Prima descrizione di patologia di origine virale: Vaiolo in Cina nel X secolo a.C.

Alterazioni simil-vaiolose nella mummia del faraone Ramsete II (circa 2000a.C.).

Tentativi di prevenzione e cura di patologie di origine virale in atto prima della scoperta dei virus stessi (Jenner, vaccinazione antivaiolosa alla fine del ‘700).

Prima identificazione di virus: fine dell’800 da parte di Loeffler (afta epizootica).

La scoperta dei virus

Agenti patogeni in grado di infettare cellule animali, vegetali e batteriche.

Le particelle virali complete, virioni, sono caratterizzate da dimensioni estremamente modeste: 10-300 nm.

Sono definiti parassiti endocellulari obbligati perché possono replicarsi soltanto all’interno di cellule viventi: essi non sono in grado di produrre e di immagazzinare energia né di provvedere alla replicazione delle proprie unità costitutive.

Sono caratterizzati da una semplicità di organizzazione strutturale.

Possiedono particolari modalità di replicazione.

Virus: proprietà distintive

I virus rappresentano la forma vivente piu’ semplice. Non hanno una compartimentazione di tipo cellulare.

Sono, a tutti gli effetti, dei semplici aggregati macromolecolari forniti di, ed in grado di trasferire, informazioni genetiche.

Alcuni agenti infettanti subvirali (viroidi) sono costituiti da solo materiale genetico (RNA) senza guscio proteico. Altri, i prioni, sarebbero costituiti da soli frammenti glicoproteici autoreplicanti, senza acido nucleico. Alcuni di essi colpiscono il sistema nervoso, determinando malattie mortali tutt’oggi incurabili (kuru, scrapie, malattia di Creutzfeld-Jacob). Sono al limite tra forma vivente e non vivente.

Virus: proprietà distintive

Electron micrograph of PRION PROTEIN(scrapie associated fibrils) Bar=100nm(Courtesy of Dr. A.C. Scott of CentralVeterinary Laboratory, UK)

Date le loro caratteristiche, i virus sono assolutamente incapaci di replicarsi al di fuori delle cellule bersaglio.

Sopravvivono un tempo limitato (pochi minuti o alcuni giorni, a seconda del tipo virale) nell’ambiente extracellulare, senza mai replicarsi fuori dalle cellule.

Come parassiti intracellulari obbligati, i virus necessitano non solodegli elementi nutritivi prodotti dalle cellule ospiti, ma soprattuttodei sistemi di trascrizione e traduzione di tali cellule.

Contengono enzimi propri indispensabili per il ciclo replicativo(polimerasi, proteasi, ecc). Tutti gli altri enzimi sono resi disponibili dalla cellula ospite.

Virus: proprietà distintive

I virus attraversano i comuni filtri, sono invisibili al microscopio ottico (con l’eccezione di alcuni virus particolarmente grandi, quali i poxvirus)ma visibili al microscopio elettronico (meglio a trasmissione).

Determinano spesso, nelle cellule infettate, la presenza di corpi inclusi intranucleari o citoplasmatici.

Virus: proprietà distintive

Micrografo con i virus numerosi di rabbia (piccolo scuro-grigio asta-come le particelle) ed i corpi di Negri, più grandi inclusioni cellulari tipiche dell'infezione di rabbia.

Sono coltivabili in vitro in cellule isolate da organismi, o in batteri (a seconda del tipo virale).

Alcuni (Orthomyxovirus, paramyxovirus) possono essere coltivabili con facilita’ in uova embrionate.

Hanno resistenza variabile al pH. Questo regola la loro patogenicita’

- Es. Rinovirus sono distrutti a pH3 (pH gastrico di circa 1) e pertanto sono non patogeni per l’apparato gastrointestinale.

- Altri picornavirus sono resistenti al pH gastrico e pertanto patogeni (enterovirus).

Virus: proprietà distintive

Data questa loro caratteristica naturale, sono usati, nella manipolazione genetica, come vettori finalizzati al trasferimento di nuovi caratteri a cellule infettabili da un determinato virus.

Virus: proprietà distintive

I virus rappresentano un sistema altamente sofisticato di trasferimento genetico da cellula a cellula.

Tramite i virus, e’ possibile modificare il corredo genetico (e quindi fenotipico) di una cellula, favorendone, quindi, l’acquisizione di nuovi caratteri.

