La sierologia si può usare come screening? Non sul singolo ... · ... latte: eliminazione debole...

La sierologia si può usare come screening?

Non sul singolo animale:

Solo 11,8% (12/102) con PCR ed ELISA pos.

Solo 3,92% (4/102) con PCR e FDC pos.

FDC viene confermata da ELISA

FDC è frequentemente associata allo stato di

animale eliminatore

ELISA va bene come screening di gruppo

Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010

ELISA valido screening ( anche latte) prova

indiretta, Ag in fase I+II

FDC specifica ma poco sensibile - soglia

1:10, Ag in fase II

PCR: eliminazione intermittente,

diagnosi costosa

Attribuzione di indennità non del tutto certa


Non esiste un metodo ufficiale, anche se tutti sono citati dal Manuale OIE

IFAT ed ELISA sono confrontabili

FDC poco sensibile perché: Fattori anticomplementari nel siero

Sub-classi IgG: nei ruminanti solo IgG1 fissano il complemento

IgG2 e IgM possono inibire la FDC da parte di IgG1


IFAT: no kit ad uso veterinario, poco standardizzabile

ELISA: diversi kit e diverse sensibilità

Raccomandato l’uso di kit ELISA con Ag isolati da ruminanti

Da definire i cut-off

Sierologia da sola non è sufficiente


Fondamentale perché: I segni clinici non sono specifici C’è un’alta frequenza di infezioni inapparenti I gruppi con alta prevalenza di infezione sono

anche quelli importanti per la salute pubblica Diagnosi differenziali: agenti abortigeni

(Brucella, Chlamydophila, Toxoplasma, Salmonella, ecc.)


Immunità umorale – Ab rilevabili 2-3 sett. PI; prima anti-fase II

Eliminatori sieronegativi

Immunità cellulo-mediata: cruciale per la protezione – skin test, IFN- test

Modulazione tra IFN-e IL-10 (dipendente da ospite, ceppo, DI)

Risposta a vax anti fase II vs fase I


Sieroconversione sul singolo è solo indicativa di circolazione dell’agente

Sierologia ok se combinata alla PCR

Sieri da gruppo di soggetti con problemi rirpoduttivi/aborto: almeno 6 animali, 3 primipare e 3 pluripare, che hanno abortito (tra 15 gg e 4 mesi), o con problemi riproduttivi


Animali possono restare sieropositivi per anni dopo infezione acuta

Alcuni eliminano Coxiella prima di sieroconvertire

Alcuni non sieroconvertono

Non distinguibile vaccinazione

Skin test per selezionare animali negativi da vaccinare


PCR: ad oggi il metodo più rapido e sensibile per identificare gli eliminatori

Real-time PCR: quantificazione

Specificità comparabile tra diversi laboratori

Sensibilità: multiple copy target IS1111 più sensibile

Matrici: tampone vaginale, placenta, (alta carica), latte (bassa carica), feci, urine, sperma (sporadici)


L’eliminazione può persistere per mesi, ma la massima escrezione avviene entro una settimana da parto o aborto

Campione: tampone vaginale, placenta, cotiledoni (aree necrotiche), organi fetali (milza, polmone, fegato) o contenuto abomasale del feto

Conferimento al laboratorio per estrazione DNA entro 48-72 ore, campione a +4°C


Tampone vaginale/placenta: matrici ideali Feci, latte: eliminazione debole e/o discontinua Latte di massa: eliminazione frequente in

vacche asintomatiche, meno in pecore Capre: osservate tutte e tre le vie, ma il latte

sembra una via frequente LATTE DI MASSA: buono screening per bovini

e capre (ma non per diagnosi di aborto)


PCR su placenta o tampone vaginale: 104 batteri/g

In tessuti fetali o contenuto abomasale del feto: è sufficiente un risultato positivo

Per campioni in pool (tamponi): 103 batteri/g per pool

Alla lettura dell’esito: soglia di positivit{ Real-time PCR è Ct<40


Soggetti N. campioni Analisi Numero

Feti/vacche

Aborto<8gg

Tampone vag.

placenta

organi fetali

Real-time PCR Fino a 3 vacche

Aborti tra i 15 gg

e 4 mesi prec.

