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione prefissato

❧ le più comiuni situazioni sperimentali che impongono la validazione sono le seguenti:

• un nuovo metodo è sviluppato per scopi particolari;

• un metodo analitico normato deve essere aggiornato, migliorato o esteso ad un nuovo problema analitico;

• il controllo di qualità evidenzia variazioni temporali dei parametri di qualità;

• un metodo stabilito deve essere usato in un diverso laboratorio, da un diverso analista, con diversa strumentazione;

• è necessario dimostrare l’equivalenza del metodo in esame con un metodo standard.

Validazione

❧ Il laboratorio che utilizza un metodo deve avere la documentazione che dimostri l’appropriata validazione del metodo stesso.

❧ È responsabilità dell’utilizzatore assicurare che la validazione documentata sia sufficientemente completa

Validazione

❧ Non ci sono linee guida ufficiali per la sequenza degli esperimenti necessari per la validazione

❧ La sequenza ottimale può dipendere dal metodo stesso

Parametri che caratterizzano un metodo analitico

• Campo di misura• Specificità-selettività analitica• limite di rivelabilità e di quantificazione• range dinamico e lineare• accuratezza intesa come esattezza più

precisione (quest’ultima a sua volta distinta in ripetibilità, precisione intermedia e riproducibilità)

• incertezza di misurazione• robustezza.

Campo di misura (validità)❧ Intervallo tra il più alto e il più basso livello

dell’analita determinabili con precisione ed accuratezza applicando il metodo stesso

❧ Il campo di misura (validità) è espresso nella stessa unità di misura dell’analita

❧ Dipende dallo scopo del metodo

❧ Specificità: Si riferisce ad un metodo che produce una singola risposta

❧ Selettività: si riferisce ad un metodo che produce più risposte (metodo separativo)

❧ ABILITÀ DI MISURARE ACCURATAMENTE L’ANALITA IN PRESENZA DI INTERFERENTI

Specificità-Selettività analitica

Limite di rilevabilità❧ È la più bassa concentrazione dell’analita

che può essere rilevata, ma non necessariamente determinata quantitativamente, nelle condizioni sperimentali del metodo

❧ LdR=3*Sb/S• Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)

• S =coefficiente angolare della curva di taratura

• per metodi cromatografici

• Sb = D/5

• dove

• D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo

Limite di quantizzazione ❧ La Più bassa concentrazione analitica che

può essere determinata quantitativamente con accettabile precisione ed esattezza nelle condizioni sperimentali del metodo

❧ LdQ = 10*Sb/S• Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)

• S =coefficiente angolare della curva di taratura

• per metodi cromatografici

• Sb = D/5

• dove

• D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo

Linearità

❧ La linearità di un metodo analitico è la sua abilità di dare risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione degli analiti nei campioni all’interno di un determinato campo di validità

❧ la proporzionalità può essere raggiunta anche attraverso trasformazioni matematiche ben definite

Linearità❧ Deve essere verificata attraverso il calcolo del coefficiente di

correlazione della curva di taratura eseguita, quando possibile, con aggiunte standard alla matrice da analizzare. Curve di taratura su matrici diverse o in soluzioni standard (contenenti soltanto il solvente e l'analita) possono essere utilizzate previa specificazione delle motivazioni nel metodo di prova. Sono generalmente accettati coefficienti di correlazione (r secondo il metodo dei minimi quadrati) pari almeno a 0,99.

❧ Una non-linearità significativa dovrebbe essere corretta mediante l'utilizzo dì funzioni di taratura non lineari o eliminata restringendo l’intervallo di concentrazioni in cui si opera.

Linearità❧ Si deve effettuare almeno da 3 a 6

repliche di 4 o più concentrazioni

❧ Nella validazione del metodo devono essere riportati il coefficiente di correlazione, la pendenza, l’intercetta e i residui, oltre ad un grafico dei dati sperimentali e della curva calcolata

Esattezza

❧ Grado di concordanza tra il valore medio ottenuto a partire da un grande insieme dì risultati di prova, e un valore dì riferimento accettato

Per la valutazione dell’esattezza:

❧ Confronto con un metodo analitico di ordine metrologico superiore

❧ Analisi di idonei materiali di riferimento certificati a diversi livelli di concentrazione

❧ Confronto con i valori attesi in studi collaborativi (circuiti interlaboratorio)

❧ Analisi di idonei campioni costruiti aggiungendo alla matrice quantità certificate di analita (Spike) a diversi livelli di concentrazione

Ripetibilità

❧ concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenutì con lo stesso metodo su materiali ídentici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo brevi (stessa serie analitica)

Per valutare la ripetibilità si possono usare:

❧ Campioni reali

❧ Materiali di riferimento certificati nella stessa matrice

❧ Materiali di riferimento in matrice ottenuti per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della sostanza pura

Precisione intermedia

❧ Concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su material identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo lunghi (diverse serie analitiche con possibilità di cambiamento del lotto dei reattivi e dei materiali di consumo).

