La peste del gambero o La peste del gambero o afanomicosiafanomicosi

Amedeo Manfrin Amedeo Manfrin Centro Specialistico Ittico Centro Specialistico Ittico -- IZSVe Adria (RO)IZSVe Adria (RO)

Centro di referenza nazionale per le malattie dei pesci, molluscCentro di referenza nazionale per le malattie dei pesci, molluschi e crostaceihi e crostaceiII Corso di aggiornamento IZSPLV II Corso di aggiornamento IZSPLV –– Torino 10 dicembre 2014Torino 10 dicembre 2014

PESTE DEL GAMBERO PESTE DEL GAMBERO

Agente eziologico: Agente eziologico: Aphanomyces astaciAphanomyces astaci�� Phylum ChromistaPhylum Chromista�� Classe Oomiceti Classe Oomiceti �� Ordine SaprolegnialesOrdine Saprolegniales�� Famiglia SaprolegniaceaeFamiglia Saprolegniaceae�� Genere Genere AphanomycesAphanomyces

Principale patologia dei gamberi dPrincipale patologia dei gamberi d ’’acqua dolce.acqua dolce.

Introdotta dal Nord America ha causato Introdotta dal Nord America ha causato rarefazione delle specie indigene in Europa.rarefazione delle specie indigene in Europa.

Caratterizzazione dei ceppiCaratterizzazione dei ceppi

�� Il Il gruppo Agruppo A (genotipo As) comprende ceppi isolati dai gamberi (genotipo As) comprende ceppi isolati dai gamberi europei: europei: Astacus astacusAstacus astacus e e A. leptodactylusA. leptodactylus; ;

�� Il Il gruppo B gruppo B (genotipo Ps I) ceppi isolati da (genotipo Ps I) ceppi isolati da Pacifastacus leniusculusPacifastacus leniusculus di di origine californiana; origine californiana;

�� Il Il gruppo Cgruppo C (genotipo Ps II) ceppi provenienti da (genotipo Ps II) ceppi provenienti da P. leniusculusP. leniusculus di di origine canadese; origine canadese;

�� Il Il gruppo Dgruppo D (tipo Pc) ceppi isolati da (tipo Pc) ceppi isolati da Procambarus clarkiiProcambarus clarkii..

�� Il Il gruppo Egruppo E isolato da isolato da Orconectes limosusOrconectes limosus in Repubblica Ceca, nuovo in Repubblica Ceca, nuovo genotipo.genotipo.

� I ceppi A-C hanno sviluppo in gamberi d’acqua fredda (4-21° C).

� I ceppi del gruppo D originano in regioni subtropicali del sud est degli Stati Uniti d'America e si sono adattati a crescere a temperature di 20-26° C.I ceppi del gruppo D risultano più virulenti a temperature superiori a 20° C rispetto ai ceppi di acqua fredda, e sono in grado di crescere piùrapidamente.

� I ceppi del gruppo E hanno una crescita ottimale a 22°C e produzione di spore tra 5-26°C ma non a 27°C.

Caratterizzazione dei ceppi

SensibilitSensibilit àà di speciedi specie

�� AstacidiAstacidi , specie europee (, specie europee (Astacus astacus, Austropotamobius Astacus astacus, Austropotamobius pallipes, A. torrentium e Astacus leptodactyluspallipes, A. torrentium e Astacus leptodactylus) ) molto sensibilimolto sensibili ..

�� CambaridiCambaridi , specie americane (, specie americane (Pacifastacus leniusculus, Pacifastacus leniusculus, Procambarus clarkii, Orconectes sppProcambarus clarkii, Orconectes spp..) pi) piùù resistentiresistenti . Il gambero . Il gambero giapponese (giapponese (Cambaroides japonicusCambaroides japonicus) ) èè specie sensibile.specie sensibile.

�� ParastacidiParastacidi , specie australiane (, specie australiane (Euastacus Euastacus sp., sp., Cherax Cherax sp., sp., Geocherax Geocherax sp., sp., Astacopsis Astacopsis spsp.).) molto sensibili molto sensibili a prove di infezione a prove di infezione in laboratorio (Unestam,1975).in laboratorio (Unestam,1975).

�� Il granchio guantato cinese (Il granchio guantato cinese (Eriocheir sinesisEriocheir sinesis) ) èè stato infettato in stato infettato in condizioni sperimentali (Benisch, 1940)condizioni sperimentali (Benisch, 1940)..

EPIDEMIOLOGIA E PATOGENESI

Aphanomyces astaci è un patogeno primario che attacca le aree meno calcificate della cuticola e le membrane delle articolazioni dei crostacei.