Sono concentrabili in vitro solo con l’uso delle ultracentrifughe (20000 e piu’ giri al minuto). La ultracentrifugazione su gradiente di densità permette di separare particelle virali della stessa specie virale, ma aventi densità leggermente diversa a causa di quantitàdiverse di proteine o di acido nucleico presente.

L’esame al microscopio elettronico permette sia la conta delle particelle virali, sia la loro caratterizzazione morfologica.

Virus: proprietà distintive

Human immunodeficiency viral particles are seen at medium magnification in this electron micrograph.

A seconda del loro specifico tropismo, possono infettare cellule vegetali (virus del tabacco, della patata, ecc), batteri (batteriofagi, ognuno specifico per una determinata specie batterica), e cellule animali (virus di insetti, pesci, uccelli, mammiferi).

Virus: proprietà distintive

VIRUS H5N1 O

INFLUENZA AVIARIA

BATTERIOFAGO

Electron micrograph of TMV particles

I VIRUS SONO INSENSIBILI AGLI ANTIBIOTICI

Virus: proprietà distintive

Core Acido nucleico più ogni molecola che ne determina la stabilità

Capside Struttura proteica che racchiude l’acido nucleico o il core

Capsomero Unità proteica che, ripetuta, forma il capside icosaedrico

Nucleocapside Acido nucleico più capside

Envelope Involucro lipoglicoproteico esterno

Peplomeri Proiezioni superficiali che protrudono dall’envelope

Virione Particella virale completa come si può osservare al di fuori della cellula

Costituenti virali

Virus nudi acido nucleicoproteine

Virus rivestiti acido nucleico(con envelope) proteine

lipidicarboidrati

Lipidi e carboidrati sono contenuti nella membrana limitante esterna: sono identici a quelli della cellula ospite e non sono codificati dal virus

Composizione chimica

Si distinguono:

Proteine funzionali che permettono ad es. all’acido nucleico virale di replicarsi (DNA-o RNA-polimerasi)

Proteine strutturali: incorporate nelle nuove particelle virali come costituenti del capside o come strutture particolari (es. le emoagglutinine) presenti nell’envelope

Proteine che alterano alcune funzioni e strutture della cellula ospite

Proteine strettamente associate agli acidi nucleici

Proteina di matrice o M

Proteine virali

I virus, nella loro forma extracellulare (virione), hanno una struttura cristallizzata tipica

Di contro, all’interno delle cellule in cui si replicano, non sono mai reperibili in forma completa, eccetto che poco prima della loro uscita dalla cellula (fase di gemmazione)

Di norma, all’interno delle cellule e’ possibile trovare materiale genetico del virus, e proteine virali piu’ o meno assemblate

MORFOLOGIA VIRALE

HIV

La struttura di base dei virus consiste nell’acido nucleico e in un rivestimento proteico detto capside.

Il genoma contiene tutta l’informazione genetica necessaria per la replicazione; è molto labile ad agenti denaturanti (nucleasi, esterasi, forza ionica ecc.) e non può da solo penetrare nella cellula ospite .

La quantità di acido nucleico è indice della complessità strutturale del virione.

Il capside costituisce una struttura continua e impermeabile agli agenti esterni e protegge l’acido nucleico. Alcune proteine che lo compongono possiedono una specifica affinità per particolari recettori della membrana citoplasmatica della cellula ospite. Queste strutture permettono il legame del virus alla cellula e la penetrazione dell’acido nucleico.

Alcuni virus posseggono una membrana limitante esterna detta envelope, (o pericapside o peplos).

I virus con il solo capside vengono definiti “nudi”, quelli con envelope vengono definiti “rivestiti”.

I virus più grandi possono avere una struttura più complessa.

Morfologia virale

Strato lipidico (in alcuni casi glicoproteico) esterno all’involucro, presente solo in alcune famiglie di virus (orthomyxovirus, herpesvirus, retrovirus, poxvirus, ecc.).

E’ costituito da lipidi della membrana della cellula infettata, rimasti intorno al virus vero e proprio al momento della fuoriuscita dalla cellula stessa (“budding”).

Contiene anche alcune glicoproteine virali, che fungono da primo recettore virale nei confronti delle cellule bersaglio.

Svolge funzione di protezione, di riconoscimento antigenico (emoagglutininadel virus influenzale) e di penetrazione nella cellula ospite tramite il meccanismo di fusione con la membrana cellulare.

