LIPIDI LIPO PROTEINE e IPERLIPIDEMIEIPERLIPIDEMIE

Lipidi: DEFINIZIONE e SIGNIFICATO

I lipidi, o grassi, costituiscono un gruppo eterogeneo di sostanze, accomunate dalla proprietà fisica della insolubilità nei solventi polari (idrofobicità) e dalla solubilità nei solventi apolari (lipofilicità).

Dal punto di vista fisiologico i lipidi presenti nel sangue sono distinguibili in:

LIPIDI di DEPOSITO TRIGLICERIDIACIDI GRASSI Funzione energetica

LIPIDI STRUTTURALI FOSFOLIPIDIGLICOLIPIDI COLESTEROLOCostituenti fondamentali delle membrane cellulari

LIPIDI nel SANGUE

Variazioni INTERindividuali dei livelli lipemici sono attribuibili a:

ETA’ SESSO caratteristiche GENETICHE ed

ETNICHE abuso di alcool o tabacco gravidanza

Variazioni INTRAindividuali dei livelli lipemici sono attribuibili a:

variazioni stagionali cambiamenti di regimi

alimentari stress

La quantità di LIPIDI TOTALI nel plasma varia fra 500 e 1000 mg % con un valore medio di 750 mg %.La definizione di ambiti di riferimento per i parametri lipidici del plasma risulta difficoltosa, a causa delle ampie variazioni inter e intra individuali.

Da tali ragioni nasce l’esigenza di eseguire prelievi di sangue per le ricerche sui lipidi 12-14 ore dall’assunzione dell’ultimo pasto, preferibilmente dopo 3 giorni di dieta equilibrata, in soggetti a riposo.

Tabelle valori lipidici Valori usuali della colesterolemia totale in rapporto ad età e sesso

Valori di riferimento per i trigliceridi in rapporto ad età e sesso

METODI di DOSAGGIO dei lipidi nel sangue

TRIGLICERIDI : dosati con metodo ENZIMATICO-COLORIMETRICO La tecnica consiste in una preventiva idrolisi enzimatica e una successiva misurazione a partire dal glicerolo liberato. COLESTEROLO: dosato con metodo ENZIMATICO. Il campione di siero in esame è cimentato con un reattivo contenente soluzione tamponata di fosfati a pH 6,75 e sottoposta alla azione dei seguenti enzimi : - una idrolasi per gli esteri del colesterolo(idrolizza colesterolo esterificato) - una ossidasi in grado di ossidare tutto il colesterolo libero e di produrre del perossido di idrogeno - una perossidasi che in presenza di perossido d’idrogeno ossida l’idrossibenzoato di sodio e la 4-aminotipirina presente nel reattivo a formare un complesso chinonico colorato. Infine l’intensità del colore viene letta fotometricamente a lunghezza d’onda pari a 510 nm e d è proporzionale alla concentrazione del colesterolo nel campione.

FOSFOLIPIDI : dosati con metodi enzimatici diretti

NEFA: dosati con metodi ENZIMATICI basati sull’impiego dell’acetil-CoA

sintetasi che in presenza di ATP e coenzima A dà luogo a formazione di acetil-CoA che per ossidazione dà enoil-CoA e H2O2

COLESTEROLO-HDL: si aggiungono al siero POLIANIONI (eparina, fosfotungstato o solfato di destrano) e CATIONI bivalenti (Ca++,Mg++, Mn ++) al fine ottenere la precipitazione e , sucessivamente, separazione per centrifugazione delle LDL e delle VLDL. Le HDL rimaste nel sovranatante vengono poi saggiate con i metodi utilizzati per la misura del colesterolo.

TRASPORTO dei lipidi nel sangue I lipidi vengono trasportati nel

sangue sottoforma di aggregati micellari lipoproteici ( LIPOPROTEINE ) capaci di formare sospensioni stabili.

Tali formazioni risultano costituite dall’aggregazione di detti lipidi con

PROTEINE IDROFILICHE (APOLIPOPROTEINE), mediata da forze non covalenti.

L’assenza di legami covalenti consente lo scambio dei costituenti lipidici e proteici fra le varie lipoproteine e fra lipoproteine e membrane cellulari.

Le principali lipoproteine del plasma hanno struttura GLOBULARE nella quale apoproteine, fosfolipidi e colesterolo formano un involucro di spessore molecolare (monolayer) entro il quale sono racchiusi, segregati dall’ambiente esterno acquoso, i lipidi idrofobici: triglicerdidi e colesterolo esterificato.

