Il sequenziamento genico

Struttura del DNA

• Doppia elica formata da due filamenti di ac. nucleico uniti da ponti ad idrogeno

• Ac. nucleico: catena di nucleotidi

• Nucleotide: nucleoside + ac. fosforico

• Nucleoside: desossiribosio + base azotata

• Basi azotate: adenina, citosina, guanina e timina

Le basi azotate

• Unico elemento variabile all’interno dell’ac. nucleico

• Sequenziamento: individuazione della successione delle basi azotate nel filamento di ac. nucleico

Le basi azotate

• Complementarità fra i due filamenti:• A-T• G-C

• 5’-3’: forward

• 3’-5’: reverse

Sintesi del DNA

Prima del sequenziamento

• Scelta del bersaglio• Presente in tutti gli organismi• Conservato ma contenente regioni variabili• Disponibilità di un database contenente le sequenze con

cui si vuol confrontare il bersaglio

• Scelta dei primer

• Estrazione del DNA dalle cellule

Le fasi del sequenziamento

• Amplificazione del bersaglio

• Verifica dell’amplificato

• Purificazione

• Verifica

• PCR di sequenziamento

• Purificazione dell’amplificato

Miscela di sequenziamento

• Primer• Due amplificazioni parallele usando in ciascuna un solo

primer (per i filamento forward o reverse)

• Tampone

• Polimerasi

• Nucleotidi

• Nucleotidi terminator

Nucleotidi terminator

• Nucleotide (A) che blocca l’allungamento del filamento di ac. nucleico poiché la mancanza del gruppo ossidrile in 3’ impedisce l’attacco all’ac. fosforico del nucleotide successivo

PCR di sequenziamento (metodo manuale)

• Si esegue in quattro provette diverse• Tutte e quattro le provette contengono: polimerasi, nucleotidi normali e primer• Ciascuna delle quattro provette contiene inoltre un diverso tipo di nucleotide

terminator (adenina-terminator, guanina-terminator, . . .)• Annealing del primer• Allungamento del primer:

• Legame di un nucleotide normale: l’allungamento prosegue• Legame di un nucleotide terminator: l’allungamento si blocca

• In ciascuna delle 4 provette contenente nucleotidi terminator con una diversa base azotata si formano soltanto filamenti che terminano con tale base. Tali filamenti avranno tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia legato alla 1°, 2°, . . , ennesima, posizione possibile

Il principio del sequenziamento (metodo manuale)

• Si esegue una elettroforesi disponendo i prodotti di amplificazione delle 4 provette in 4 corsie parallele così che in ognuna di esse siano presenti filamenti che terminano con una diversa base

• Si usa un gel ad altissima risoluzione, capace di separare frammenti di DNA che differiscono fra loro per un solo nucleotide. Il gel (0,3-0,4 mm di spessore) è interposto fra due lastre di vetro di notevole lunghezza (40 cm circa ).

Il principio del sequenziamento (metodo manuale)

• La migrazione è inversamente proporzionale alla lunghezza del filamento

• La posizione della banda indica la posizione occupata all’interno della sequenza, mentre il tipo di base è indicato dalla corsia in cui tale banda si trova A T A C A G C T G T T . . . . . .

Nucleotidi terminator marcati(metodo automatico)

• I nucleotidi terminator sono marcati con un fluorocromo

• Si usa un fluorocromo diverso per ciascuno dei quattro tipi di terminator

PCR di sequenziamento (metodo automatico)

• Si esegue in una singola provetta• Tutte le provette contengono: polimerasi, nucleotidi normali,

nucleotidi terminator e primer• I nucleotidi terminator sono marcati con fluorocromi • Annealing del primer• Allungamento del primer:

• Legame di un nucleotide normale: l’allungamento prosegue• Legame di un nucleotide terminator: l’allungamento si blocca

• Nella provetta si formano contemporaneamente filamenti che avranno tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia legato alla 1°, 2°, . . , ennesima, posizione della sequenza. Si avranno quindi contemporaneamente filamenti terminanti con ciascuna delle quattro basi

Il prodotto della PCR (sequenziamento automatico)