La presenza del pericapside rende ragione della sensibilita’ di alcuni virus ai disinfettanti organici (eteri, alcooli) in grado di sciogliere i lipidi.

Pericapside (peplos, envelope)

Componenti dell’involucro virale(envelope)

La base di tutti gli involucri virali è una membrana lipidicaacquisita dalla cellula ospite durante l’assemblaggio.

Proteine virali vengono inserite nella membrana lipidica.

La grande maggioranza di queste sono glicoproteine (oligomeri).

Funzioni delle proteine dell’involucro

Orthomyxovirus

Aggancio, fusione ed entrata(es. HA)

Attività enzimatica(es. NA)

Canale ionico(es. M2)

Antigeni principali(es. HA, NA)

Virus con involucro semplice

Contatto diretto tra proteine esterne e capside

Sezione equatoriale di un Togavirus con ricostruzione dell’immagine

Virus con involucro a livelli proteiciaddizionali

Struttura di un herpesvirus

E’ proprio del virus, e’ geneticamente determinato e costituito da subunità proteiche disposte in modo regolare, codificate dal genoma virale.

Dato il limitatissimo patrimonio genetico dei virus, le proteinecostituenti i capsomeri (unità base del capside) sono molto poche, specifiche del virus, e in grado di interagire con i componenti sulla superficie cellulare fungendo da recettori.

Conferisce resistenza al materiale genetico virale nei confronti delle nucleasi presenti nei fluidi.

Capside

Il capside è costituito da proteine codificate dal genoma virale la cui ridotta lunghezza permette una sintesi limitata di proteine. Il capside in genere è quindi costituito da unità ripetitive di una o poche proteine.

Le proteine destinate a formare il capside sono capaci di autocombinarsi (assemblaggio) seguendo due schemi fondamentali definiti:

-a simmetria elicoidale

-a simmetria cubica (detta anche icosaedrica)

Simmetrie del capside

La simmetria virale, dovuta all’interazione genoma-proteine, puo’essere:

a. Elicoidale, quando l’acido nucleico si avvolge sulla struttura proteica di base, determinando, al microscopio elettronico, una forma oblunga (virus del mosaico del tabacco, orthomyxovirus, rhabdovirus., ecc). Tutte le subunita’ proteiche sono identiche tra loro

b. Icosaedrica, quando i capsomeri (unita’ base dell’icosaedro costituente il capside) sono organizzati a costituire una struttura poliedrica regolare con 20 facce costituite da triangoli equilateri. All’interno e’ situato il nucleocapside, aderente in alcuni punti ai capsomeri. E’ presente nella maggioranza dei virus

c. Complessa, A struttura non classificabile secondo canoni ristretti: batteriofagi, poxvirus, ecc.

Tutti i virus di un determinato tipo saranno assolutamente uguali tra loro

Le sub-unità proteiche, dette protomeri, si dispongono lungo un asse elicoidale intorno all’acido nucleico a formare il nucleocapside che assume struttura tubulare.

Nella maggior parte dei casi i virus animali con questa simmetria possiedono l’envelope.

Vari nucleocapsidi si differenziano per lunghezza, diametro, passo dell’elica e numero di protomeri per spira.

Gli involucri pericapsidici conferiscono ai virioni forma pleiomorfa.

Virus a simmetria elicoidale

Influenza virus

Virus della rabbia

Rabdovirus en una célula epitelial de un pez © Dennis Kunkel Microscopy, Inc

Rabdovirus yemando de una inclusión (cuerpo de Negri) hacia el retículo endoplásmico en una célula del sistema nervioso.A. Cuerpo de Negri. B. Note la abundante ribonucleoproteína en la inclusión. C. Rabdovirus yemando. CDC

Il capside in questo caso costiuisce una sorta di guscio per il genoma.

Le sub-unità proteiche costituite da una singola molecola polipeptidica o da un aggregato di molecole peptidiche si riuniscono a formare le unità morfologiche, dette capsomeri, del capside.

I capsomeri si combinano a formare solidi regolari.

L’icosaedro è un solido costituito da 20 facce triangolari e 12 vertici.

I vari virus con questa simmetria si differenziano per numero e distribuzione dei capsomeri.

Alcuni sono virus nudi, altri posseggono l’envelope.