APOLIPOPROTEINE: definizione e funzioniLe APOLIPOPROTEINE oltre ad essere componenti strutturali fondamentali delle lipoproteine svolgono specifiche funzioni inerenti la loro sintesi, la loro secrezione ed il loro catabolismo.Esse infatti fungono da cofattori degli enzimi adibiti al metabolismo delle LIPOPROTEINE e da strumenti di riconoscimento per i recettori delle membrane di alcune cellule.

LE LIPOPROTEINE Ciascun tipo di lipoproteina ha peso molecolare, densità,

composizione chimica e funzione specifica. Le LIPOPROTEINE possono essere considerate UNITA’ FISICHE di

TRASPORTO dei LIPIDI, infatti esse provvedono a: - trasporto dei TRIGLICERIDI (esogeni ed endogeni) ai siti di

utilizzazione e deposito. - trasporto del COLESTEROLO tra i siti di assorbimento, sintesi,

degradazione, escrezione.

STUDIO DEI COMPLESSI LIPOPROTEICI

ELETTROFORESI

Metodica di largo impiego clinico.

Tecnica che sfrutta la diversa velocità di

migrazione delle varie frazioni lipoproteiche sotto l’azione di un

campo elettrico.

ULTRACENTRIFUGAZIONE Tecnica che consente di

separare tra loro i costituenti lipoprotidici in

base alla densità. Può essere di tipo

PREPARATIVO o ANALITICO.

Nell’ambito del laboratorio è possibile effettuare la distinzione dei vari aggregati lipidici in circolo facendo ricorso a due tecniche:

STUDIO DEI COMPLESSI LIPOPROTEICI:L’ULTRACENTRIFUGAZIONE

L’ultracentrifugazione PREPARATIVA permette di frazionare i costituenti lipoprotidici grazie all’impiego di soluzioni di densità differente. In genere si usano soluzioni di densità superiore a quella della classe in esame, ma inferiore a quella delle altre.

L’ultracentrifugazione ANALITICA di SVEDBERG consente una separazione basata sulle differenti velocità di movimento o flottazione dei vari componenti lipoproteici in rapporto alla grandezza ed alla densità delle rispettive molecole e viene espressa in unità SVEDBERG.

Essa viene eseguita sottoponendo ad ultracentrifugazione un campione di siero preventivamente addizionato con del sale al fine di aumentarne la gravità specifica.

In seguito a tale procedimento si osserverà uno spostamento delle lipoproteine verso la superficie in misura proporzionale alla gravità specifica delle singole popolazioni micellari.

Ultracentrifugazione di SVEDBERG

Più grandi saranno le dimensioni della lipoproteina (e quindi il suo contenuto in lipidi) tanto minore sarà il suo peso specifico, per cui:

Le lipoproteine di maggiori dimensioni si porteranno a galla (flottazione)

mentre le lipoproteine di dimensioni inferiori sedimenteranno.

Si otterranno pertanto delle variazioni zonali di densità ottica in corrispondenza degli strati superiori del siero che possono essere valutate quantitativamente con procedura fotografica appropriata.

DISTRIBUZIONE DELLE LIPOPROTEINE

ELETTROFORESI delle LIPOPROTEINE

Si utilizza un supporto di acetato di cellulosaimbevuto di soluzione tampone elettrolitica con le estremità connesse a due elettrodi (+ e -)Si semina del siero in vicinanza del polo – (catodo) e si fa passare la corrente.Si osserverà la migrazione delle lipoproteineverso il polo + (anodo) ad una velocitàdirettamente proporzionale all’entità della carica elettrica. LDL mobilità LENTA VLDL mobilità intermedia HDL mobilità RAPIDA

Dopo aver ottenuto la migrazione si asciuga e si effettua la colorazione con SUDAN NERO (colorante specifico per i grassi)

Infine un particolare dispositivo misurerà l’intensità di colore di ogni banda.

Grazie alla lettura dell’intensità del colore di ogni banda può essere costruita una CURVA le cui CUSPIDI corrispondono ai diversi tipi di lipoproteine mentre l’altezza è in relazione

alla loro quantità.Le frazioni lipoproteiche migrano rispetto al

protidogramma in posizione α, pre- β e β - le HDL migrano come α- lipoproteine (pari al 20-40%) - le VLDL migrano come pre-β-lipoproteine (pari 10-20 %) - le LDL migrano come β-lipoproteine (pari 40-60 %) - i chilomicroni non si spostano dalla linea

di insemenzamento. Il rapporto β/pre-β si aggira normalmente

fra α

1,5 e 4,2.