Le zoospore, che determinano la diffusione dell’infezione attraverso l’acqua, sono lo stadio infettante della malattia.

Le zoospore vengono attratte chemiotatticamente sulla parete dell’esoscheletro, spesso su lacerazioni o ferite, dove si incistano.

Se il punto di adesione non risulta idoneo possono tentare nuovamente la ricerca di un’altra area della cuticola.

La germinazione procede grazie alla secrezione di enzimi lipolitici e chitinolitici che diffondono attraverso lo strato lipidico della cuticola.

Si genera un tubo germinativo di penetrazione e le ife con attivitàproteasica e chitinasica cominciano a svilupparsi, progredendo parallelamente alle fibrille chitinose all’interno della cuticola, invadendo l’ipoderma e talvolta la muscolatura sottostante.

Raramente si ha diffusione in modo massivo in tessuti ed organi piùprofondi.

La zona di giunzione tra due segmenti addominali o le articolazioni sono il sito più opportuno per l’incistamento

Le zoospore, libere in acqua, generalmente sono attive per un periodo variabile da pochi minuti a tre giorni, ma secondo la temperatura ambientale i tempi possono essere molto più lunghi.

La peste si trasmette per via orizzontale. La trasmissione verticale èstata segnalata in Finlandia in uova di gamberi della Californiaincubate artificialmente (Makkonen et al,. 2010).

Le spore rimangono vitali nel muco della pelle e del tratto intestinale del pesce. L’introduzione di materiale ittico da ripopolamento può facilitare la diffusione di A. astaci anche per la presenza di spore nell’acqua di trasporto. La pulizia e l'eviscerazione dei pesci provenienti da altri corpi idrici è una potenziale fonte di infezione (Hall & Unestam 1980).

Mammiferi, come la lontra, il visone o topi muschiati e uccelli acquatici sono stati accusati di diffondere la peste dei gamberi in Europa.

Poiché studi scientifici hanno dimostrato che le zoospore non sopravvivono alle temperature del tratto gastrointestinale di mammiferi o uccelli (Oidtmann et al.,2002), la trasmissione può avvenire tramite la sola veicolazione, sulla superficie corporea, di acqua contaminata.

Aphanomyces astaci può quindi sopravvivere nell’ambiente, in assenza dell’ospite, per diverse settimane, pertanto si raccomanda di non ripopolare i corpi idrici prima di tre mesi dalla scomparsa per peste dei gamberi di fiume.

I cadaveri dei crostacei mantenuti all’aria, a temperatura ambiente (circa 21°C), risultano ancora infettanti dopo 48 ore, in acqua dopo 3-5 giorni.

A. astaci può essere veicolato da equipaggiamento contaminato (barche, attrezzatura da pesca, stivali, vestiario, ecc.). In condizioni ideali, anche piccole quantità di acqua sono in grado di trasferire sufficienti zoospore per infettare un nuovo corpo idrico. Circa 1,3 zoospore per millilitro di acqua sono sufficienti ad infettare gamberi sensibili (Alderman et al., 1987).

Quando si manifesta la malattia in una nuova area, la popolazione astacicola presenta elevatissima e rapida mortalità. La morte di tutti i gamberi si verifica entro 6-10 giorni (Unestam & Weiss, 1970; Alderman et al., 1987).

Dopo molti decenni di infezione, non ci sono osservazioni di sviluppo di resistenza ed immunità alla malattia in specie europee di gambero (Unestam 1973b; Westman 1991; Svärdson 1992).

La malattia, nei corsi d’acqua, si diffonde rapidamente lungo la direzione del flusso mentre è più lenta la propagazione controcorrente.

Raramente individui sensibili possono essere rinvenuti vivi dopo un episodio di peste, se ciò si verifica si deve ad una mancata esposizione al patogeno (animali presenti in corsi d’acqua tributari).

Il periodo di incubazione e la durata della malattia fino alla scomparsa di tutti i soggetti sensibili è in relazione:� alla dose infettante,� alla temperatura dell’acqua� alla densità di popolazione (Unestam, 1969a; Unestam &Weiss, 1970; Dieguez-Uribeondo & Söderhäll, 1993)

Il comportamento degli animali colpiti (andatura o attività insolita), fornisce un indizio per una diagnosi di peste, ma i segni clinici non sono sufficienti.I primi segni di malattia sono di tipo comportamentale, in presenza di un elevato numero di soggetti morti. (Alderman & Polglase, 1986). Si osserva inizialmente un aumento dell’attività motoria, seguito da apatia.

