'introduzione della microbiologia nel-l'industria farmaceutica, che eb-be inizio negli anni quaranta, ha

prodotto una trasformazione abbastanzaprofonda da poter essere definita rivolu-zione. I progressi nella conoscenza deimicrorganismi e delle tecniche per mani-polarli geneticamente sono oggi utilizzaticorrentemente nell'identificazione dinuove sostanze terapeutiche, nella ricercaapplicata e negli stessi procedimenti perla produzione industriale. Le reazionichimiche collegate che costituiscono il si-stema metabolico di un microrganismorappresentano il mezzo di produzione. Inenormi serbatoi, colture di cellule geneti-camente identiche e selezionate per laloro alta resa sono immerse in un riccoterreno nutritivo, da cui vengono succes-sivamente estratti e sottoposti a ulterioritrasformazioni i prodotti del metabolismoche posseggono un valore farmaceutico.

Queste colture cellulari su grandissimascala vengono impiegate nell'industriafarmaceutica in tre maniere, che possonoessere differenziate sulla base di quantaparte dell'informazione necessaria per laproduzione delle sostanze in questione èpresente nel genoma inalterato del mi-crorganismo. Nel caso degli antibiotici ilprodotto è un metabolita naturale e tuttal'informazione per la sua sintesi è conte-nuta nella cellula nel suo stato naturale.(Anche in questo caso tuttavia il prodottoviene spesso modificato successivamentecon metodi chimici.) L'identificazionedella penicillina, un metabolita naturaledella muffa Penicillium, diede inizio allemoderne tecnologie farmaceutiche.

Dal punto di vista commerciale e clini-co gli antibiotici costituiscono la classe piùimportante di sostanze farmaceuticheprodotte con tecniche microbiologiche.Tuttavia tecniche simili sono anche stateadattate alla produzione di sostanze chenon sono metaboliti naturali dei micror-ganismi. Nella produzione degli ormonisteroidei i microrganismi eseguono singo-

li passaggi, chiamati bioconversioni, diuna lunga sequenza di processi di sintesi;gli altri passaggi vengono realizzati conmetodi non biologici. Solo le informazio-ni per i pochi passaggi biologici risiedononel genoma del microrganismo.

Nel terzo tipo di procedimento nessunadelle informazioni che definisce la strut-tura della molecola di prodotto si trovainizialmente nel genoma del microrgani-smo; l'informazione viene inserita nellacellula dall'esterno. In questo modo cellu-le batteriche o fungine possono venireprogrammate per la produzione di pro-teine umane. Metodi di questo tipo sonoattualmente allo studio per la produzionedi sostanze farmaceutiche estremamenteimportanti come l'insulina. Sebbene que-ste tecniche siano le più recenti e affasci-nanti utilizzate dall'industria farmaceuti-ca, esse sono già riuscite a inserirsi vali-damente in un settore in cui i metodi mi-crobiologici hanno già prodotto un enor-me sviluppo commerciale. Nel 1979 il valo-re complessivo dei prodotti farmaceuticiprescritti e venduti negli Stati Uniti è statodi circa 7,5 miliardi di dollari; di cui circa il20 per cento, cioè circa 1,5 miliardi di dolla-ri, rappresenta la vendita di farmaci prodot-ti mediante microrganismi.

Una categoria molto importante difarmaci è rappresentata dai prodotti diorganismi nel cui genoma inalterato ècontenuta tutta l'informazione genetica

necessaria. Gli antibiotici sono i membrieconomicamente più importanti di questaclasse, ma essa include anche antigeni vi-rali e batterici, agenti antifungini, alcunifarmaci antitumorali, alcaloidi e vitami-ne. Nel 1978 le vendite in tutto il mondodei quattro più importanti gruppi di anti-biotici - le penicilline, le cefalosporine, letetracicline e l'eritromicina - hanno rag-giunto i 4,2 miliardi di dollari. (Le venditesono riferite al 1978 poiché questo è l'ul-timo anno per cui è disponibile un'infor-mazione completa per il mercato interna-zionale; la cifra è stata adattata ai prezzidel 1980 per compensare gli effetti dell'in-flazione.) Un altro gruppo commercial-mente importante è costituito dagli ammi-noglicosidi, che includono la streptomici-na. Dopo gli antibiotici i prodotti farma-ceutici con il maggior volume di venditesono state le vitamine; il valore all'ingrossodelle sei più importanti vitamine nel 1978(ancora rapportato ai prezzi 1980) è statodi 670 milioni di dollari.

Il procedimento industriale che sta allabase di questo mercato è la fermentazione. Ifermentatori, o serbatoi in cui avviene laproduzione metabolica delle sostanze far-maceutiche, hanno un volume massimo dicirca 100 000 litri. Le colture di ceppi indu-striali di funghi o batteri vengono inizial-mente poste in serbatoi più piccoli e succes-sivamente trasferite ai fermentatori grandi,in cui è mantenuto uno stretto controllo

La produzione di penicilline viene realizzata per mezzo di una combinazione di passaggi chimici ebiologici; sono qui mostrati i cristallizzatori, dove avviene uno dei passaggi chiave della produzio-ne. La produzione ha inizio nei serbatoi di fermentazione che hanno una capacità che raggiunge i100 000 litri. In questi serbatoi viene fatto crescere un ceppo industriale della muffa Penicilliumchrysogenum in un ricco brodo di coltura; una forma di penicillina chiamata penicillina G è unmetabolita naturale delle cellule fungine. In questo impianto, gestito dalla Pfizer Inc. a Groton,nel Connecticut, ben 15 serbatoi di fermentazione vengono fatti funzionare in tempi sfalsati pergarantire una produzione continua dell'antibiotico. Quando la fermentazione, che dura parecchigiorni, è completata, la penicillina G viene separata dalle cellule di muffa esaurite e iniettata neicristallizzatori, dove viene aggiunto butanolo. Il butanolo viene fatto evaporare insieme aparte dell'acqua: rimane una fanghiglia liquida di penicillina G cristallina pura al 99 per cen-to. Le successive modificazioni chimiche permettono di ottenere le altre forme di penicillina.

La produzione microbiologicadi sostanze farmaceutiche

La scoperta della penicillina ha segnato l'inizio di una nuova era inmedicina. Ora con i microrganismi si producono non solo antibiotici, maanche vitamine, ormoni, farmaci antitumorali, alcaloidi e interferoni

di Yair Aharonowitz e Gerald Cohen

80

POLIENI

111~1~1.1-

PARETE CELLULARE ANTIBIOTICIBETA-LATTAMICI

MEMBRANA CELLULARE

ANTRACICLINE

I siti di azione degli antibiotici sono estremamente diversificati e com-prendono quasi ogni processo importante della vita di una cellulabatterica. Le penicilline e le cefalosporine interrompono la costruzionedella parete cellulare batterica. Le bleomicine e le antracicline interfe-riscono con la replicazione del DNA. Le rifamicine impediscono la tra-scrizione del DNA in RNA messaggero. L'eritromicina, la streptomici-na, il cloramfenicolo e le tetracicline inattivano tutte il complessoribosomico, dove l'RNA messaggero viene tradotto in proteine. Questi

ERITROMICINA TETRACICLINE

processi metabolici sono leggermente differenti nei batteri e nellecellule dei mammiferi: gli antibiotici sono perciò tossici per i microrga-nismi, ma innocui per gli esseri umani. La cura delle infezioni fungine edel cancro è attualmente poco efficace perché sono state scoperte po-che sostanze dotate di tossicità selettiva verso le cellule fungine etumorali. Un gruppo di agenti antifungini noti è costituito da sostanzechiamate polieni. Questi farmaci, che comprendono l'amfotericina B,interferiscono con il funzionamento della membrana cellulare dei funghi.

STREPTOMICINA

PROTEINANEOSINTETIZZATA

RNAMESSAGGERO

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CLORAMFENICOLO

BLEOMICINE

REPLICAZIONEDEL DNA

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AMMINOACIDI • ••

RNADI TRASPORTO

RNA• MESSAGGERO

•

della temperatura, del pH, del flusso diossigeno e della quantità di sostanze nutri-tive contenute nel terreno di coltura. Lasospensione di cellule viene agitata da paleall'interno del fermentatore.

