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ISOLAMENTO E CARATTERIZZAZIONE DI CEPPI DI MYCOBACTERIUM BOVIS DA BOVINI SICILIANI NEL 2010

Caracappa S.1, Pacciarini M.2, Vicari D.1, Marineo S.1, Boniotti M.B.2, Tagliabue S.2, Galuppo L.1, Briganò S.1, Torina A.1, Galluzzo P.1, Nifosì D.3, Disclafani R.1 e Currò V.1

1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia, Area Palermo, Via G. Marinuzzi, 3 - 90129 Palermo2 Centro Nazionale di Referenza per la Tubercolosi Bovina, Istituto Zooprofilattico SperimentaleLombardia e Emilia-Romagna, Via Bianchi 9, 25124 Brescia3 Assessorato Regionale della Salute, Dipartimento Attività Sanitarie e Osservatorio Epidemiologico,Piazza Ziino - 90145 Palermo

Riassunto

La tubercolosi bovina, causata da Mycobacterium bovis, continua a rappresentare un im-portante problema sanitario oltre che per l’economia dell’azienda zootecnica agendo da insi-dioso rischio sanitario sia per la salute degli animali che per quella dell’uomo in quanto zoonosi.Una migliore comprensione delle fonti di infezione e delle modalità di trasmissione dei foco-lai può implementare l’efficacia delle misure di controllo. Lo spoligotyping è uno strumentouniversalmente accettato per la differenziazione di primo livello dei ceppi di M. bovis. Scopodi questo lavoro è quello di riportare la diversità genetica dei ceppi di M. bovis isolati presso ilaboratori dell’Area Diagnostica (Palermo) dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Si-cilia nel 2010.

Parole chiave: Tuberculosi bovina, Mycobacterium bovis, allevamenti siciliani.

Summary

Isolation and characterization of Mycobacterium bovis strains from Sicilian bovines during 2010

Bovine tuberculosis, caused by Mycobacterium bovis, still represents an important causefor economical losses and for animal and human health. A better understanding of sourcesof infection could be considered an effective support for control measures. Spoligotypinghas been accepted as first diagnostic tool for M. bovis typing. The aim of this study is to re-port the characterization, carried out at the Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Si-cilia, of M. bovis isolated in Sicily during 2010 to start an epidemiological survey of thisimportant pathology.

Keywords: bovine tuberculosis, Mycobacterium bovis, Sicilian farms.

© Copyright 2012 by Società Italiana di Buiatria

Introduzione

Mycobacterium bovis, agente eziologico della tubercolosi bovina, malattiainfettiva contagiosa e diffusiva, a lenta evoluzione, colpisce gli animali domestici,selvatici e l’uomo. Lesioni ossee patognomiche indicative di tubercolosi in bo-vidi sono state trovate in scheletri dell’era glaciale. Dati storici evidenziano chela tubercolosi bovina è emersa come problema sanitario durante il periodo colo-niale attraverso l’esportazione di bovini infetti principalmente dall’Europa conti-nentale (Regno Unito e Paesi Bassi) alle loro colonie (Renwick et al., 2007). Nelcontinente Africano M. bovis è stato descritto all’inizio del ventesimo secolo in se-guito all’introduzione di bovini da latte importati dall’Europa per il miglioramentodelle produzioni (Michel et al., 2010). In Italia il controllo della tubercolosi bovinaè iniziato già negli anni ’50 con i piani di Bonifica continuati con i piani di risa-namento (L., 615 del 1964) e il piano di Eradicazione D.M.592 del 1995 e, suc-cessivamente in Sicilia, con O.M. del 2006 e il piano straordinario n.129 del 2008.Dagli anni ’70 in alcune regioni del Nord Italia (Trentino Alto-Adige e Friuli Ve-nezia Giulia) la tubercolosi bovina è stata eradicata mentre in altre regioni, delsud Italia, la patologia persiste sebbene con diverse prevalenze (ad esempio in Si-cilia, Puglia e Lazio) (Boniotti et al., 2009).

La tubercolosi rappresenta un problema rilevante che limita il commerciodegli animali causando ingenti perdite all’economia nell’azienda zootecnica eagendo quale rischio sanitario sia per la salute degli animali che per quella del-l’uomo in quanto zoonosi.