Per valutare la Precisione intermedia si possono usare:

❧ Campioni reali

❧ Materiali di riferimento certificati nella stessa matrice

❧ Materiali di riferimento in matrice ottenuti per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della sostanza pura

Riproducibilità

❧ concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su materiali identici, in laboratori diversi, da operatori diversi, usando apparecchiature diverse e in intervalli di tempo diversi

Incertezza di misura

❧ stima legata ad un risultato di prova che caratterizza l'escursione dei valori entro cui si suppone che cada il valore vero del misurando Ha le dimensioni ‑di uno scarto tipo e si indica con ”U"

Per valutare l’incertezza può essere riassunto nei seguenti punti:

❧ specificazione del misurando (eseguita nel metodo di prova)

❧ definizione della relazione che lo lega alle grandezze misurate nel metodo di prova (ad esempio modello matematico per la misura della concentrazione specificato nel metodo di prova)

❧ identificazione dei fattori che possono contribuire all'Incertezza di misura per ogni stadio del processo eseguito in laboratorio (indicati nel metodo di prova)

❧ raccolta dei dati relativi alle prestazioni del metodo (studi collaborativi, studi di validazione in laboratorio, circuiti inetrlaboratorio)

❧ quantificazione dei vari contributi all'incertezza dai dati relativi alle prestazioni del metodo, esprimendole come varianze o scarti tipo (incertezze tipo):

u(xi)

❧ combinazione delle incertezze tipo per ottenere l'incertezza composta:

uc(y)

❧ trasformazione dell'incertezza composta in incertezza estesa

U(y) = K uc (y)

moltiplicando per il fattore di copertura (K)

In generale K=2.

Robustezza

❧ Insensibilità a piccole variazioni dei parametri sperimentali

❧ Variazioni deliberate

❧ % solventi organici

❧ pH

❧ temperatura

❧ Flusso

Esempio di validazione

❧ Come esempio si riporta la validazione della determinazione dei cloruri solubili negli aggregati per confezione di calcestruzzi in cui abbiamo avuto la necessità di adattare un metodo normato (secondo la norma UNI 8520) ad un metodo più veloce e preciso.

❧ Il metodo normato, dopo l’attacco della sostanza prevede la determinazione dei cloruri in acqua, dopo precipitazione con AgNO3, con un metodo gravimetrico, pesando dopo essiccazione il precipitato, o volumetrico, riprendendo il precipitato e poi retrotitolando con NH4CNS l’argento in eccesso. Questo procedimento è stato semplificato utilizzando la tecnica della cromatografia ionica.

Principio del metodo

❧ Il campione è sottoposto a una solubilizzazione degli ioni attraverso acqua calda, su questa soluzione vengono determinati, tramite cromatografia ionica, i cloruri.

Campo di misura

❧ Il campo di misura varia tra 0,002 % e 0,050 % in peso di cloruri

❧ che rappresenta il range 10 % - 160 % del limite della presenza di cloruri in inerti per la confezione di calcestruzzi.

Taratura Cromatografo Ionico❧ Standard iniziale soluzione a 1000 ± 5 mg/l di

cloruri

❧ Con micropipetta prelevati 100 µl, 250 µl, 400 µl, 500 µl e portati tutti a 100 ml con acqua deionizzata

❧ Ottenute le seguenti concentrazioni:

❧ 1,00/ 2,50/ 4,00/ 5,00 mg/l

❧ Sono state effettuate quattro repliche per ogni concentrazione

❧ Retta di taraturaretta di taratura cloruri

y = 1,07E+06x - 1,15E+04

R2 = 9,98E-01

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

concentrazione mg/l

con

teg

gi d

'are

a

Analisi dei residui

-150000

-100000

-50000

0

50000

100000

150000

0 1 2 3 4 5 6

Limiti di quantizzazione e di rilevabilità

❧ LdR=0,01 mg/l ❧ LdQ = 0,05 mg/l

Incertezza

❧ Ora valutiamo l’incertezza della misuraanalizzando i vari contributi all’incertezza

Incertezza della taratura❧ Incertezza della vetreria e della

diluizione:

❧ Matraccio da 100 ml: 0,00058

❧ Micropipetta:

❧ std 1,00 mg/l = 0,00141

❧ std 2,50 mg/l = 0,000776

❧ std 4,00 mg/l = 0,000663

❧ std 5,00 mg/l = 0,000635

❧ Da cui :

❧ INCtot: 0,00185

Incertezza dovuta alla bilancia❧ Dal certificato di taratura della bilancia,

l’incertezza determinata (per n = 10 misure com i.c. 95%) è 0,040 mg

❧ INCbil = 0.0177 mg

❧ INC/P(10 g) = 0.00000177

Incertezza ripetibilità

❧ Le prove sono state effettuate su un campione di inerte analizzandolo 5 volte ottenendo il seguente risultato:

❧ 0,0346 ± 0,00123

❧ da cui

❧ INC=0,0158

Incertezza dovuta alla taratura lineare

❧ Un aliquota di campione analizzato secondo la procedura precedentemente descritta porta ad avere una incertezza, dovuta alla taratura strumentale di:

❧ INC=0,0103

Incertezza vetreria analisi

❧ Matraccio da 1000 ml

❧ INC=0,00058

Incertezza composta ed estesa

❧ INCglob= 0,0189

❧ Quindi in termini percentuali l’incertezza associata alla determinazione dei cloruri negli inerti è pari a 1,89 % del valore trovato

❧ nel caso precedente si può esprimere il risultato:

❧ Cloruri = 0,0346 ± K*0.000654

Accuratezza

❧ Sono state effettuate 3 serie di 5 misure in giorni diversi su un campione noto, si è ottenuto una media di 0,0345 ± 0,00121 , il campione è dato 0,0352 ± 0,00100 per cui il dato sperimentale rientra nel range del dato sperimentale.

Conclusioni

❧ L’esempio riportato mostra come l’incertezza della misura può essere stimata considerando tutti gli stadi della procedura valutando i singoli contributi.