I microrganismi che svolgono le fer-mentazioni nell'industria degli antibioticiprovengono da una varietà piuttosto limi-tata di gruppi tassonomici. Janos Berdydell'Istituto di ricerca di chimica farmaco-logica di Budapest li ha suddivisi in tregruppi principali. Sei generi di funghiascomiceti danno origine ad almeno 1000antibiotici distinti. Tra questi funghi sitrovano le muffe del genere Cephalospo-rium, che producono le cefalosporine, e ilgenere Penicillium, fonte delle penicilli-ne. Tra i batteri non filamentosi due gene-ri sintetizzano circa 500 antibiotici; peròil numero di gran lunga maggiore di so-stanze antibiotiche proviene dagli atti-nomiceti, un gruppo di batteri filamento-si. Tre generi di attinomiceti produconoquasi 3000 antibiotici: il genere Strepto-myces ne produce la percentuale maggio-re, incluse le tetracicline.

Il numero di antibiotici prodotti da ognigenere non è correlato molto strettamen-te alla sua importanza clinica e commer-ciale. Dei circa 5000 antibiotici noti, soloun centinaio sono stati introdotti sul mer-cato. La maggior parte di questi sono de-rivati dagli streptomiceti, che fino al 1977fornivano 69 prodotti. Sono le penicillinee le cefalosporine, tuttavia, che dominanoil mercato degli antibiotici. Su 4,2 miliardidi dollari ricavati dalla vendita di antibio-tici nel 1978, circa 1 miliardo provienedalla vendita di penicilline e mezzo mi-liardo dalla vendita di cefalosporine.Gran parte del resto del ricavato provieneda prodotti degli attinomiceti, inclusi unmiliardo di dollari ottenuti dalle tetraci-cline. Nessun prodotto batterico occupaun settore ben determinato del mercato,sebbene alcuni antibiotici batterici sianoutili in particolari situazioni cliniche.

Sebbene la diversità tassonomica degliorganismi che producono antibiotici sialimitata, le molecole prodotte sonoestremamente diverse sia nella strutturachimica sia nell'attività fisiologica. Sonostati identificati antibiotici che interferi-scono con quasi ogni fase del ciclo vitaledi una cellula batterica; ne sono stati tro-vati alcuni che attaccano le cellule fungi-ne. Le penicilline e le cefalosporine inter-feriscono con la sintesi della parete cellu-lare dei batteri; i macrolidi polienici,come l'amfotericina B, disturbano le fun-zioni della membrana dei funghi; lebleomicine e le antracicline interferisco-no con la replicazione del DNA; le rifa-micine interrompono la trascrizione delDNA in RNA messaggero; l'eritromici-na, le tetracicline e la streptomicina inat-tivano il complesso ribosomico (il sito di

rir-teine).

Acausa delle differenti strutture e fun-zioni degli antibiotici, non è facile

definirli; una definizione pratica di anti-biotico è: «prodotto microbico di bassopeso molecolare che interferisce specifi-camente con la crescita dei microrganismi

quando è presente in quantità estrema-mente piccole». La maggior parte dellesostanze che soddisfano questa definizio-ne sono metaboliti fungini o batterici, chenon svolgono alcun ruolo evidente nellacrescita e nella conservazione della cellu-la. Queste molecole sono chiamate meta-boliti secondari, per distinguerle dai me-taboliti primari necessari per la crescitadell'organismo. Alcaloidi, tossine e pig-menti sono anch'essi metaboliti seconda-ri. Questi composti vengono sintetizzatisolo dopo il rallentamento della crescitadella cellula (quando è entrata nello stadiovitale chiamato idiofase). La funzione de-gli antibiotici nelle cellule che li producononon è chiara, sebbene sia stata formulatal'ipotesi che essi servano per inibire la cre-scita di microrganismi competitori.

Come altri metaboliti secondari, unantibiotico è il prodotto finale di una lun-ga serie di reazioni catalizzate enzimati-camente. Molti geni, sia strutturali che diregolazione, contribuiscono alla sintesi; èanche necessaria la sintesi dei precursori.La complessità delle vie metaboliche checonducono alla produzione di un antibio-tico ha conseguenze importanti per laproduzione industriale e per i metodi diricerca impiegati per migliorare i prodotticommerciali.

Sebbene gli antibiotici possiedanoun'ampia gamma di strutture chimiche ediversi siti di azione, soddisfano tutti ilprincipio della tossicità selettiva formula-to all'inizio di questo secolo da Paul Ehr-lich. Il principio afferma che un agentechemioterapico efficace deve essere inno-cuo per i tessuti umani, ma tossico per ilmicrorganismo infettante. Sebbene i pro-cessi fondamentali del metabolismo cellu-lare nel corpo umano siano simili a quelli diorganismi molto più semplici, sottili diffe-renze possono rendere un antibiotico letaleper l'agente infettante, ma innocuo per ilpaziente. Questa capacità di discriminazio-ne è una proprietà essenziale dell'azionedegli antibiotici. Sono state scoperte moltesostanze dotate di attività selettiva contro ibatteri, ma la ricerca di agenti efficaci con-tro funghi, virus, parassiti o cellule tumoraliha avuto molto meno successo.

La tossicità della penicillina verso i bat-teri fu notata da Alexander Fleming neglianni venti; la selettività della sua azionefu dimostrata da Howard W. Florey,Ernst B. Chain e dai loro colleghi all'Uni-versità di Oxford nel 1941, quando dimo-strarono che la penicillina era in grado dicurare le infezioni batteriche. La penicil-lina è innocua per l'uomo perché il sito sucui essa agisce, la parete cellulare batteri-ca, non ha equivalenti nell'organismoumano. Nessuna di queste scoperteavrebbe comunque portato all'uso prati-co degli antibiotici per scopi clinici; laquantità di penicillina ottenuta in labora-torio dai ceppi delle muffe Pr.nicilliurn,pochi milligrammi per litro di coltura, eradi gran lunga troppo piccola per costituirela base di un procedimento industriale.

Nel tentativo di migliorarne la resa, unceppo altamente produttivo di Penicil-lium chrysogenum fu esposto sistemati-camente a una varietà di agenti mutageni,

compresa la mostarda azotata, le radia-zioni ultraviolette e i raggi X; furono an-che sfruttate le mutazioni spontanee.Dopo ogni ciclo di esposizione ai mutage-ni la generazione successiva di muffe ve-niva esaminata per individuare i mutantialtamente produttivi. Il processo fu ripe-tuto numerose volte; furono necessari 21cicli di mutazione e selezione eseguiti innumerosi laboratori per aumentare laresa di penicillina di un fattore 55. Com-binato ai miglioramenti delle tecniche difermentazione questo fu sufficiente per laprima produzione industriale. Da alloraulteriori selezioni e miglioramenti dellatecnologia delle fermentazioni hannoaumentato l'efficienza della produzione a20 grammi per litro o più, un migliora-mento di 10 000 volte sulla resa di labora-torio ottenuta da Florey, premio Nobelper le sue ricerche sulla penicillina.

I e, tecniche genetiche classiche che sibasano sulla mutazione casuale sono

assai laboriose, principalmente perché lemutazioni che aumentano la resa di anti-biotici non conferiscono alcun vantaggioal microrganismo. E quindi necessarioesaminare molte delle colonie ottenuteper determinare le loro rese nelle condi-zioni di fermentazione. Inoltre i mutantipiù produttivi non compaiono spesso.Sebbene siano ora disponibili metodi piùsofisticati per alterare singoli geni, i me-todi classici sono ancora indispensabiliper migliorare le rese di antibiotico.