Virus a simmetria icosaedrica

Ricostruzione di differenti particelle virali a simmetria icosaedrica

Elementi caratterizzanti alcune famiglie di virus:

a. Rotavirus: doppio capside (struttura a ruota).

b. Adenovirus: estroflessione dal capside che funge da recettorevirale sulla superficie cellulare.

c. Arenavirus: aspetto sabbioso determinato dall’inglobamento di ribosomi durante il ciclo replicativo intracellulare.

Electron micrograph of rotavirus from stool sample

Caratteristiche virali

Electron micrograph of human adenovirus

Arenavirus

Struttura dei capsidi viraliSimmetria complessa

poxvirus

Simmetria complessa

Batteriofago T4: simmetria complessa

Area interna del virus, in cui si trova il materiale genetico del virus (a RNA o a DNA, a seconda del tipo virale), frammisto a proteine anch’esse proprie del virus, in parte strutturali (che impacchettano e stabilizzano il genoma) e in parte funzionali (polimerasi, proteasi, ecc.).

Puo’ essere compatto (Alfavirus), Filamentoso (Paramyxovirus), multisegmentato (Ortomyxovirus).

Core (o nucleocapside)

Perché la costruzione di una sub-unitàè comune a tutti i virus?

Auto assemblamentoNel 1955, Fraenkel-Conrat e Williams dimostrarono che quandomiscele di RNA di virus del mosaico del tabacco purificato (TMV) e proteina coat venivano incubate insieme, si formavano particelle divirus elicoidale. Questo indica che la particella di virus si ordina dasola e predispone la struttura con la minima energia libera, ad es. la più stabile. Incorporare copie multiple di una o diverse sub-unità èpresumibilmente un modo semplice per portare a termine tutto ciò.

Capside virale

I virus nudi di origine animale hanno una simmetria esclusivamente di tipo icosaedrico.

I virus con envelope possono avere il nucleocapside sia a simmetria elicoidale sia a struttura icosaedrica.

I virus più grandi (come i Poxvirus) possono avere una struttura morfologica più complessa.

Capside virale

Tutti i virus contengono un solo tipo di acido nucleico.Quelli a RNA, in particolare, rappresentano un’eccezione in natura, in quanto la loro informazione genetica non e’ contenuta nel DNA. A seconda del tipo virale, il genoma codifica per un numero diverso di proteine, da un minimo di 3 a un massimo di alcune centinaia.

A seconda dei vari tipi di virus, il genoma (DNA o RNA) puo’ essere a singolo o doppio filamento, lineare o segmentato in varie porzioni (es. virus influenzale) ognuna codificante per una proteina.

Tra i virus a RNA, alcuni hanno il filamento cosiddetto positivo (che funge anche da RNA messaggero), altri hanno il filamento negativo (che deve sintetizzare, sul suo stampo, un filamento complementare di RNA che fungera’ da messaggero).

Genoma virale

Genoma dell’epatite B

E’ costituito da un solo tipo di acido nucleico:

DNA o RNA

Virus a RNA: Ribovirus

Possiedono un RNA a singola elica (tranne la famiglia dei Reovirusche ha un RNA a doppia elica), del peso di circa 2-10 x 106 daltons, a volte (orthomyxovirus) diviso in frammenti. Nei reovirus e’ a doppio filamento segmentato (piu’ resistente del singolo filamento all’RNAsi e ai disinfettanti).

Genoma virale

Si dividono in 2 sottoclassi:

Virus con RNA a polarità positiva (+) che può fungere nella cellula direttamente da RNA messaggero.

Virus con RNA a polarità negativa (-) che funge da stampo per la sintesi dell’RNA messaggero- questi virus hanno l’enzima RNA polimerasi RNA dipendente associato al virione.

I Reovirus e alcune famiglie di virus a RNA a polarità negativa hanno un genoma con sequenze indipendenti di RNA (virus influenzale con 8 frammenti, bunyavirus con 3, Reovirus con 12).

VIRUS AD RNA

Virus a DNA: Deossiribovirus

Normalmente hanno un DNA a doppia elica con filamento unico e lineare.

Alcuni virus (Papovavirus ed Hepadnavirus) contengono DNA circolare e altri (Parvovirus) hanno un DNA monocatenario.

La grandezza del genoma dà la misura della complessità del virus e della sua replicazione (più evidente nei virus a DNA rispetto ai virus a RNA).