HDL

VLDL

LDL

ANOMALIE del TRACCIATO ELETTROFORETICOÈ stata rilevata la presenza di particolari lipoproteine anomale: Lipoproteine β-FLOTTANTI o β LARGHE : lipoproteine con comportamento anomalo che flottano come VLDLVLDL all’ultracentrifugaultracentrifuga e migrano come LDLLDL (in posizione ββ) all’esame elettroforeticoelettroforetico. Sono state dimostrate nella DISBETA lipoproteinemia familiare (III tipo Fredrickson)

Lipoproteine Pre-β SINKING : queste lipoproteine all’esame elettroforetico elettroforetico migrano in posizione Pre- Pre-ββ ,come le VLDL VLDL (dalle quali non sono distinguibili), ma all’ultracentrifuga ultracentrifuga precipitano (da qui “sinking”) anziché portarsi in superficie. PARTE PROTEICA: Apolipoproteina B e Apolipoproteina a (ANOMALA e ad alta densità) PARTE LIPIDICA: fosfolipidi, colesterolo libero ed esterificato, scarsa quota di trigliceridi

ALTERAZIONI DELLE LIPOPROTEINESi conoscono modificazioni quantitative quantitative delle lipoproteine,

con AUMENTO o DIMINUZIONE della loro concentrazione nel sangue denominate rispettivamente:

IPER lipoproteinemie e

IPO lipoproteinemie.

Dal punto di vista eziologicoeziologico, le alterazioni delle lipoproteine vengono divise in due gruppi: - GENETICHEGENETICHE, dette anche primarie o familiari - SECONDARIESECONDARIE a vari stati patologici

Le IPERLIPOPROTEINEMIE

CLASSIFICAZIONE

Il primo sforzo di classificazione delle IPERLIPIDEMIE primitive si deve a FREDRICKSON e Coll. che le inquadrarono in seisei fenotipi fondamentali.

Va tuttavia notato che tale classificazione ha valore limitato ai fini di un inquadramento eziologico.

Di 6 fenotipi individuati Uno è caratterizzato dall’aumento serico di colesterolo (II) Due sono caratterizzati dall’aumento contemporaneo di

colesterolo e trigliceridi (IIb e III) Tre sono caratterizzati dall’aumento serico di trigliceridi (I,

IV,V)

ASPETTO del SIERO

Ciascun tipo di iperlipidemia è caratterizzata da un particolare e specifico aspetto del siero.

Il siero, infatti, può presentarsi limpido, opalescente, torbido, o nei casi di grave elevazione del contenuto delle lipoproteine ricche in trigliceridi, addirittura lattescente.

Nelle iperlipidemie di tipo I e V il siero lasciato a riposo per 24 ore ad una temperatura di 0-4° presenta uno strato cremoso superficiale dovuto all’affioramento dei chilomicroni

(refrigerator test).

Siero normale

Siero normale

IPERLIPIDEMIA di TIPO IIPERCHILOMICRONEMIA FAMILIARE

Deficit metabolico: insufficiente capacità di smaltire chilomicroni Deficit ereditario: diminuzione o assenza di Lipasi Lipoproteica (enzima che idrolizza i trigliceridi dei chilomicroni e delle VLDL, localizzato

nelle cellule endoteliali dei capillari di tessuto adiposo e muscolare

striato.)

Deficit di APOLIPOPROTEINA C II. Diagnosi: alterazione gene lipasi proteica ( cromosoma 8p22) Valori plasmatici: forte accumulo di CHILOMICRONI (anche a digiuno)

forte aumento TRIGLICERIDI LDL normali Segni e sintomi: epatosplenomegalia (assunzione reticolo-endoteliale di micelle)

crisi dolorose addominali (distensione capsula glissoniana, pancreatite)

xantomi cutanei eruttivi retinopatia (lipemia retinalis)

Terapia: assunzione lipidica giornaliera inferiore ai 20 gr La malattia allo stato omozigote non si associa ad aterosclerosi

precoce

IPERLIPIDEMIE di TIPO II a

Il fenotipo II a può essere dovuto a tre diverse malattie metaboliche: IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE MONOGENICA (5%)

Autosomiche

dominantiIPERLIPIDEMIA FAMILARE A FENOTIPI MULTIPLI (15%)

IPER COLESTEROLEMIA POLIGENICA (80%) solo in parte geneticamente

determinata

IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE (fenotipo II a) Trasmissione: Autosomica Dominante Difetto molecolare: Assenza, diminuzione o difetto dei recettori ad alta affinità per le LDL Gene: cromosoma 19 ( gene recettore LDL ) Valori plasmatici: elevati livelli di LDL e di COLESTEROLO (eterozigoti 350-550 mg/dl ; omozigoti :650-1000 mg/dl )