La ragione dell'indispensabilità deivecchi metodi sta nella natura della sintesidei metaboliti secondari. A differenza diuna proteina, che è il prodotto immediatodi un singolo gene, un antibiotico vieneprodotto dall'azione combinata dei pro-dotti di 10-30 geni. Per la maggior partedegli antibiotici commerciali non è nota lavia completa della sintesi. Conseguente-mente i tentativi di alterare singoli genisono per la maggior parte inefficaci nel-l'aumentare le rese di antibiotico. L'unicarecente modificazione sostanziale delloscreening genetico è stato lo sviluppo dimetodi automatici per l'esame degli or-ganismi che sono sopravvissuti al proces-so di induzione delle mutazioni e peridentificare i nuovi ceppi con produttivitàpiù alta. Il dispositivo automatico esami-na decine di migliaia di colonie di soprav-vissuti per ogni ciclo di mutazione.

La penicillina è estremamente attivacontro un'ampia gamma di batteri Gram--positivi. (I batteri Gram-positivi e Gram--negativi si distinguono sulla base di unaprocedura di colorazione sviluppata nel1884 da Hans Christian Joachim Gram; iltest rivela una differenza fondamentale nellepareti cellulari dei batteri.) Quando la peni-cillina fu introdotta nella pratica clinica, siscoprì che molte comuni infezioni batteri-che, come la farin-gitc str,..pt.ka, la pol-monite pneumococcica e la maggior partedelle infezioni stafilococciche, potevanovenire curate rapidamente e completamen-te. La penicillina guariva anche infezionigravi e spesso fatali come la meningite dameningococchi ed era efficace nella cura dialcune forme di endocardite batterica che

82 I 83

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Penicilliumchtysogenum

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7 GRAMMI \i/PER LITRO E-15,1 CEPPO FINALE

erano fino allora inesorabilmente fatali.Questi impressionanti risultati clinici

stimolarono la ricerca di altri antibioticinaturali. La ricerca era motivata da duefattori: la penicillina era molto meno atti-va contro i batteri Gram-positivi; eraanche stato osservato che certi batteriGram-positivi possedevano enzimi capacidi inattivare la penicillina, e quindi eranoresistenti all'antibiotico. Per mezzo di unanuova tecnica appositamente sviluppataper lo screening dei microrganismi delterreno, Selman A. Waksman e i suoi col-leghi alla Rutgers University isolarono lastreptomicina e altri antibiotici dagli atti-nomiceti del genere Streptomyces; alcunedi queste preparazioni erano attive controi batteri Gram-negativi e altre contro ibatteri Gram-positivi. La muffa Cephalo-sporium acremonium fu isolata nel 1945dal mare al largo della Sardegna da G.Brotzu dell'Istituto di igiene di Cagliari.Si scoprì che le cellule di questa muffasintetizzavano parecchi antibiotici corre-lati, uno dei quali, chiamato cefalosporinaC, era particolarmente efficace contro ibatteri patogeni Gram-positivi resistentialla penicillina.

Sebbene le penicilline, le cefalosporinee la streptomicina siano state le scopertepiù importanti del periodo iniziale dell'i-dentificazione degli antibiotici, ve ne fu-rono molte altre. Il numero di nuovi anti-biotici identificati ogni anno aumentò conandamento quasi lineare a partire dallafine degli anni quaranta fino all'iniziodegli anni settanta, periodo durante ilquale si caratterizzarono circa 200 nuovesostanze all'anno. Sul finire degli anni set-tanta i nuovi antibiotici venivano scopertial ritmo di circa 300 all'anno, di cui circa150 erano prodotti dagli attinomiceti.

La produzione di nuovi antibiotici in-trodotti sul mercato, tuttavia, declinò ra-pidamente dopo gli anni cinquanta. Di-venne progressivamente più difficile iso-lare un nuovo antibiotico sufficientemen-te superiore ai prodotti già esistenti pergiustificarne l'introduzione nella praticamedica. Come risultato del peggioramen-

Sono state necessarie ripetute mutazioni percreare un ceppo della muffa Penicillium chry-sogenum capace di sintetizzare abbastanzapenicillina da costituire la base di un procedi-mento commerciale. Quattro gruppi di ricerca-tori, per indurre mutazioni nella muffa, utiliz-zarono radiazioni e composti chimici («S» si-gnifica mutazione spontanea, «X» significaraggi X, «UV» raggi ultravioletti e «MA» mo-starda azotata.) La selezione dei ceppi con ca-ratteristiche superiori diede origine alla fine alceppoE 15.1, che produceva 55 volte più peni-cillina dei ceppi di laboratorio. Miglioramenticontemporanei della tecnica di fermentazioneaumentarono ulteriormente le rese; i dati ri-per!ati q2es(e seherne. rifie(tene en(r.arnhi itipi di miglioramento. Tecniche genetiche clas-siche simili a queste sono ancora all'ordine delgiorno nell'industria degli antibiotici; la com-plessità della sintesi degli antibiotici nei mi-crorganismi rende svantaggioso sviluppare nuo-vi ceppi per mezzo dell'alterazione diretta disingoli geni. I metodi di fermentazione modernihanno una resa di più di 20 grammi per litro.

to dei risultati dello screening di nuoviantibiotici e dello sviluppo di resistenzeagli antibiotici in molti batteri, la ricercacambiò obiettivo. Verso la fine degli annisessanta la maggior parte degli sforzi era-no diretti verso la modificazione dellastruttura degli antibiotici esistenti permigliorarne l'efficacia, proteggerli dall'i-nattivazione da parte dei batteri e miglio-rarne le proprietà farmacologiche.

Gran parte degli sforzi furono concen-trati sulle penicilline e sulle cefalo-

sporine, strettamente affini. In entrambi igruppi la struttura centrale di ogni mole-cola è l'anello beta-lattamico a quattromembri, composto da tre atomi di carbo-nio e uno di azoto; le penicilline e le cefa-losporine sono note collettivamente comeantibiotici beta-lattamici. Oltre ad avereun largo spettro di attività antibattericagli antibiotici beta-lattamici sono proba-bilmente i meno tossici tra tutti i gruppiprincipali di antibiotici.

Sebbene il meccanismo esatto con cuigli antibiotici beta-lattamici distruggono ibatteri non sia stato completamente chia-rito, è noto che essi interferiscono con lasintesi della parete batterica: essi interfe-riscono sia con la sintesi, sia con il mon-taggio del peptidoglicano, il costituenteprincipale della parete cellulare. Essisvolgono la loro azione legandosi ad al-meno tre enzimi - la transpeptidasi, lacarbossipeptidasi e l'endopeptidasi - checatalizzano la polimerizzazione e l'inse-rimento del peptidoglicano nella paretecellulare. L'ubiquità del peptidoglicanonella parete cellulare dei batteri e la suaassenza negli organismi superiori sonoresponsabili della tossicità altamente se-lettiva degli antibiotici beta-lattamici.

Per oltre 30 anni due muffe, il Penicil-lium chrysogenum e il Cephalosporiumacremonium, furono le fonti esclusivedegli antibiotici beta-lattamici. Recente-mente, tuttavia, in un programma discreening intensivo dei microrganismiprocarioti del suolo, intrapreso dalla EliLilly and Company e dalla Merck, Sharp& Dohme, sono stati scoperti nuovi an-tibiotici beta-lattamici nei brodi di fer-mentazione degli streptomiceti. Questicomposti, le cefamicine, possiedono unastruttura simile a quella delle cefalospori-ne, con l'aggiunta di un gruppo metossile(CH 3-0—) sull'anello beta-lattamico. Inqualche caso questo gruppo laterale au-menta l'efficacia dell'antibiotico controgli organismi Gram-negativi e controquelli resistenti alla penicillina.