Tra i principali fattori di rischio possiamo menzionarne diversi che favori-scono la diffusione di questo patogeno come: la modalità di allevamento (stabu-lazione fissa, e/o brado), la densità dei capi, fiere e mercati), l’abigeato, l’indirizzoproduttivo (latte o carne) e l’età dei soggetti (sono maggiormente recettivi gliadulti) (Fig. 1).

M. bovis è altresì un patogeno in grado di infettare anche la fauna selvatica chepuò costituire un importante reservoir per le mandrie allevate allo stato brado osemi-brado. È inoltre un patogeno in grado di infettare l’uomo causando una ma-lattia indistinguibile da quella d’origine umana causata da M. tuberculosis. La tra-smissione di M. bovis avviene attraverso il consumo di alimenti contaminati,contatto diretto (aerosol), con capi infetti o con attrezzi d’uso costituendo rischiodi malattia professionale (ad esempio animali o personale di stalla con forme diTBC aperta a livello polmonare o renale). Il contagio da uomo a uomo sembra es-sere raro (Evans et al., 2007).

Tra i reservoir selvatici nell’Europa Mediterranea hanno particolare interessei cinghiali (Sus scrofa, Di Marco et al., 2012) e nell’Europa Continentale i tassi sel-vatici (Meles meles). (Qui citerei il lavoro di Vincenzo Di Marco et al. 2012 inuscita sul J. Clin. Microbiol. e già scaricabile da web dal titolo: “).

6 Buiatria. Journal of the Italian Association for Buiatrics vol. 6 - n. 4, 2011

7Isolamento e caratterizzazione di ceppi di Mycobacterium bovis, ecc.

M. bovis è un agente patogeno resistente nell’ambiente esterno (fino a 100giorni negli escreti essiccati). Da non sottovalutare il potere infettante del lattecrudo e dei suoi derivati nonostante a 65°C il batterio venga inattivato.

La tubercolosi è una patologia con alterazioni nodulari, a carattere granulo-matoso (Fig. 2). Il microrganismo entra annidandosi nel pacchetto linfonodalepolmonare o mesenterico dando origine al complesso primario.

Fig. 1: Allevamento brado.

Fig. 2: Nodulo tubercolare.

Il complesso primario non da sintomatologia clinica. Le manifestazioni clini-che si sviluppano nella generalizzazione precoce e nella TBC organica cronica e ge-neralizzazione tardiva (TBC organica cronica e collasso delle resistenze) (Fig. 3).

Le manifestazioni cliniche sono aspecifiche e a causa del lungo periodo diincubazione. Il test di intradermoreazione alla tubercolina (test PPD) e/o l’identi-ficazione dei microrganismi attraverso tecniche microbiologiche o molecolari sonoquelle indicate dalla normativa.

Un fattore di rilievo nei programmi di eradicazione è rappresentato dalla trac-ciabilità epidemiologica che evidenzia la trasmissione all’interno della specie bo-vina o da parte di animali selvatici. Una comprensione più chiara delle fonti edelle modalità di trasmissione dei focolai può implementare l’efficacia delle mi-sure di controllo (Roring et al., 2002).

I micobatteri raggruppati nel Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC,che comprende M. tubercolosis, M. bovis, M. caprae, M. microti e M. africanum)sono caratterizzati dal 99,9% di similarità a livello nucleotidico e sequenze rRNA16S identiche, ma differiscono grandemente per tropismo d’ospite, fenotipo e pa-togenicità (Brosch et al., 2002). Numerose sono le metodiche di biologia mole-


Fig. 3: A. Bovino, milza: tisi perlacea; B. Bovino, fegato: tisi perlacea e lesioni nodularinodose sparse nel parenchima; C. Bovino, fegato: lesioni nodulari sparse nel pa-renchima; D. Bovino, fegato: lesioni nodulari sparse nel parenchima. Generalizzazione precoce-protratta.