Siero ELISA

Almeno 6 (3

primipare e 3

pluripare)

Vacche con

problemi

riproduttivi

Solo se il primo

gruppo è <6

(Vacche di

controllo)

Es. 2 aborti analizzati:

a) Entrambi PCR+: diagnosi confermata

b) 1 PCR+ e sierologia con meno di 50% di positività: ritestare dopo 3 settimane

a) >50% positivi: confermata

b) <50% positivi: improbabile

c) Entrambe PCR -: diagnosi esclusa


Es. 1 aborto analizzato + 6 sieri:

a) PCR+ e sierologia >50%: confermata

b) PCR+ e sierologia <50%: ritestare dopo 3 settimane, come sopra

c) PCR- e sierologia >50%: testare altri aborti

d) PCR- e sierologia <50%: esclusa


Se PCR è negativa, la sierologia:

a) >50% positivi: sospetto – monitorare aborti con PCR

b) <50% positivi: esclusa


Soggetti N. campioni Analisi Numero

Feti/capi

Aborto<8gg

Tampone vag.

placenta

organi fetali

Real-time PCR

+ d.d.

2 PCR individ.

2 pool di 3 capi

Se c’è solo 1 campione per PCR o se 1 è negativa

Aborti tra i 15 gg

e 3 sett. prec.

Siero ELISA

Almeno 10 capi,

privilegiando

quelli con

problemi

Capi con

problemi

riproduttivi

(Capi di

controllo)

Es. 2 aborti analizzati

a) Entrambi PCR+: diagnosi confermata

b) 1 PCR+: testare nuovi soggetti con PCR, se almeno un altro è +: conferma

c) Entrambe PCR-: diagnosi esclusa


Es. 1 aborto analizzato + 10 sieri:

a) PCR+ e sierologia >50%: confermata

b) PCR+ e sierologia <50%: caso isolato? Monitorare nuovi casi

c) PCR- e sierologia >50%: monitorare nuovi casi

d) PCR- e sierologia <50%: esclusa


Es. disponibili solo sieri (10 o più)

Se 50% o più positivi, diagnosi confermata

Se meno di 50%, continuare monitoraggio sui nuovi casi


Protocollo diagnostico (Rodolakis 2006)

PCR su latte di massa

Sierologia su 10 vacche–problemaPCR +, sierologia > 50%: sì FQPCR +, sierologia < 30%: FQ recentePCR -, sierologia > 60%: sospetto moderatoPCR -, sierologia < 30%: sospetto debolePCR -, sierologia 0: no FQ


Aborti tardivi, natimortalità, nascita di soggetti deboli (fino al 90% delle femmine gravide può essere infetta)

PCR o isolamento positivo (tampone vaginale, placenta o feto)

Sierologia positiva (>50%)


Stalle < 100 capi: 2 aborti/mese o 3/anno Stalle > 100 capi: >4% di aborti/anno Metriti, infertilità, aborti, vitelli con scarso peso alla

nascita Altri sintomi: polmoniti, aborti, parti prematuri, nati

deboli, metriti, infertilità PCR o isolamento positivo (tampone vaginale,

placenta o feto) Sierologia positiva >50%


Aborto / parto

Una settimana dopo il parto / aborto nello scolo vaginale

Fino a 2 anni nel latte

Discontinua nelle feci

Urine?

Migliori matrici per PCR sono: placenta, latte, tampone vaginale nei primi giorni dall'aborto


Treviso 2007: problemi diffusi di infertilità inallevamento di bovine da latte. Esclusi BVDV,Neospora caninum, Brucella abortus, IBRV,Chlamydophila spp. e Leptospira spp.

Sieropositivi per Febbre Q 4/6 animali.Monitorate le diverse vie di eliminazione e la persistenza

dell’infezione


Campioni individuali di siero, tamponi vaginali, feci e latte sulle 77 vacche (42 in lattazione)

Selezionati 20 animali (10 positivi + 10 negativi) per “follow-up study”. “Positive” se positivi almeno a 2 test; “negativi” se negativi a tutti i tests.

Ogni 3 mesi: Real-time PCR su latte, feci e tamponi vaginali sui 20 soggetti, sierologia su tutte le vacche in lattazione.


Table 1: sampling timetable and results of the different assays used for C. burnetii

No. positives/total examined (%)

PCR Sampling

date CFT ELISA

Milk Faeces Vaginal swab 28/05/07 2/6

(33.3)

4/6

(66.6)

-- -- --

19/06/07 1/6

(16.6)

4/6

(66.6)

2/6

(33.3)

-- --

01/08/07** 4/77

(5.2)

61/77

(79.2)

6/43

(13.9)

9/77

(11.7)

1/54

(1.85) 22/08/07 3/9 8/9 6/7 -- -- 10/10/07 3/50

(6)

27/50

(54)

7/22

(31.81)

2/20

(10)

4/20

(20) 23/11/07 1/51

(2.0)

27/51

(53.9)

-- -- --

07/02/07 2/46

(4.3)

23/46

(50)

8/21

(38,1)

0/20

(0)

1/20

(5)