Negli anni sessanta e settanta gli sforziper migliorare gli antibiotici beta-latta-miei si incentrarono sull'aggiunta di nuovigruppi laterali all'anello beta-lattamico.Il metodo di produzione semisintetico,oggi ampiamente adottato nella produ-zione di perileilline e eefalosporiric, sibasa sulla sostituzione con metodi chimicidi una catena laterale con un'altra dopoche la fermentazione ha prodotto unamolecola che possiede l'anello centrale.L'aggiunta di nuove catene laterali, unmetodo che è anche stato utilizzato per gliantibiotici amminoglicosidici, inclusa la

60 MILLIGRAMMIPER LITRO

300 MILLIGRAMMIPER LITRO

550 MILLIGRAMMIPER LITRO

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E-9

84

La struttura chimica e la funzione delle penicilline e delle cefalosporinesono determinate dall'anello beta-lattamico a quattro membri (in colo-re); questi farmaci vengono chiamati antibiotici beta-lattamici. L'anelloè essenziale per l'attività di questi composti in quanto blocca la costru-zione della parete cellulare batterica. I gruppi laterali attaccati all'anel-lo possono potenziare l'antibiotico e migliorare le sue proprietà farma-cologiche. Nelle penicilline cambia un solo gruppo laterale. Nella pro-

0' O

duzione commerciale la penicillina G (così come la cefalosporina C)funge da centro strutturale per l'attacco di nuove catene laterali dopo larimozione del gruppo benzilico. La meticillina è resistente all'inattiva-zione da parte di enzimi batterici; l'ampicillina è efficace contro i batteriGram-negativi. Entrambi questi miglioramenti rispetto alla penicilli-na G sono ottenuti per mezzo dell'alterazione della catena laterale.Le cefalosporine possiedono, invece, due catene laterali variabili.

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La formazione di legami atomici incrociati tra le molecole di peptidoglicano durante la costruzio-ne della parete cellulare batterica viene impedita dagli antibiotici beta-lattamici. Ogni catenaconsiste in parte di unità alternate degli amminozuccheri N-acetilglucosammina (NAG) e acidoN-acetilmuramico (NAM). Le unità di NAM sono legate a gruppi polipeptidici. La formazione deilegami incrociati tra un polipeptide e l'altro per mezzo di legami peptidici conferisce alla paretecellulare la sua rigidità. Nel batterio Staphylococcus aureus il legame viene stabilito inserendol'unità di glicina terminale di una catena nel legame che unisce due unità di alanina di un'altracatena. L'unità di alanina terminale viene asportata e si forma un nuovo legame tra l'alaninasuccessiva e la glicina terminale. La creazione di questo legame viene catalizzata da enzimichiamati transpeptidasi e carbossipeptidasi. Gli antibiotici beta-lattamici impediscono la forma-zione di legami atomici incrociati tra le catene di peptidoglicano legandosi alle peptidasi e inattivan-dole. In questo modo danneggiano le cellule in crescita che stanno formando le pareti cellulari.

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CEFOXITINA H ON

tente inibitore dell'azione delle beta-lattamasi. Questi enzimi battericisono capaci di inattivare gli antibiotici beta-lattamici rompendo l'a-nello beta-lattamico. L'acido cla%ulanico è oggi presente sul mercatoin combinazione con il farmaco beta-lattamico amoxicillina; questoibrido farmaceutico, noto come augmentina, è un antibiotico potenteche è altresì resistente all'inattivazione da parte delle beta-lattamasi.

streptomicina, può migliorare l'efficacia,la mancanza di tossicità e la stabilità dellasostanza; può anche allargare lo spettro diorganismi contro cui l'antibiotico è attivo.

Nella produzione semisintetica della

penicillina un ceppo industriale diPenicillium chrysogenum viene fatto cre-

ACIDO CLAVULANICO

scere in presenza di acido fenilacetico: siha come risultato la produzione di penicil-lina G. La produzione di penicillina Gviene realizzata su grande scala. Numero-si serbatoi di fermentazione vengono soli-tamente fatti funzionare in una sequenzatemporale sfalsata tale che il brodo difermentazione può essere recuperato e

TIENAMICINA

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fermentazione permettono di procederealla fase di recupero senza interruzioni.

La fermentazione è un processo ali-mentato a lotti. L'acido fenilacetico è ilprecursore della catena laterale benzilicadella penicillina G. A fermentazione ul-timata, il brodo viene fatto passare attra-verso un filtro rotante che separa le cellu-le di muffa dal liquido che contiene lapenicillina; le cellule vengono successi-vamente lavate. Il filtrato e la soluzione dilavaggio vengono introdotti in un estrat-tore chimico. Alla miscela viene aggiuntauna fonte di ioni potassio, e il risultato è ilsale potassico cristallino della penicillinaG. Il sale filtrato ed essiccato costituisceun antibiotico puro al 99,5 per cento.

Dopo il recupero la penicillina G vieneaggiunta al brodo di fermentazione di unceppo di batteri che secernono gli enzimichiamati acilasi che rimuovono selettiva-mente il gruppo benzile dalla molecola eproducono in questo modo l'acido 6-am-minopenicillanico, o 6-APA. Questa strut-tura centrale ha poche proprietà antibatte-riche, ma costituisce un comodo centrostrutturale per l'attacco dei gruppi lateraliche aumentano l'efficacia dell'antibiotico.

Il metodo di produzione semisintetico èstato adottato anche per la produzionedelle cefalosporine. Il punto di partenza èla cefalosporina C, prodotta dal Cephalo-sporium acremonium. La cefalosporina Cè attiva sia contro i batteri Gram-positivisia contro quelli Gram-negativi, ma lasua attività è troppo bassa per scopiclinici. Tuttavia, se si rimuove una catenalaterale ammidica della molecola, la strut-tura centrale rimanente, l'acido 7-alfa--amminocefalosporanìco, o 7-ACA, puòessere utilizzata nello stesso modo del6-APA. Per mezzo dell'attacco delle ca-tene laterali appropriate si crea una varie-tà di cefalosporine semisintetiche.

L'efficacia degli antibiotici beta-latta-miei può venire diminuita dalle resistenzebatteriche. La base biochimica della resi-stenza è l'idrolisi, o la rottura, del legamedell'anello beta-lattamico chiamato lega-me ammidico ciclico. L'idrolisi rende lamolecola incapace di legarsi alle peptidasibatteriche. Questo tipo di distruzione del-l'antibiotico è catalizzata da enzimi chia-mati beta-lattamasi, che sono largamentediffusi tra i batteri, gli attinomiceti, i ciano-batteri e i lieviti. Inoltre gli enzimi possonopassare da un microrganismo all'altro permezzo di plasmidi che contengono il geneche li codifica. L'uso generalizzato degliantibiotici ha creato una pressione seletti-va che favorisce la sopravvivenza dei mi-crorganismi che hanno acquisito il gene.

Un obiettivo di importanza critica nellosviluppo di nuovi antibiotici è il supera-mento di questa inattivazione enzimaticadegli antibiotici beta-lattamici. Sono stateseguite almeno due strategie. Una è l'i-dentificazione di antibiotici naturali nonsuscettibili all'inattivazione da parte dellebeta-lattamasi. Cinque anni fa, duranteuna ricerca di inibitori della sintesi delpeptidoglicano, i ricercatori della Merck,Sharp & Dohme hanno scoperto unanuova classe di antibiotici beta-lattamici.Questi composti, le tienamicine, sono sta-

ti isolati dai brodi di fermentazione delloStreptomyces cattleya. Sono estremamen-te potenti contro molti batteri Gram-po-sitivi e Gram-negativi; inoltre, caratteri-stica più importante, sono in grado di ini-bire le beta-lattamasi, e in questo modo siautoproteggono dall'inattivazione.

la seconda strategia è di trovare sostanzeche siano dotate di poca o nulla attivi-

tà antibatterica, ma che si comportinocome potenti inibitori delle beta-lattama-si. Un tale inibitore viene quindi combi-nato con un antibiotico beta-lattamicoper formare un composto che resiste all'i-nattivazione. Gli inibitori delle beta-lat-tamasi, acido clavulanico e acido olivani-co, sono stati identificati dai ricercatoridella Beecham Pharmaceutical Companyin Inghilterra. Queste sostanze possiedo-no la caratteristica struttura beta-lattami-ca, ma il loro effetto principale è l'inatti-vazione degli enzimi. Studi recenti di Je-remy Knowles e dei suoi colleghi allaHarvard University hanno dimostratoche gli acidi clavulanico e olivanico inatti-vano gli enzimi con una strategia «suici-da». Essi si legano alla molecola di beta--lattamasi e danno inizio a una reazione

catalitica; tuttavia, a differenza delle altresostanze beta-lattamiche che vengonoidrolizzate e poi si dissociano dall'enzima,questi inibitori rimangono bloccati nelsito attivo e ne precludono ogni ulterioreattività. L'acido clavulanico è un inibitoreefficace delle beta-lattamasi della mag-gior parte dei microrganismi di importan-za clinica. Il nuovo antibiotico augmenti-na, prodotto dalla Beecham, è una com-binazione dell'antibiotico beta-lattamicoamoxicillina e dell'acido clavulanico.