Genoma virale

DNA: La molecola di DNA e’ unica, del peso da 1,5 x 106 daltons(parvovirus, gran parte dei batteriofagi) a 200 x 106 daltons(poxvirus), solitamente a doppio filamento lineare, con l’eccezione dei parvovirus (singolo), papovavirus (doppio filamento circolare), hepadnavirus (doppio filamento incompleto, circolare).

Il contenuto in guanina-citosina nei retrovirus (che si integrano nel genoma delle cellule ospiti) e’ simile a quello riscontrato nelle cellule stesse (circa 50% del totale), e questo probabilmente favorisce l’interazione tra i due DNA.

VIRUS A DNA

Enzimi virali

Altri componenti virali

Aiutano la replicazione virale ma non sono incorporate nelvirione

Enzimi necessari per la sintesi e la replicazione del DNA(es. RNR, TK, DNA polimerasi di Herpesviruses)

Proteine che influiscono sulla fisiologia della cellule (es. E6/E7 di papillomavirus umani)

Proteine che sopprimono le difese della cellula ospite(es. Inibitori della presentazione di antigeni)

Proteine non strutturali

Adenovirus

Alcune forme virali

Alcune forme virali

Papillomavirus

Alcune forme virali

Herpesvirus

Alcune forme virali

Paramyxovirus Orthomyxovirus

Vesicular stomatitis virus

Alcune forme virali

Human immunodeficiency virus

Alcune forme virali

Alcune forme virali

Ebola virus

Si basa su criteri morfologici, strutturali, chimici e replicativi: forma,dimensioni, tipo e struttura del genoma, strategia replicativa

In base a queste caratteristiche i virus vengono suddivisi in:

Famiglie (con suffisso –viridae)

Sottofamiglie (generalmente con suffisso –virinae)

Generi (con suffisso –virus)

Specie

Ulteriori suddivisioni in sottospecie, tipi, ceppi ecc. vengono di volta in volta stabilite da apposite commissioni per la nomenclatura in base a criteri che risultino via via accettati.

Classificazione virale

Nella pratica medica si continuano a indicare i virus secondo la nomenclatura comune:

con il nome “virus” seguito da quello della malattia che determina nell’ospite principale (per es. virus del morbillo, dell’influenza, della poliomielite ecc.)

oppure

con il nome che gli è stato attribuito al momento dell’isolamento (per es. virus Ebola, di Epstein-Barr, Norwalk ecc.).

Classificazione virale

L’attuale classificazione si basa:

sul tipo di genoma (DNA o RNA) e la sua configurazione (mono o bicatenario, lineare o circolare, monofilamento o segmentato, a polarità positiva o negativa)

sul tipo di simmetria

sulla presenza di involucro pericapsidico

sul meccanismo di replicazione

Molti virus non sono stati ancora classificati oppure lo sono solo provvisoriamente

Per alcuni agenti non è ancora stata accertata la natura virale (per es. gli agenti delle encefaliti spongiformi dell’uomo e di vari animali)

Classificazione virale

Classificazione dei virus

Criteri di classificazione

• Natura dell’acido nucleico nel virione : RNA o DNA• Simmetria del capside: icosaedrico, elicoidale ocomplesso

• Presenza o assenza di un involucro

• Architettura del genoma: ds, ss, frammentato, dimensione

• Ospiti: animali, piante, batteri.

• Omologia di sequenza• Strategie di replicazione

International Committee onTaxonomy of Viruses

Nomenclatura: alcune regole basilari

• Ordine ( - virales)• Famiglia ( - viridae)• Sottofamiglia ( -virinae)• Genere ( - virus)• Specie (common names)

Nomenclatura: alcune regole basilari

genere o sottofamigliagenere o sottofamiglia

enterovirus cardiovirus rhinovirus aphthovirus hepatovirus

Picornaviridae famigliafamiglia

speciespecie

poliovirus mengovirus rinovirus FMDV-C virus dell’epatite A67 sierotipi > 100 sierotipi

Il sistema di classificazione Baltimore

Class I ds DNA

Class II ss DNA

Class III ds RNA (+/-)

Class IV ss RNA (+)

Class V ss RNA (-)

Class VI ss RNA (+)

Parvovirus(B19)

AdenovirusHerpesvirusPapovavirus

Poxvirus

ReovirusPicornavirusFlavivirusTogavirus

Retrovirus

OrthomyxovirusParamyxovirusRhabdovirus