Segni e sintomi: deposizione colesterolo nella CORNEA ateromi e xantomi

Diagnosi: ipercolesterolemia stabile dall’infanzia comparsa precoce di xantomi valutazione laboratoristica numero dei recettori per LDL (colture fibroblasti cutanei) Terapia: inibitori della HMG-CoA reduttasi (levostatina, compactina…)

resine (legano acidi biliari e ne favoriscono eliminazione fecale)

Patologia strettamente associata ad aterosclerosi precoce

Gene codificante per il recettore delle LDL Sono state individuate più di 620 mutazioni a carico

di questo gene, che possono essere suddivise in 5 gruppiMutazioni Alterazioni recettoriali Difetto

Classe I Mancata sintesi dei recettori SINTESI

Classe II Accumulo dei recettori mutati nel R.E. per impossibilità di trasporto nell’apparato di Golgi

TRASPORTO

Classe III Alterazione del dominio recettoriale preposto all’interazione con le LDL

BINDING

Classe IV Alterata localizzazione dei recettori sulla superficie cellulare

CLUSTERING

Classe V Impossibilità alla dissociazione dei recettori dopo internalizzazione del complesso

RECYCLING

Recettore LDL

IPERLIPIDEMIE di TIPO II bIPERLIPIDEMIA combinata familiare

Trasmissione: autosomica dominante ad alta penetranza

Difetto: elevata sintesi di APOB-100

Valori plasmatici: alti livelli di LDL e VLDL

Diagnosi: iper lipidemie nei consanguinei

Associata a: OBESITA’, ridotta tolleranza al glucosio, diabete mellito,

ipertensione arteriosa e iperuricemia.

IPERLIPIDEMIE di TIPO IIIDISBETALIPOPROTEINEMIA familiare

Trasmissione: sia recessiva che dominante Difetto molecolare: forma mutata di APO-E (apoE2) ridotta affinità delle VLDL per i recettori epatici Valori plasmatici: elevati livelli di COLESTEROLO e TRIGLICERIDI Segni e sintomi: xantomatosi palmare xantomi tubero-eruttivi al gomito

Marker diagnostico: presenza di β-VLDL e comparsa nel tracciato elettroforetico di una grossa banda migrante nella zona della lipoproteina β

Terapia: Acido nicotinico e fibrati inibitori dell’HMG-CoA regime dietetico ipolipidico

Tracciato normale

IPERLIPIDEMIE di TIPO IVIPERTRIGLICERIDEMIA familiare

Valori plasmatici: aumentati livelli di pre-β lipoproteine (VLDL) e dei

trigliceridi endogeni Può essere conseguenza di IPERLIPIDEMIA FAMILIARE a FENOTIPI

MULTIPLI o di IPERTRIGLICERIDEMIA familiare

Tale patologia è strettamente associata alla malattia coronarica, a causa della presenza della lipoproteina “sinking-pre- β” o LIPOPROTEINA a.LIPOPROTEINA a.

Si tratta di una APOPROTEINA probabilmente sintetizzata dal fegato, considerata una varietà genetica delle lipoproteine con mobilità pre- β.

Mostra un alto grado di omologia con il PLASMINOGENO, precursore della plasmina, che consente a tale proteina di inibirne competitivamente i relativi enzimi attivatori( t-PA e u-PA), riducendo la risposta fibrinolitica.

Valori superiori a 25-30 mg/dl rappresentano un fattore di rischio aggiuntivo per l’aterosclerosi

IPERLIPIDEMIE di TIPO IV IPERLIPIDEMIA MISTA

Trasmissione: autosomica dominante Valori plasmatici: elevati livelli di CHILOMICRONI (trigliceridi

esogeni)

e VLDL (trigliceridi endogeni)

Segni e sintomi: epatosplenomegalia crisi dolorose addominali pancreatite ad alto grado di mortalità xantomi eruttivi Siero: strato cremoso di trigliceridi

Associata a: OBESITA’, ridotta tolleranza al glucosio, iperuricemia.

Essendo le iperlipoproteinemie malattie del metabolismo lipidico che si manifestano con un patologico aumento delle concentrazioni delle varie lipoproteine plasmatiche le CONSEGUENZE CLINICHE varieranno in rapporto al tipo di errore metabolico e al complesso lipidico eccedente in circolo. Le più comuni conseguenze sono rappresentate da:

PANCREATITE ACUTA : aumento di CHILOMICRONI

XANTOMI TENDINEI: accumulo di COLESTEROLO nella profondità dei tendini con reazione fibrosa. I tendini colpiti con maggiore frequenza sono il tendine d’Achille e i tendini sovrastanti le nocche delle dita, ma si può osservare anche una infiltrazione in sede sotto periostea ( tendine patellare)

XANTOMI ERUTTIVI: accumulo di trigliceridi che causa la formazione di papule rilevate con centro giallastro ed alone eritematoso localizzate nei punti di appoggio della superficie corporea.