Oltre alle tecniche genetiche classiche,all'identificazione di metaboliti naturali ealla semisintesi, parecchi nuovi metodigenetici si sono recentemente aggiunti al-l'armamentario dei microbiologi. Unprocesso elegante è la biosintesi mutazio-naie, o m utasintesi, che consiste nellacreazione per mezzo di una mutazionespecifica di un microrganismo che è inca-pace di sintetizzare un precursore mole-colare di un antibiotico. Quando quelprecursore viene aggiunto alla coltura cel-lulare, viene prodotto l'antibiotico natu-rale di quell'organismo. Se viene aggiuntoun altro precursore con una strutturachimica leggermente differente, può ve-nir prodotto un nuovo antibiotico.

ulteriormente lavorato con un flussopressoché continuo. L'impianto gestitodalla società olandese Gist-Brocades NVa Delft, per esempio, comprende 14 fer-mentatori, ciascuno con una capacità di100 000 litri. Il tempo richiesto per lafermentazione è 200 ore; la fase di recu-pero richiede 15 ore, e così i 14 serbatoi di

O NH2

O

hO

Nuovi antibiotici beta-lattamici sono stati scoperti nei brodi di fermen-tazione di microrganismi del genere Streptomyces, un sottogruppo dibatteri chiamati attinomiceti. Sino all'isolamento dei prodotti deglistreptomiceti le muffe Penicillium e Cephalosporium sono state lafonte unica degli antibiotici beta-lattamici. Tutte e tre le molecoleposseggono un'attività antibiotica; l'acido clavulanico è anche un po-

86

87

PENICILLINA-ACILASI

ACIDO 6-AMMINOPENICILLANICOPENICILLINA G

H2N

O

O

H

BUTANOLO >

—40° C.Si (CH3)2o ,^^^

O L O

OH

NUOVODERIVATODELL'ANTI-BIOTICOATTIVO

ANTIBIOTICOORIGINALE/\ ATTIVO

ANTIBIOTICOINCOMPLETO/\ NON ATTIVO

2

ANTIBIOTICOORIGINALEATTIVO

(CH3) 2 SiC1 2 + PCI 5 -40° C. H 2 Cy O' C.

La conversione biologica della penicillina G in acido 6-amminopenicil-lanico (6-APA) ha meno passaggi ed è più economica della conversionechimica. Nella produzione delle penicilline semisintetiche il 6-APAcostituisce un nucleo chimico a cui possono attaccarsi le catene laterali,con la formazione di nuovi antibiotici. Se si utilizza la conversione

chimica sono necessari tre passaggi a bassa temperatura e in condizionistrettamente anidre con numerosi solventi chimici. 11 procedimentomicrobiologico utilizza i batteri che producono gli enzimi chiamatiacilasi, che scindono il gruppo benzilico dalla molecola e produconoil 6-APA. La fermentazione avviene in acqua a 37 gradi centigradi.

Un secondo metodo deriva dal fattoche il metabolismo secondario dipendestrettamente dalle concentrazioni deimetaboliti primari presenti nella cellula.Tra i substrati della sintesi degli antibio-tici vi sono carboidrati, amminoacidi,purine, pirimidine, acidi grassi e moleco-le donatrici di gruppi acetile e propinile.La velocità di produzione dell'antibioti-co può venir limitata dalla velocità dellasintesi o dalla disponibilità di un meta-bolita primario. Se questo è il caso, e ilgene per il metabolita primario è statoidentificato, è possibile creare, per mez-zo di manipolazioni genetiche, un ceppoche produce più precursore. Il risultatoè un aumento nella resa di antibiotico.Uno di noi (Aharonowitz) ha impiegatoquesto metodo per aumentare la resa dicefalosporine dallo Streptomyces clavali-gerus.

Gli antibiotici possono inibire la cresci-

ta delle cellule che li producono così comequella dei batteri patogeni: di solito l'an-tibiotico viene sintetizzato solo dopo chela crescita è cessata. Alcuni ceppi mutan-ti, tuttavia, sono resistenti ai propri anti-biotici e sono altamente produttivi. Peresempio, è risultato che certi ceppi diStreptomyces aureo faciens che resistonoad alte concentrazioni del loro stesso an-tibiotico, la clortetraciclina, lo produconocon alta efficienza.

Mentre l'identificazione, la modifica-zione e la produzione di sostanze

efficaci contro le infezioni batteriche sonostate coronate da un successo considere-vole, l'individuazione di agenti simili effi-caci contro le infezioni virali e fungine hafatto pochi progressi. Il difetto della mag-gior parte degli agenti antifungini e anti-tumorali è la mancaza di selettività; lamaggior parte di essi sono nocivi anche

alle cellule di mammifero normali oltreche agli organismi patogeni o alle cellulecancerose. La maggioranza degli agentiantifungini sono tossici se vengono assun-ti per via interna e possono essere usatisolo per applicazioni topiche. Numerosimetaboliti microbici inibiscono la crescitadei tumori, ma anch'essi sono tossici.

Una sostanza antitumorale che ha me-ritato una seria considerazione è il glico-peptide bleomicina, isolato da HamaoUmezawa e dai suoi colleghi presso l'Isti-tuto di chimica microbiologica di Tokyodai brodi di coltura dello Streptomycesverticillus. Apparentemente agisce le-gandosi al DNA delle cellule tumorali erompendolo e interferisce con la replica-zione sia del DNA che dell'RNA. Un al-tro gruppo importante di farmaci antitu-morali è composto da una unità ammino-glicosidica e da una molecola di antraci-dia. Anche queste sostanze inibiscono la

La biosintesi routazionale, o mutasintesi, è un metodo elegante perprodurre nuovi antibiotici. Una mutazione nel gene che codifica per unprecursore dell'antibiotico naturale del microrganismo porta alla sinte-si di una molecola di antibiotico incompleta, che manca di un unico

costituente chimico. Quando il precursore mancante viene aggiunto alterreno di coltura in cui sta crescendo il microrganismo, viene prodottol'antibiotico naturale. Quando si aggiungono al terreno di coltura pre-cursori con strutture differenti, vengono sintetizzati nuovi antibiotici.

88

PASSAGGICHIMICI

OHOH

\1/ IDROSSILAZIONEMICROBICA

1 1-ALFA-OH-PROGESTERONE

PASSAGGICHIMICI

HO •PASSAGGI

CHIMICI

PASSAGGICHIMICI

OH OH

.• PROGESTERONEDIOSGENINA

PASSAGGICHIMICI

HO

COMPOSTO S O IDROCORTISONE

IDROSSILAZIONE

MICROBICA

PREDNISOLONE

DEIDROGENAZIONE

MICROBICA

OH

PASSAGGICHIMICI

OH

DEIDRO-GENAZIONE

STIGMASTEROLO

HO

O

La produzione degli steroidi comprende numerosi importanti passaggimicrobiologici in un procedimento costituito principalmente da sintesichimiche. I materiali di partenza per la produzione sono gli steroli. Lostigmasterolo è un prodotto secondario dell'industria dell'olio di soia;la diosgenina viene estratta dalle radici del barbasco. Gli steroli ven-gono convertiti in una serie di passaggi chimici in uno di due compostiintermedi: il composto S e il progesterone. Una muffa fungina (ilRhizopus nigricans o la Curvularia lunata, a seconda del compostointermedio) viene poi utilizzata per idrossilare la molecola. Questopassaggio microbiologico è stato di importanza cruciale nello sviluppo

CORTISONE

PASSAGGICHIMICI

O

di un metodo commercialmente valido di produzione degli steroidi.metodo chimico di idrossilazione è complesso e difficile; la scoperta diun metodo biologico ha ridotto la sintesi completa da 37 a 11 passaggiabbassando il costo unitario di produzione. Gli steroidi furono perciòresi alla portata economica della maggior parte dei pazienti. L'altroimportante passaggio microbiologico è la deidrogenazione, cioè larimozione di due atomi di idrogeno dal nucleo dello steroide. Proce-dimenti analoghi sono utilizzati nella produzione del cortisone, del-l'idrocortisone, del prednisolone e del prednisone, che possiedonoproprietà farmacologiche diverse da quelle degli steroidi naturali.

