LA MULTIPLEX-LIGATION DEPENDENT LA MULTIPLEX-LIGATION DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION (MLPA) COME PROBE AMPLIFICATION (MLPA) COME

NUOVA TECNICA PER LO STUDIO NUOVA TECNICA PER LO STUDIO MOLECOLARE DEL MELANOMA MOLECOLARE DEL MELANOMA

CUTANEOCUTANEO

L. Schirosi, N. Bigiani, G. Sartori, S. Bettelli, L. Garagnani, M. Masini, M. Gozzoli, A. Maiorana

Dipartimento integrato Servizi Diagnostici e di Laboratorio e di Medicina Legale, Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia,

Modena

INTRODUZIONEINTRODUZIONE

• Il melanoma cutaneo (MC), sebbene rappresenti solo il 4% di tutti i tumori cutanei, è la causa del maggior numero di decessi correlati ai tumori della pelle.

• La diagnosi precoce, un’accurata valutazione prognostica e la scelta di un trattamento terapeutico mirato sono essenziali per aumentare il tasso di sopravvivenza.

• Ciò, tuttavia, è reso ulteriormente difficile dal fatto che alla base di tale neoplasia esistono complessi meccanismi eziopatogenetici che impediscono una chiara e precisa identificazione delle alterazioni molecolari responsabili della tumorigenesi e dello sviluppo di metastasi.

• Tra le principali anomalie riscontrate a livello cromosomico, quelle più frequenti sono a carico del locus genico 9p21, che risulta deleto in circa il 20% dei MC, a livello del quale mappano diversi geni che hanno azione di oncosoppressori.

• Tra questi:

- CDKN2A che codifica sia per la proteina INK4a (p16) che per ARF (p14),

- CDKN2B (p15),

- MTAP (metiltioadenosina fosforilasi) che codifica, invece, per un enzima coinvolto nella sintesi delle poliamine.

• Non è ancora particolarmente conosciuta l’eventuale implicazione terapeutica della delezione di questi geni, tuttavia è stato dimostrato che la perdita di funzione dell’enzima MTAP possa compromettere lo stato di risposta alla terapia con interferone.

• Il presente studio è stato svolto con l’obiettivo di riuscire a caratterizzare in modo preciso le alterazioni del numero di copie dei principali geni situati nel locus 9p21, in un piccolo gruppo di MC, avvalendosi di una recente tecnica di biologia molecolare, la Multiplex - Ligation dependent Probe Amplification (MLPA).

SCOPOSCOPO

• Sono stati analizzati 19 casi di MC, fissati in formalina ed inclusi in paraffina, con il Kit SALSA MLPA P024 9p21 (MRC Holland) che consente di indagare l’alterazione del numero di copie di 39 sequenze di acido nucleico in una singola reazione, di cui 24 corrispondono ai principali geni del locus 9p21 (tra cui CDKN2A, CDKN2B e MTAP).

METODIMETODI

• Questo metodo si basa sull’ibridazione di sonde specifiche con le corrispondenti sequenze di DNA genomico, seguita poi da una PCR multiplex delle sonde ibridizzate e successiva analisi semiquantitativa dei prodotti di amplificazione.

(http://www.mlpa.com)

• 6 casi su 19 sono risultati alterati. In particolare:

- 2 casi presentano la delezione del gene CDKN2A,

- 1 caso è deleto sia per il gene CDKN2A che CDKN2B

- 3 casi evidenziano contemporaneamente la delezione dei geni CDKN2A, CDKN2B e MTAP.

RISULTATIRISULTATI

CONTROLLO

CAMPIONE

Delezione (nel campione rispetto al controllo) del picco corrispondente al gene CDKN2A

Delezione (nel campione rispetto al controllo) del picco corrispondente al gene CDKN2B

Delezione (nel campione rispetto al controllo) del picco corrispondente al gene MTAPMTAP

• Questa tecnica risulta di facile applicazione, grazie anche all’utilizzo di pochi ng di DNA (50-200 ng), fornisce in una singola reazione informazioni sull’assetto di più geni in tempi brevi (48 ore) e con costi contenuti.

• Per queste caratteristiche, l’MLPA appare una metodica ottimale per ottenere una caratterizzazione dettagliata del locus 9p21 nei MC.

CONCLUSIONICONCLUSIONI

• Se validata da uno studio retrospettivo, la conoscenza, in modo così fine, della combinazione di tali alterazioni molecolari può essere sicuramente d’ausilio al clinico nell’effettuare una valutazione prognostica migliore della neoplasia per ogni singolo paziente, accompagnata da una scelta mirata del trattamento terapeutico.