Segni clinici

L’animale affetto da peste si mostra, in pieno giorno, con gli arti in estensione, esce dall’acqua e tenta di arrampicarsi sull’argine, si muove in modo incoordinato, èinstabile con perdita dell’equilibrio, non tenta di fuggire alla cattura e si manifesta inerte se trattenuto

Al culmine dell’infezione i soggetti si rovesciano sul dorso, muovono convulsamente le appendici e non riescono a raddrizzarsi. Talvolta la morte si manifesta per paralisi, in questa posizione. Frequentemente si può manifestare il distacco degli arti o porzioni di essi.

La morte dell’ospite è la conseguenza di una neurotossina.

Aree ulcerate brunastre sono più frequenti in gamberi alloctoni resistenti e portatori o in gamberi indigeni con infezione subacuta.

A temperature inferiori a 10°C, i gamberi infetti richiedono tempi più lunghi per morire, e i segni clinici sono più apparenti, come la perdita di un arto e la presenza di ulcere melanotiche (Alderman et al., 1987).

Lesioni istologiche

All’osservazione istologica l’esoscheletro, l’ipoderma, piùraramente il muscolo scheletrico sottostante e le branchie si presentano invasi da ife asettate e ramificate

DIFFUSIONE DELLA PESTE IN ITALIA E IN EUROPA

La malattia è stata descritta per la prima volta in Italia nel 1859 (Cornalia 1860). Non fu mai isolato l’agente eziologico.

Ben presto la peste, ritenuta al tempo essere provocata da parassiti o batteri, si propagò in tutta l’Europa centrale e successivamente a tutto il continente.

Nuovi focolai in ItaliaIn Italia, dopo le segnalazioni della metà del 1800 episodi di afanomicosi sono riportati:

• 1999, A. repetans in Procambarus clarkii, valle di Marmorta (BO) (Galuppi et al., 2002; Royo et al.,2004).

• 2008 A. astaci in P. clarkii, Lombardia e Toscana (Gherardi comunicazione personale).

• 2009 A. astaci in Austropotamobius pallipes, in Molise (IS) (Cammà et al., 2010)

• 2010 A. astaci in A. pallipes,Valdobbiadene (TV)

•2011 A. astaci in A. pallipes,Trentino, fiume Chiese, Ponte S. Lucia

• 2011 A. astaci in A. pallipes,Lombardia, Montevecchia (LC)

• 2011 A. astaci in A. pallipes, Abruzzo, Cragnoleto (TE)

• 2011 A. astaci in Cherax destructor, in Veneto, Mogliano Veneto (TV)

Nuovi focolai in Italia

Nuovi focolai in Italia• 2012/13 A. astaci in A. pallipes,

provincia di Teramo

• 2013 A. astaci in A. pallipes, provincia di Perugia

• 2014 A. astaci in A. pallipes in Friuli (Amaro – UD)

LIFE RARITY Project

DIAGNOSI in CAMPO:

SEGNI CLINICI E COMPORTAMENTALI :

• elevata mortalità esclusiva di gamberi in presenza di normale fauna ittica.

• letargia, paralisi o incoordinazione degli arti

• esemplari rovesciati sul dorso

• se catturati perdita del riflesso della coda e scarsa tonicità muscolare

• presenza di aree brunastre, giallastre o grigiastre sulla cuticola addominale o alla base degli arti

• animali che abbandonano i rifugi o escono dall’acqua durante il giorno

DIAGNOSI di LABORATORIO

Tessuti target per identificazione o isolamento di A. astaci:

• Nelle specie sensibili (Astacus astacus, Austropotamobius pallipes, A. torrentium) prelievo da cuticola addominale.

• Nelle specie resistenti Nord Americane prelievo di cuticola addominale, telson e aree melanizzate di arti e cuticola.

Immagine

DIAGNOSI di LABORATORIO

ESAME A FRESCO:

• porzione di cuticola osservata a piccolo ingrandimento• identificazione di ife asettate ed eventuali sporangi• la presenza di infiltrato emocitario e melanizzazione associata alle ife tende ad escludere che si tratti di micosi secondarie

ESAME COLTURALE IN TERRENO AGARIZZATO (ALDERMAN,1986):

• RGY agar (River water Glucose Yeast extract Agar)• richiede esemplari vivi o morti entro le 12-24 ore (refrigerati)• efficace solo in specie sensibili, richiede tempi lunghi (15 gg)• isolamento ed identificazione morfologica di ife e sporangi• necessario per analisi molecolare RAPD-PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA)