• OH

DEIDROGENAZIONE >

MICROBICA

PREDNISONE

sintesi del DNA e dell' RNA. Sia la bleo-micina sia le antracicline, tuttavia, sonopotenzialmente dannose per il cuore.

L'identificazione di agenti efficaci con-tro i tumori, sul modello degli antibiotici,dovrà essere basata sulle differenze distruttura e funzione tra le cellule tumoralie le cellule umane normali. Poiché poco ènoto sulle differenze fondamentali tra lecellule tumorali e le cellule normali, laricerca degli agenti antitumorali è larga-mente empirica, come la ricerca degli an-tibiotici nella sua fase pionieristica. Il Na-tional Cancer Institute statunitense hainiziato un programma di screening sugrande scala con lo scopo di identificarealcuni agenti dotati di tossicità selettivaverso le cellule tumorali.

Nella produzione industriale degli an-tibiotici beta-lattamici la maggior parte,se non tutta, l'informazione richiesta perla sintesi è contenuta nel genoma del mi-crorganismo; le modificazioni chimichesono relativamente importanti. Nellaproduzione di altri farmaci, tuttavia, imicrorganismi mediano solo passaggi iso-lati, o bioconversioni, di processi moltopiù lunghi che si basano principalmentesu sintesi non biologiche. Normalmentesolo l'informazione per il passaggio isola-to risiede nel genoma della cellula e ilDNA che specifica queste istruzioni costi-tuisce una parte molto piccola del corredogenetico della cellula.

I risultati più clamorosi nei metodi dibioconversione sono stati ottenuti nellaproduzione degli ormoni steroidei. All'i-nizio degli anni trenta Edward C. Kendalldella Mayo Foundation e Tadeus Reich-stein dell'Università di Basilea isolaronoil cortisone, uno steroide secreto dalleghiandole surrenali. Circa dieci anni piùtardi Philip S. Hench della Mayo Founda-tion dimostrò che la somministrazione dicortisone alleviava il dolore dei pazientiaffetti da artrite reumatoide. La richiestadi ormone fu immediatamente considere-vole; poiché il mercato potenziale eraevidentemente molto vasto furono svi-luppati dei metodi chimici per la sintesidel cortisone. Tuttavia la sintesi chimicaera elaborata e richiedeva 37 passaggi, lamaggior parte dei quali in condizioniestreme. Il cortisone prodotto in questomodo costava 200 dollari al grammo.

Una delle complicazioni principali nel-la sintesi chimica del cortisone è la neces-sità di introdurre un atomo di ossigeno inuna posizione nella struttura a quattroanelli dello steroide designata posizione11; questo passaggio è cruciale nel de-terminare l'attività fisiologica della mole-cola. Nel 1952 D. H. Peterson e HerbertC. Murray della Upjohn Company sco-prirono che un ceppo della muffa del paneRhizopus arrhizus è capace di idrossilare

• il progesterone, un altro steroide, intro-ducendo in questo modo un atomo diossigeno in posizione 11. 11 progesteroneè uno dei primi precursori della sintesidel cortisone; con l'idrossilazione micro-bica (che è realizzata industrialmentecon organismi strettamente correlati aR.arrhizus) la sintesi fu ridotta da 37 pas-saggi a 11. Di conseguenza il prezzo del

cortisone fu ridotto a 6 dollari al grammo.L'idrossilazione microbica del proge-

sterone ebbe anche delle conseguenzeeconomiche oltre a ridurre la lunghezzadella sintesi chimica. La fermentazionepoteva essere svolta a 37 gradi centigradi,con l'acqua come solvente e a pressioneatmosferica. In queste condizioni le rea-zioni costano molto meno delle reazionicondotte in condizioni estreme di tempe-ratura e pressione e con solventi non ac-quosi, come erano quelle richieste per lasintesi chimica del cortisone.

Da allora sono state trovate molte altreutilizzazioni dei microrganismi nella sin-tesi industriale degli steroidi. Gli steroidicommercialmente importanti compren-dono i corticosteroidi cortisone, idrocor-tisone, prednisone e dexametasone, l'an-drogeno testosterone e l'estrogeno estra-diolo (gli ultimi due vengono utilizzati neicontraccettivi) e lo spironolattone (undiuretico). I materiali di partenza per tuttisono alcool complessi chiamati steroli. Cisono due fonti comuni di steroli: la pro-duzione di olio di soia genera un prodottodi scarto ricco in stigmasterolo e sitostero-lo; le radici della pianta messicana barba-sco contengono la diosgenina.

Il primo passo nella produzione deglisteroidi dagli steroli vegetali è la degrada-zione della catena laterale della molecoladi sterolo. Numerose industrie farmaceu-tiche hanno trovato conveniente sfruttarei micobatteri (un gruppo di batteri aerobiGram-positivi) per realizzare questo pas-saggio, che precedentemente veniva rea-lizzato con metodi non biologici. I mico-batteri utilizzano gli steroli come fonte dicarbonio ed energia; ceppi mutanti chenon possiedono certi enzimi non sono ingrado di completare la degradazione.Questi mutanti vengono sfruttati per de-gradazioni parziali che danno origine aintermedi utili. Altri batteri modificano ilnucleo delle molecole di steroidi e produ-cono tutta una serie di derivati.

L'introduzione di questi procedimentimicrobiologici ha avuto un grande signifi-cato per la produzione degli steroidi, inprimo luogo rendendo commercialmenterealizzabile la sintesi degli steroidi e suc-cessivamente riducendo progressivamen-te il costo unitario dei prodotti. Nel 1980il prezzo del cortisone negli Stati Uniti eradi 46 centesimi al grammo, una riduzionedi 400 volte rispetto al prezzo originario.L'identificazione di nuovi usi per gli ste-roidi (nella contraccezione e nella curadelle insufficienze ormonali, delle malat-tie della pelle, delle infiammazioni e delleallergie) unita a una produzione più effi-ciente ha portato a una notevole doman-da. Le vendite all'ingrosso mondiali deiquattro principali ormoni steroidei (corti-sone, aldosterone, prednisone e predniso-lone) hanno raggiunto circa i 300 milionidi dollari nel 1978. Questi sono i prodotticommerciali più importanti dei procedi-menti industriali di bioconversione, macertamente non sono i soli.

Nella terza principale categoria di pro-cessi microbiologici impiegati per la

produzione di sostanze farmaceutiche

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== == = = 5 g. p.

E E = -, - - —

90

91

NUCLEOTIDI

OLIGONUCLEOTIDI SINTETICI (OTTO FRAMMENTI)

ASSEMBLAGGIO DEL GENE

GENE DELLABETA-GALATTOSIDASI 00000,01541:404:4100004,ESTREMITÀ

COESIVA RSTOP STOP

PLASMIDE

DNABATTERICO

TRASFORMAZIONEIN E.coli

BETA-GALATTOSIDASI(Più Di 1000 AMMINOACIDI)

SOMATOSTATINA

Cit4CID0000011500000€1041541114\l/ ROTTURA CON BROMURO

DI CIANOGENO

La sintesi della somatostatina (ormone che controlla l'attività dell'ipo-fisi), il primo polipeptide umano a essere prodotto in cellule batteriche,richiese l'inserzione del gene della somatostatina nei batteri per mezzodi un «vettore per l'espressione» costruito parzialmente a partire da unplasmide. Il gene fu sintetizzato da otto gruppi di frammenti (dotati diestremità complementari) di DNA a singola elica costituiti ognuno dipochi nucleotidi, che in questo diagramma semplificato sono indicaticome A-H. Delle 52 coppie di basi del gene, 42 codificano per lasomatostatina; le altre costituiscono le «estremità coesive» che permet-tono l'inserzione del gene nel plasmide e contengono l'informazionenecessaria per l'espressione corretta del gene e la produzione dell'or-

SOMATOSTATINA ATTIVA

mone. Il vettore per l'espressione fu costruito a partire dal plasmidepBR322, a cui fu aggiunta la regione di controllo e gran parte del geneper la beta-galattosidasi appartenente all'operone batterico lae. Laregione di controllo contiene gli elementi regolativi richiesti per l'e-spressione del gene della beta-galattosidasi. 11 gene per la somatostati-na fu inserito nel plasmide alla fine del gene della beta-galattosidasi;dopo l'introduzione del plasmide nelle cellule del batterio E.colil'ormone umano fu sintetizzato come una corta «coda» polipeptidicaattaccata all'estremità dell'enzima. L'ormone fu separato dall'enzimamediante trattamento con bromuro di cianogeno; è stato dimostra-to che esso è identico alla molecola presente negli esseri umani.