colare utilizzate per la caratterizzazione dei ceppi di M. bovis. Lo spoligotypingpermette di identificare differenze presenti nel locus DR (direct repeat) ovvero insequenze multiple ripetute separate da sequenze spaziatrici non ripetute. I ceppipossono variare per la presenza/assenza delle sequenze spaziatrici e sulla basedelle combinazioni possibili gli isolati vengono assegnati a diversi spoligotipi (Ka-merbeek et al., 1997). Il vantaggio è che i risultati possono essere presentati in unmodo binario standardizzato che permette un facile paragone tra ceppi isolati al-l’interno di un laboratorio e in laboratori presenti in diverse parti del mondo(www.mbovis.org). Sebbene lo spoligotyping sia rapido ed economico, ha un po-tere discriminatorio basso. I loci MIRU-VNTR sono stati estensivamente studiatiper caratterizzare geneticamente diversi patogeni come E. coli O157:H7, Yersi-nia pestis, S. aureus, Brucella spp. e Borrelia spp. (Reyes e Tanaka, 2010).

L’analisi VNTR/MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units-Varia-ble Number Tandem Repeats), è stata applicata per la tipizzazione dei ceppi ap-partenenti al MTBC (Frothingham e Meeker-O’Connel, 1998; Supply et al.2000;Skuce et al. 2002). In particolare l’associazione di MIRU-VNTR con la tecnicaspoligotyping (Boniotti et al. 2009) aumenta il potere differenziativo del sistemadi tipizzazione fornendo informazioni interessanti anche per i rintracci epide-miologici.

Scopo di questo lavoro è quello di riportare la diversità genetica dei ceppi diM. bovis isolati presso i laboratori dell’Area Diagnostica (Palermo) dell’IstitutoZooprofilattico Sperimentale della Sicilia nel 2010.

Materiali e metodi

Lo studio è stato effettuato su un totale di 105 ceppi isolati in Sicilia nel 2010. Il materiale patologico, rappresentato da organi con lesioni evidenti, è stato

prelevato negli impianti di macellazione al momento della visita sanitaria post-mortem, conservato in contenitori a tenuta ermetica, e inviato il più celermentepossibile ai laboratori sempre accompagnato da una scheda riassuntiva dove è de-scritta l’anamnesi del caso. Quest’ultima è sempre raccolta da un veterinario uf-ficiale ed inoltrata congiuntamente ai campioni presso i laboratori dell’IstitutoZooprofilattico Sperimentale della Sicilia mantenendo sempre la catena del freddo.All’arrivo in laboratorio i campioni sono processati secondo le procedure Opera-tive Standard in uso presso l’Istituto (POS DIA05) utilizzando una cappa a flussolaminare di III livello.

Tutti gli isolati provenienti da materiale patologico (polmoni,fegato, milza,linfonodi polmonari e/o mesenterici) prelevati da bovini positivi alla prova tu-bercolinica intradermica (PPD bovina) o che mostravano lesioni sospette du-rante l’ispezione post-mortem al momento della visita ispettiva al macello. Gli

isolati sono stati identificati mediante tecniche microbiologiche in accordo conle Procedure Operative Standard in uso presso l’Istituto (POS DIA05). La spo-ligotipizzazione e l’analisi MIRU-VNTR sono stati effettuati presso il Centro diReferenza Nazionale per la tubercolosi Bovina, IZSLER, Brescia (Boniotti etal., 2009).

Risultati

I risultati provenienti da 105 ceppi di M. bovis isolati da bovini macellati inSicilia durante l’anno 2010 presso i laboratori dell’Istituto Zooprofilattico Speri-mentale della Sicilia.

Tutti gli isolati sono stati caratterizzati mediante tipizzazione molecolarepresso il Centro di Referenza Nazionale per la tubercolosi Bovina, IZSLER, Bre-scia. In tabella 1 sono indicate le frequenze con cui gli spoligotipi identificati sonopresenti in Sicilia. È possibile vedere come lo spoligotipo SB0120 sia quello piùdiffuso in tutte le province siciliane e che percentuali significative vi sono ancheper l’SB0134 e l’SB0841. In figura 3 è rappresentata la distribuzione percentualedegli spoligotipi di M. bovis in Sicilia durante il 2010.

Tutti gli isolati sono stati ulteriormente caratterizzati mediante 5 loci ETR(A-E) e 5 loci QUB (11a, 11b, 3232, 15 e MIRU26) (dati non mostrati).