Crescita in RGY agar (River water Glucose Yeast extract Agar)

ESAME ISTOLOGICO:

• eseguito su esemplari vivi o fissati in campo (fissativo di Davidson o formalina)• evidenzia la presenza di ife fungine (colorazione di Grocott) • non discrimina tra A. astaci e infezioni micotiche secondarie

ANALISI MOLECOLARE (PCR):

• eseguibile su vivo, morto, congelato o fissato in etanolo• efficace anche nelle specie resistenti (Procambarus clarkii)• metodica più sensibile e specifica

realreal --time PCRtime PCR(screening)(screening)

PCR endPCR end --pointpoint

(confirmation)(confirmation)

Reference: Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals – OIE World Organization for

Animal Health; ed. 2012, chapter 2.2.1; pp: 101-118.

CP 2CP 1 Neg Pos Marker 100 bp

Primer

BO42F :

5’ GCTTGTGCTGAGGATGTTCT 3’

BO640R :

5’ CTATCCGACTCCGCATTCTG 3’

Primer forward: AphAstITS-39F: Primer reverse: AphAs tITS-97R:

5’AAGGCTTGTGCTGGGATGTT3’ 5’CTTCTTGCGAAACCTTCTGCTA3’

Probe: AphAstITS-60T

5’-6-FAM-TTCGGGACGACCCMG-BNF-Q-3’

Working in progressWorking in progress

�� Arrivare alla tipizzazione genetica anche dei precedenti campionArrivare alla tipizzazione genetica anche dei precedenti campioni i positivi (monitoraggio 2011positivi (monitoraggio 2011--13).13).

�� Validazione di una tecnica di screening non invasiva (tamponi Validazione di una tecnica di screening non invasiva (tamponi cuticolari) per identificare i portatori prima di introdurli in cuticolari) per identificare i portatori prima di introdurli in impianto per impianto per la riproduzione o di spostarli da un corso dla riproduzione o di spostarli da un corso d’’acqua allacqua all’’altroaltro..

�� Testare i giovanili per essere sicuri che siano negativi prima dTestare i giovanili per essere sicuri che siano negativi prima del el rilascio.rilascio.

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PREVENZIONE

Misure preventive secondo AUSTRALIAN AQUATIC VETERINARY EMERGENCY PLAN Disease Strategy Crayfish plague, 2005 e OIE: Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2013 :

o evitare la movimentazione di gamberi vivi o morti, potenzialmente infetti, di acqua o attrezzatura contaminata, verso aree indenni ospitanti popolazioni suscettibili.

o evitare la movimentazione ed il rilascio di specie ittiche provenienti da aree soggette ad episodi di afanomicosi.

o evitare la cattura accidentale di gamberi alieni, possibili carrier di A. astaci, durante le movimentazioni di fauna ittica tra bacini diversi.

o evitare il rilascio in natura di gamberi alieni Nord-Americani (acquariofili)

o applicare una corretta disinfezione di attrezzatura (guadini, nasse), stivali, natanti e veicoli tra campionamenti effettuati in bacini diversi.

METODI di DECONTAMINAZIONE

ESSICCAMENTO: il micelio e le spore risultano inattivate dopo disidratazione per 48-72 ore.

TRATTAMENTO TERMICO: risulta efficace il riscaldamento a 60°C per pochi minuti, e il raffreddamento a -20°C per 72 ore (Oidtmann et al 2002).

DISINFEZIONE CHIMICA:

• ipoclorito di sodio: 100 ppm per 30’’ utile per strumentario e acqua contaminata

• iodofori: 100 ppm fino a 32’

• acido peracetico: 100 ppm per 5’ (soluzione al 5% in H2O2)

• formalina (prodotto potenzialmente cancerogeno)

SMALTIMENTO DEI GAMBERI IN SEDE DI FOCOLAIO

Raccolta delle carcasse e termodistruzione tramite ditta specializzata secondo disposizioni del Regolamento UE 1069/2009 e s.m.i..

SORVEGLIANZA

Necessaria per individuare nuovi focolai, definire l’estensione della zona infetta e monitorare i siti di ripopolamento

Basata su tre metodi:

• semplice osservazione del comportamento e dei fenom eni di mortalità di gamberi nel territorio

• monitoraggio periodico dello stato sanitario di pop olazioni di gamberi in differenti siti tramite analisi di labor atorio

• impiego di animali sentinella in bacini precedentem ente infetti o sospetti.

GRAZIE PER L’ATTENZIONE

manfrin@izsvenezie.it