PLASMIDERICOMBINANTE PER LA

SOMATOSTATINA

GENE DELLA SOMATOSTATINA

E-----AIATTC ATG GCT

ESTREMITÀCOESIVA BC ACT TCG TGT TGA TAGC M TGG AAG ACT TTGGT TGT AAG AAC TT

TTC TGA AAG TGA AGCIACA ACT ATC CTAG

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G TAC CGA CCA ACA TTG AAG AAA ACC

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GENE DELLABETA-GALATTOSIDASI

\gy SITO RO

cr VETTOREPER L'ESPRESSIONEO

o

SITO B

FRAMMENTI DI BETA-GALATTOSIDASI 00000,04Do00000

nessuna parte dell'informazione necessa-ria per la sintesi del prodotto è inizialmen-te presente nel DNA dell'organismo; tut-ta l'informazione viene inserita artifi-cialmente nella cellula. Il gene che speci-fica la struttura del prodotto è dapprimasintetizzato chimicamente o isolato da unaltro organismo. Per mezzo di uno deinumerosi metodi disponibili il gene vieneintrodotto nella cellula; una volta intro-dotto il gene, i meccanismi di espressionegenica presenti nell'ospite producono lamolecola desiderata.

Lo sviluppo di metodi per il trasferi-mento di un gene specifico da una cellulaall'altra e per l'induzione nel nuovo ospitedell'espressione fedele ed efficiente delgene ha creato un potenziale enorme perl'industria farmaceutica. Sono state costi-tuite numerose società per lo sfruttamen-to delle nuove possibilità. Il risultatoimmediato è stato la produzione di poli-peptidi umani (corte catene di amminoa-cidi) da parte dei batteri.

Il primo peptide umano sintetizzato inuna cellula batterica è stato l'ormone ipo-talamico somatostatina. La somatostatinafa parte di un gruppo di ormoni prodottinell'ipotalamo, una ghiandola alla basedel cervello, e trasportati da un fitto si-stema di vasi sanguigni all'ipofisi doveagiscono inibendo la secrezione di insuli-na e dell'ormone umano della crescita. Iricercatori del City of Hope NationalMedical Center di Duarte, in California, e

Rivista di

Bi.olo • fondataBiologia nel

1919

Pubblicata dall'Università di PerugiaDiretta da Giuseppe SermontiTrimestrale di cultura biologica

Nei prossimi fascicoli (1981-74, 3 e 4)

G. Sermonti - Sulla discendenzaA. Sibatani - Le due fasi della bio-

logia molecolareG. Careri - L'ordine funzionaleG. Arcidiacono - La vita e il pro-

blema cosmologicoOmodeo-Sermonti - Dibattito sul-

l'evoluzionismoR. Alvarado - Etica e biologiaV. Cappelletti - Momenti della bio-

logia tedescaE. Pessa - Teoria della catastrofe e

sue applicazioni biologicheD. Antiseri - Metafisica e sviluppo

della scienzaDiscussioni, Brevi Comunicazioni,Commenti, Lettere al Direttore

Abbonamento annuale:personale: Lit. 15.000istituzioni: Lit. 20.000fascicolo semplice: Lit. 6.000fascicolo doppio: Lit. 10.000da inviare a: Rivista di Biologia,C.P. 317, 06100 Perugia(c/c p. n° 15700065)

dell'Università della California a SanFrancisco scelsero nel 1977 di lavorarecon la somatostatina principalmente per-ché essa consiste di solo 14 unità ammi-noacidiche. Il gene per la sornatostatinanon era stato isolato dalle cellule umane,ma era possibile dedurre una sequenza dinucleotidi dall'ordine noto degli ammi-noacidi nel peptide. Fu perciò costruitoun gene sintetico a partire da blocchi ditre nucleotidi ciascuno. Delle 52 coppie dibasi del gene sintetico, 42 costituiscono ilgene strutturale per la somatostatina; inucleotidi rimanenti sono stati incorpora-ti per fornire «estremità coesive» adatteper saldare il frammento di DNA a dop-pia elica a un plasmide e per facilitarel'espressione corretta del gene e il recupe-ro dell'ormone.

Il gene doveva essere inserito in celluledel batterio Escherichia coli. Per poterrealizzare questo trasferimento il genesintetico fu combinato con un plasmidechiamato pBR322 e con un segmento del-l'operone lac di E.coli. (L'operone lacconsiste di tre geni fisicamente associaticoinvolti nel metabolismo del lattosio,oltre agli elementi genetici che controlla-no la loro trascrizione e traduzione.) Ilgene per la somatostatina fu inserito vici-no all'estremità del gene che codifical'enzima beta-galattosidasi. Di conse-guenza quando il plasmide fu inserito nel-la cellula di Eco/i, la somatostatina fuprodotta come una corta «coda» polipep-tidica attaccata all'enzima. Le molecole disomatostatina potevano venire recupera-te per trattamento delle proteine conbromuro di cianogeno, che scinde le cate-ne polipeptidiche in corrispondenza degliamminoacidi metionina. Poiché il geneera stato sintetizzato chimicamente erastato semplice introdurre una metioninaall'inizio della molecola di somatostatina.Questa metodica si era resa necessariaperché la somatostatina prodotta indi-pendentemente dalla beta-galattosidasiveniva degradata rapidamente dalle pro-teine batteriche. Si è dimostrato che lasomatostatina prodotta da E.coli è identi-ca all'ormone umano naturale. La resa èdi circa 10 000 molecole di somatostatinaper cellula, sufficientemente alta da inco-raggiare ulteriori tentativi per la produ-zione industriale di polipeptidi.

Tecniche simili sono state applicate perla sintesi microbiologica dell'insulinaumana, dell'ormone della crescita umanoe degli interferoni. La produzione di insu-lina si è dimostrata ancora più efficientedi quella della somatostatina, con unaresa di 100 000 molecole per cellula bat-terica; l'insulina ha anche un'importanzamedica immediata maggiore della soma-tostatina. L'insulina consiste di due cate-ne polipeptidiche, lunghe rispettivamente21 e 30 amminoacidi. I geni sintetici codi-ficanti per i due polipeptidi furono co-struiti in tre mesi di lavoro da RobertoCrea, Adam Kraszewski, Tadaaki Hirosee Keiichi Itakura del City of Hope Natio-nal Medical Center. Per realizzare il geneper la catena più lunga vennero montatidiciotto frammenti di pochi nucleotidiciascuno; 11 frammenti furono saldati

insieme a formare il gene per la catena piùcorta. Ciascun gene sintetico fu saldato aun plasmide vicino all'estremità del geneper la beta-galattosidasi, come era già sta-to fatto per il gene della somatostatina.Dopo che gli RNA messaggeri erano statitrascritti e tradotti in proteina i due poli-peptidi furono scissi dall'enzima e unitiinsieme a formare la molecola completadell'insulina.

Il mercato dell'insulina potrebbe veni-re sostanzialmente modificato dall'appli-cazione delle tecniche microbiologiche.L'insulina usata correntemente nella curadel diabete è estratta dal pancreas dimaiali e bovini. Le insuline di queste spe-cie differiscono leggermente dall'insulinaumana nella loro sequenza amminoacidi-ca; sebbene le insuline animali siano effi-caci nella terapia dei sintomi principalidel diabete, non prevengono alcuni effettisecondari, come il deterioramento deireni e della retina. Inoltre alcuni diabeticisono allergici agli ormoni animali.