Spoligotipo Province Frequenza (%)

SB0120 ME, PA, SR, RG, CT, EN 47,6

SB0134 ME, PA, RG, CT, EN 19,0

SB0841 ME, PA, SR, RG, CT, EN 19,0

SB1550 ME, SR, EN 0,03

SB1305 EN 0,02

SB0121 PA 0,01

SB0133 ME 0,01

SB0822 RG 0,01

SB0828 EN 0,01

SB0897 EN 0,01

SB0961 EN 0,01

SB1567 EN 0,01

SB1945 RG 0,01

ND ME, SR 0,02

TABELLA 1. Frequenza degli spoligotipi osservati in Sicilia nel 2010


Discussione

La tipizzazione dei ceppi è considerato un utile strumento per identificarel’origine delle infezioni (i focolai) e le vie di trasmissione. L’analisi dei batteriisolati in Sicilia nel 2010 ha permesso di mettere in evidenza la presenza di 13 di-versi spoligotipi. Lo spoligotipo più diffuso si è rivelato essere l’SB0120. Que-st’ultimo è il più diffuso in Italia (Boniotti et al., 2009), in Francia (Haddad et al.,2001) ed è il secondo maggiormente presente in Spagna (Aranaz et al., 1996) edè stato riscontrato in bovini, cervi e cinghiali selvatici (Rodriguez et al., 2010) ein infezioni umane (Lari et al., 2011). Lo spoligotipo SB0121 è molto diffuso inPortogallo (Duarte et al., 2008) e in Francia (Haddad et al., 2001). Anche lo spo-ligotipo SB0134 è diffuso in Francia e in UK (Zanella et al., 2008). Lo spoligo-tipo SB0134 è stato frequentemente isolato in UK e Irlanda (Smith et al., 2006)ma anche in bovini e animali selvatici (Zanella et al., 2008).

Dall’analisi della distribuzione degli spoligotipi è stato possibile mettere inluce che le aree interne del centro Sicilia rappresentano la zona con la più alta va-riabilità di ceppi isolati. Questa diversificazione può essere spiegata considerando

Fig. 4: Rappresentazione della distribuzione percentuale degli spoligotipi di M. bovis inSicilia durante il 2010.

il fatto che l’entroterra, viste le estensioni degli ambienti boschivi, costituisce ha-bitat ideale per l’allevamento brado linea “vacca-vitello”; inoltre, questo territo-rio, in cui avviene tuttora la transumanza dai Monti Nebrodi e Madonie verso lezone rivierasche a sud Est (nella prima decade di Dicembre e in direzione oppo-sta nel mese di Giugno) costituisce il crocevia delle antiche “regie trazzere”.

I risultati di questa analisi contribuiscono a incrementare le conoscenze sullademografia di M. bovis in Sicilia e costituiscono un punto di partenza per un’ana-lisi anche retrospettiva della diversità dei ceppi isolati nelle diverse province.

È auspicabile dunque, che in accordo con il Piano Straordinario di Eradica-zione della TBC (O.M. 14.11.2006, Misure straordinarie di polizia veterinaria inmateria di Tubercolosi, Brucellosi bovina e bufalina, Brucellosi ovicaprina, Leu-cosi in Calabria, Campania, Puglia e Sicilia), in seguito alla identificazione e cen-simento di tutti i capi e di tutte le aziende, vengano identificate tutte le aziendeproblema e i capi problema e si proceda con l’isolamento e la tipizzazione deiceppi.

Inoltre, la genotipizzazione deve essere completata con l’analis dei marca-tori VNTR/MIRU (Boniotti et. al. 2009). Lo spoligotyping è un utile strumento perla mappatura geografica dei ceppi, una preliminare differenziazione e l’identifi-cazione di M. bovis e M. caprae ma, a causa della sua capacità discriminativa,non è sufficiente per un’approfondita analisi epidemiologica.

Considerato, infine, che nella seconda metà del secolo scorso la tubercolosibovina, a seguito dell’applicazione dei piani di risanamento e controllo, è stataeradicata in numerosi paesi, se si rispettassero i tempi e le azioni previste, si po-trebbe sperare nel raggiungimento dei medesimi risultati e debellare tale patolo-gia che sicuramente rappresenta un serio rischio sanitario oltre che un elevatocosto per la comunità.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano la dott.ssa Valeria Vitale Badaco, la sig.ra Grazia Ru-bino, la dott.ssa Rosa Calato e la dott.ssa Daniela Loda per il prezioso contributotecnico.

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