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IL SEQUENZIAMENTO DEL DNAdi F. Luca
Obiettivo: ottenere la sequenza nucleotidica di un frammento di DNA.
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IL METODO DI SANGER
E’ alla base degli attuali metodi di sequenziamento automatizzato.
Si basa sulla sintesi di copie del DNA stampo che differiscono in lunghezza per un solo nucleotide.
I frammenti di DNA così ottenuti sono visualizzati mediante elettroforesi
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INGREDIENTI
1. DNA stampo
2. Oligonucleotide complementare (PRIMER)
3. Taq Polimerasi
4. Deossinucleotidi (dNTP)
5. Dideossinucleotidi (ddNTP)
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1. DNA stampo
Il DNA stampo è solitamente presente in più copie.
Esso è solitamente prodotto con una reazione di PCR a partire da piccole quantità.
Ha una lunghezza di circa 400-1000 paia di basi
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2. Oligonucleotide complementare (PRIMER)Nella reazione di sequenza, a differenza della PCR, si utilizza un solo primer.
Per ogni reazione si ottiene la sequenza di un solo filamento di DNA.
Il primer è un oligonucleotide
complementare alla regione a monte della sequenza che si vuole
ottenere.
Per sequenziare un frammento di DNA
bisogna conoscere la sequenza delle regioni
fiancheggianti
PrimerDNA stampo
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3. Taq polimerasi
Come in una normale PCR, la Taq Polimerasi è l’enzima che catalizza l’inserimento dei dNTP nella
catena in formazione
Esistono diversi tipi di Taq Polimerasi.
Alcune possono produrre degli errori nell’inserimento dei dNTP
Nelle reazioni di sequenza si preferisce utilizzare quelle più fedeli allo stampo o quelle capaci di
correggere i propri errori
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4. Deossinucleotidi (dNTP)
I dNTP e i ddNTP (presenti in piccole quantità) sono in competizione per l’incorporazione nella catena in
crescita. Questa competizione permette di ottenere reazioni parziali.
LA TERMINAZIONE DELLA CATENA AVVIENE A CASO IN FUNZIONE DI QUANDO VIENE
INCORPORATO IL ddNTP
Figura tratta da Strachan & Read, 2001
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5. Dideossinucleotidi (ddNTP)
Sono analoghi dei deossinucleotidi ma mancano del gruppo 3’-OH
Una volta incorporati in una catena in crescita ne bloccano l’allungamento
OH
dCTP
H
ddCTP
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DNA STAMPO A SINGOLO FILAMENTO, OLIGONUCLEOTIDE COMPLEMENTARE (PRIMER), TAQ POLIMERASI,
DEOSSINUCLEOTIDI (dNTP)
ddATP ddTTPddCTP ddGTP+
COME SI PREPARA LA REAZIONE DI SEQUENZA
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COME AVVIENE LA REAZIONE DI SEQUENZA
Figure tratte da Strachan & Read, 2001
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ELETTROFORESI E LETTURA DELLA SEQUENZA
Esempio di risultato ottenuto in laboratorio: sequenza del gene
della neurofibromatosi di tipo II
Figure tratte da Strachan & Read, 2001
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IL SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO
Si utilizzano ddNTP marcati con molecole fluorescenti e si prepara un’unica reazione
Durante l’elettroforesi, un monitor individua e registra il segnale fluorescente man mano che il DNA passa attraverso un determinato
punto del gel.
Figura tratta da Strachan & Read, 2001
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Il tracciato che si ottiene prende il nome di ELETTROFEROGRAMMA
Ogni picco rappresenta un nucleotide.