Se l'insulina umana prodotta dai batterisi dimostrerà efficace nel controllo diqueste patologie, quasi sicuramente con-quisterà una quota sostanziale del merca-to mondiale dell'insulina, che si stimaoggi ammontare a circa 200 milioni didollari. La società Eli Lilly ha annunciatoun piano per l'introduzione di un proces-so industriale per la produzione di insuli-na umana basato sul trasferimento geni-co. Se le rese potranno essere aumentatefino al livello di altri procedimenti indu-striali che utilizzano Eco/i, 2000 litri dibrodo di fermentazione potrebbero pro-durre 100 grammi di insulina pura. Que-sta quantità è equivalente a quella estrat-ta da circa 800 chili di ghiandole pancrea-tiche animali.

La produzione di somatostatina e insu-lina con metodi microbiologici si fondasulla sintesi dei geni strutturali. Con imetodi disponibili oggi, tuttavia, non èeconomicamente conveniente sintetizza-re geni per polipeptidi più lunghi dicirca 30 unità amminoacidiche, e molteproteine di importanza clinica sono mol-to più lunghe. La loro produzione richie-de l'isolamento del gene naturale. Ilpunto di partenza di questo procedimentoè l'RNA messaggero che contiene la se-quenza nucleotidica per la produzione delpolipeptide. Per mezzo dell'enzima tra-scrittasi inversa viene prodotta una copiadi DNA complementare all'RNA mes-saggero. La molecola di DNA a doppiaelica viene poi replicata molte volte; sisceglie inoltre un vettore appropriato perintrodurla nelle cellule batteriche.

Questo metodo comincia a dare discre-ti risultati nella produzione dell'ormonedella crescita umano e degli interferoni.Una deficienza dell'ormone della cresci-ta, prodotto dall'ipofisi causa una formadi nanismo che può essere curata sommi-nistrando l'ormone. L'ormone è specie--specifico; la sua fonte principale sonostati finora i cadaveri umani. L'ormonedella crescita potrebbe avere molti usi cli-nici, ma la quantità estremamente ridottadi sostanza disponibile ha ostacolato laricerca. La produzione microbiologica di

92 93

LIGASI

o ESTREMITÀ

ESTREMITÀ

COESIVA

V NON COESIVA

ATG GENE hGH COMPLETO 1-191

LIGASI

questo farmaco potrebbe non solo au-mentarne la disponibilità commerciale,ma anche facilitare la ricerca delle sueapplicazioni potenziali. La Genentech,una delle società fondate per sfruttare latecnologia del DNA ricombinante, si è

OLIGODESOSSINUCLEOTIDISINTETICI

(12 FRAMMENTI)

LIGASI

3 FRAMMENTI

1-1

\t LIGASI

HATG hGH 1-24

liPURIFICAZIONEE MONTAGGIO

OLLO

VETTORE PERL'ESPRESSIONE

as,

associata alla Kabi Gen AB, una societàsvedese, per produrre l'ormone della cre-scita umano.

Tra gli altri polipeptidi la cui produzio-ne microbiologica è attualmente allo stu-dio, gli interferoni sembrano avere le ap-

IPOFISI UMANA

m RNA

‘11 TRASCRITTASIINVERSA

hGH cDNA DI GRANDI DIMENSIONI

1/ ENDONUCLEASI

DI RESTRIZIONE

hGH cDNA 25-191

PURIFICAZIONE

plicazioni più promettenti, sebbene anchele più incerte. Gli interferoni sembranodotati di attività antivirali, in particolareper la prevenzione (piuttosto che la cura)delle infezioni virali. Potrebbero anchepossedere la capacità di inibire la crescitadelle cellule tumorali. Gli interferonisono sintetizzati dai leucociti (globulibianchi del sangue) e dai fibroblasti (cel-lule del tessuto connettivo). Gli interfe-roni disponibili finora sono stati estrattiprincipalmente dalle cellule umane, conuna resa molto bassa: da due litri di san-gue umano si ricava un microgrammo diinterferone dei leucociti.

Gli sviluppi recenti delle tecniche delDNA ricombinante hanno reso possibileprodurre 600 microgram mi di interferonedei leucociti da un litro di brodo di fer-mentazione, un miglioramento di più dimille volte rispetto alla produzione a par-tire dallo stesso volume di sangue. Il mi-glioramento della resa ha richiesto unaserie di modificazioni del procedimentodi produzione, molte delle quali ideate daDavid Goeddel e dai suoi colleghi allaGenentech e da Charles Weissman e daisuoi colleghi alla BioGen. Almeno quat-tro società stanno tentando di svilupparemetodi commerciali per la produzione diinterferone. Uno degli sviluppi recentipiù interessanti è stata la produzione conalte rese di interferone in cellule di lievitoper fermentazione.

I metodi del DNA ricombinante, parti-colarmente quelli applicati alla produzio-ne degli interferoni, potrebbero verosi-milmente rappresentare il prossimogrande progresso nella medicina clinica enei procedimenti industriali delle indu-strie farmaceutiche. Oltre all'insulina eagli interferoni i candidati più probabiliper questa forma di procedimento indu-striale includono i fattori di coagulazione(proteine del sangue che sono richiesteper una coagulazione efficiente), gli en-zimi che potrebbero servire nella terapiadei disordini genetici congeniti, l'urochi-nasi (un enzima che distrugge i coaguli disangue), gli immunostimolanti (proteineche innescano le reazioni immunologi-che), gli anticorpi e le proteine antigeni-che che si trovano sulla superficie dei vi-rus, che potrebbero venire utilizzate perla produzione di vaccini.

L'introduzione di nuovi metodi geneti-ci, tuttavia, non rappresenta un'innova-zione più radicale di quella costituita dal-l'introduzione degli antibiotici. I metodiassociati agli antibiotici hanno prodottocambiamenti sostanziali nella pratica cli-nica, nella ricerca pura e applicata e nellaproduzione industriale. La produzione dipolipeptidi umani da parte dei microrga-nismi potrebbe condurre all'introduzionenella pratica medica di sostanze, come gliinterferoni, dotate di proprietà clinichealtrettanto rivoluzionarie quanto quelledegli antibiotici. Nella ricerca applicata enella produzione industriale, tuttavia, inuovi metodi non rappresentano altroche estensioni sostanziali dei metodi ge-netici e delle tecniche di fermentazionegià sfruttate su scala gigantesca nella pro-duzione degli antibiotici.

Il gene per l'ormone della crescita umano è stato sintetizzato con una combinazione di sintesichimica e isolamento della molecola naturale. L'ormone della crescita umano è un polipeptidelungo 191 amminoacidi ed elaborato dai tessuti dell'ipofisi.11 suo interesse medico deriva dal fattoche la sua assenza provoca una forma di nanismo che può essere curata mediante somministrazio-ne dell'ormone. Il segmento di gene che codifica per i primi 24 amminoacidi del peptide fucostruito chimicamente a partire da gruppi di nucleotidi. Per ottenere il resto del gene sono statiutilizzati una 4erie di enzimi, come indicato da questo diagramma semplificato. La trascrittasiinversa è stata impiegata per ottenere una copia del gene per l'ormone a partire dall'RNAmessaggero isolato dai tessuti dell'ipofisi umana. Le endonucleasi di restrizione hanno tagliato viail frammento interessante dalla copia così ottenuta. La DNA ligasi è stata infine usata per saldare iframmenti naturali e sintetici. Il gene completo è stato inserito in una versione modificata delplasmide pBR322 contenente l'operonelac. La parte sintetica del gene per l'ormone della crescitaera stata costruita con il suo proprio codone di inizio (A TG), il gruppo di tre basi che fornisce ilsegnale di inizio per il processo di traduzione. Per questo motivo l'ormone poteva venire prodottoindipendentemente nelle cellule batteriche, senza necessità di attacco a una proteina batterica.

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