ATEROSCLEROSI: deposizione di lipidi nel contesto dell’intima dei vasi sanguigni.

CONSEGUENZE CLINICHE

ATEROSCLEROSI Formazione di PLACCHE ATEROMATOSE

nell’intima delle arterie che comporta ispessimento della parete del vaso e a perdita di elasticità. Le sedi maggiormente colpite sono le grosse arterie elastiche (AORTA, CAROTIDI, arterie MUSCOLARI, CORONARIE) in corrispondenza

spesso delle biforcazioni (flusso turbolento). L’ATEROSCLEROSI CORONARICA condiziona lo sviluppo di cardiopatia

ischemica, a causa del regime ipossico che viene ad instaurarsi in seguito al ridotto flusso ematico nei vasi aterosclerotici.

EZIOLOGIA : malattia multi fattoriale riconducibile all’azione combinata di più geni e fattori ambientali e di rischio.

FATTORI di RISCHIO

Non Controllabili Controllabili

EtàSesso

Predisposizione genetica

IpertensioneDiabete

IperlipidemiaFumo

Lipoproteine e aterosclerosi

Per quanto riguarda il rapporto di

connessione lipidi nelplasma/rischio di eventi

coronaricile lipoproteine vengono distinte in tre categorie

ATEROGENICHE

Remnants chilomicroniRemnants VLDLILDLLDLLipoproteina a

ANTIATEROGENICHE HDL

NON ATEROGENICHE CHILOMICRONIVLDL

Particolare rilevanza nell’induzione dell’aterosclerosi èattribuita alle lipoproteine, poiché numerosi studi prospettici hannomesso in relazione elevati livelli dei lipidici plasmatici e rischio dieventi coronarici.

Valori limite

(mg/dl)

Valori ad alto rischio (mg/dl)

Colesterolo

HDL

LDL

Trigliceridi

200 – 239

35 – 45

130 – 159

150 – 200

> 240

< 35

> 160

> 200

È pertanto indispensabile mantenere i valori dei diversi costituenti lipidici entro range

prestabiliti

I faseI fase: Lesione potenzialmente reversibile, costituita da un accumulo SOTTOINTIMALE di macrofagi carichi di lipidi (cellule schiumose)

che determinano la formazione di STRIE LIPIDICHE.II faseII fase: lesione IRREVERSIBILE destinata ad una evoluzione che conduce alla formazione della placca aterosclerotica

Notevole importanza rivestono le eventuali complicanze relative alla rottura della placca (microemorragie) e alla formazione di EMBOLI in seguito al distacco di formazioni trombotiche.

PATOGENESINella patogenesi dell’aterosclerosi vanno distinte 2 fasi:

ROTTURA della PLACCAROTTURA della PLACCAPer cause emodinamiche o per l’ attività litica dei macrofagi la capsula che delimita il core lipidico può fissurarsi ed esporre al sangue materiale fortemente trombogenico. Questo causa la rapida formazione di un aggregato piastrinico, e la deposizione di fibrina che, in ultima istanza, può portare ad una occlusione rapida del vaso.

FASI INIZIALI del danno FASI INIZIALI del danno ATEROSCLEROTICOATEROSCLEROTICO

Le cellule endoteliali attivate da stimolidiversi, come LDL ossidate o modificate,esprimono sulla loro superficie molecole

diadesione per i monociti.Queste aderiscono alla parete, si

infiltranonel sottoendotelio e fagocitano le LDLmodificate diventando cellule schiumose.I monociti liberano fattori di crescita e di richiamo per cellule muscolari lisce.Parte del colesterolo vienetrasportato fuori dalle cellulee legato alle HDL che provvedono a riportarlo nel citoplasma.

PLACCA ATEROSCLEROTICA PLACCA ATEROSCLEROTICA avanzataavanzata

Presenza di un CORE LIPIDICOformato da cellule schiumosemorte e lisate, depositi di grasso emateriale fibroso. Il core risultadelimitato da una capsula formata

damateriale fibroso (prodotto dallecellule muscolari lisce che hannointernalizzato le OxLDL)e da cellule muscolari lisce che

possono anch’esse essere cariche di lipidi.