** first screening on the whole herd

Table 1: sampling timetable and results of the different assays used for C. burnetii

No. positives/total examined (%)

PCR Sampling

date CFT ELISA

Milk Faeces Vaginal swab 28/05/07 2/6

(33.3)

4/6

(66.6)

-- -- --

19/06/07 1/6

(16.6)

4/6

(66.6)

2/6

(33.3)

-- --

01/08/07** 4/77

(5.2)

61/77

(79.2)

6/43

(13.9)

9/77

(11.7)

1/54

(1.85) 22/08/07 3/9 8/9 6/7 -- -- 10/10/07 3/50

(6)

27/50

(54)

7/22

(31.81)

2/20

(10)

4/20

(20) 23/11/07 1/51

(2.0)

27/51

(53.9)

-- -- --

07/02/07 2/46

(4.3)

23/46

(50)

8/21

(38,1)

0/20

(0)

1/20

(5)

** first screening on the whole herd

Table 2: results of the tests conducted on 20 cows (10 positives and 10 negatives)

selected after the first screening

No. positives/total examined

PCR

CFT ELISA Milk Faeces

Vaginal

swabs

Sampling

date

positives negatives positives negatives positives negatives positives negatives positives negatives

01/08/07 4/10 0/10 10/10 0/10 4/10 0/10 1/10 0/10 0/10 0/10 22/08/07 3/8 -- 7/8 -- 6/7 -- -- -- -- -- 10/10/07 3/10 0/10 10/10 0/10 5/10 1/10 1/10 1/10 3/10 2/10 23/11/07 1/10 0/10 10/10 1/10 -- -- -- -- -- -- 07/02/08 2/10 0/10 9/10 1/10 4/10 0/10 0/10 0/10 1/10 0/10


Sierologia: FDC conferma bassa sensibilità ma anche alta specificità e riproducibilità nel tempo (variazione titoli da 1:64 a 1:128).

Gli animali FDC positivi sono stati ripetutamente classificati come escretori.

ELISA più sensibile, la positività si mantiene nel tempo (tranne 1 caso), e si rilevano 4 sieroconversioni. Manca una relazione con escrezione. Presenza sporadica di escretori sieronegativi.

Real-time PCR: ha permesso di identificare i nuovi escretori. Prevalenza di eliminazione con il latte, ma osservata anche in muco vaginale e feci. Nessun animale elimina nelle 3 vie in contemporanea.


Azienda di vacche da latte con casi di aborto e disordini riproduttivi

Capi esaminati per Coxiella burnetii mediante 2 test sierologici: ELISA indiretta e FDC.

Il latte individuale di ogni vacca in lattazione testato in Real-time PCR; sulla base dei valori Ct, gli animali sono stati classificati in forti (Ct≤31) e deboli (Ct>31) eliminatori


Classi di età Esito sierologico

ELISA* < 3 anni 3 - 5 anni > 5 anni Totale

Negativi 104 80 23 207

Positivi 3 32 14 49

Totale complessivo 107 112 37 256

Mandria suddivisa in 3 classi d’età (<3 anni, 3-5 anni, >5 anni), e le vacche in lattazione in 2 classi (<5 anni e ≥5 anni).

Classi di età Ct

< 5 anni ≥ 5 anni Totale

≤ 31 (forti eliminatori) 1 6 7

> 31 (deboli eliminatori) 16 3 19

Totale complessivo 17 9 26

PCR +

su latte

PCR –

su latte Totale

PCR + /

totale (%) Ct ≤ 31 Ct > 31

Gruppo 1: sierologicamente

negativi 13 82 95 13,68 0 13

Gruppo 2: sierologicamente

positivi 13 25 38 34,21 7 6

Correlazione significativa tra età e prevalenzasierologica, e tra età e status di forte eliminatore.

Risultati biomolecolari e sierologici a confronto: lacondizione di forte eliminatore è correlata ad unasierologia positiva.

L’utilizzo combinato di ELISA ed FDC è d’aiutonell’identificazione dei forti eliminatori, riducendo ilnumero di PCR necessarie allo stesso scopo e quindii costi di gestione

Sieroprevalenza Piano Aborti

ELISA: positivi 18, 5% (65/351)

FDC: 1,4% (5/353)

Totale Triveneto

ELISA: positivi 15,6% (994/6384)

FDC: 0,7% (44/6384)

Positivi a entrambi: 0,6% (39/6384)


PCR Piano Aborti: positivi 2,9% (10/344)

Probabilmente sottostimata (poche placente)

Totale Triveneto:

Campioni positivi 12.3% (102/829)

Gruppi di animali con almeno una positività

31,6% (102/323)

· Sovrastimato (esami ad hoc)


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