• Se il bersaglio è composto da n nucleotidi si avranno filamenti di tutte le lunghezze possibili, da 1 ad n

• Indipendentemente dalla lunghezza, tutti i filamenti terminanti con adenina emetteranno fluorescenza di tipo A ; quelli terminanti con citosina, di tipo B; quelli terminanti con guanina, di tipo C, e quelli terminanti con timina, di tipo D

Il sequenziatore automatico

• E’ un apparecchio che, dopo aver prelevato il prodotto della PCR di sequenziamento, lo sottopone ad elettroforesi all’interno di un capillare

• Un raggio laser colpisce il capillare eccitando la fluorescenza dei fluorocromi che lo attraversano

• Un cellula fotoelettrica rileva i segnali fluorescenti che vengono memorizzati

L’elettroferogramma • Durante l’attraversamento del capillare i vari spezzoni di DNA vengono colpiti da un raggio laser• Il raggio laser eccita i vari fluorocromi che marcano i singoli spezzoni• Ciascuno dei quattro fluorocromi emette una diversa lunghezza d’onda • Una cellula fotoelettrica rileva sequenza, tipo ed intensità delle varie emissioni luminose ed il tutto viene

registrato in forma grafica• La sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi; il tipo (colore del picco) corrisponde al

tipo di base azotata mentre l’intensità (altezza del picco) è irrilevante

L’elettroferogramma • Normalmente il sistema interpreta automaticamente

l’elettroferogramma• Quando l’interpretazione non è ovvia, il sistema inserisce una N al

posto della base azotata mancante, questa può essere corretta manualmente, dopo aver letto ad occhio l’elettroferogramma, o in base alla sequenza del filamento reverse

G

Il sequenziamento in microbiologia

• Identificazione • Sequenziamento di regioni specie-specifiche

• Antibiogramma• Sequenziamento di regioni in cui possono aversi mutazioni

associate alla resistenza ai farmaci

• Filogenesi• Confronto della sequenza della medesima regione in specie diverse,

per ricostruirne la storia evolutiva

Identificazione mediante sequenziamento

• Scelta della regione da sequenziare• 16S rDNA• Internal transcribed spacer• 23S rDNA• hsp65• rpoB

• Sequenziamento • Confronto della sequenza con quelle presenti in un

database

GenBank

• Banca dati pubblica (in Internet) contenente circa 50 milioni di sequenze geniche delle più varie regioni di, praticamente, tutti gli organismi viventi

• Chiunque può depositare (ovviamente non in maniera anonima) sequenze in GenBank

• E’ possibile confrontare la propria sequenza con tutte quelle presenti in GenBank

• Un motore di ricerca individua e restituisce le sequenze presenti in GenBank che hanno il più elevato grado di somiglianza con la sequenza in esame

GenBank BLAST

GenBank BLAST

GenBank, risultati

GenBank, risultati

GenBank, risultati

Interpretazione

• Identità 100% con una specie nota• Identità 100% con una sequenza non appartenente a specie

conosciute• Identità <100% con una specie nota (il significato varia a

seconda della regione in esame)• Verifica delle discordanze

• Correzione della sequenza (identità 100%)

• Nuovo sequevar

• Nuova specie

Antibiogramma mediante sequenziamento

• Scelta della regione da sequenziare• rpoB• katG• embB• pncA

• Sequenziamento

• Confronto con la sequenza wild type

Interpretazione

• Confronto con la sequenza wild type• Identità 100% = sensibilità• Mutazioni = resistenza

• Conferma con l’antibiogramma fenotipico

Allineamento delle sequenze

Allineamento delle sequenze

Le mutazioni

• Principali mutazioni• Inserzione• Delezione• Sostituzione

• Conservativa• Non conservativa

• Mutazioni: errori della natura?• La selezione naturale premia le mutazioni favorevoli e

elimina quelle sfavorevoli• Regioni genetiche più o meno tolleranti

Mutazioni e filogenesi

• Evoluzione da un organismo ancestrale• Sviluppo di nuovi organismi per effetto di mutazioni e

selezione naturale• Il numero, il tipo e la posizione delle mutazioni comparse,

in regioni conservate, durante l’evoluzione costituiscono il metro con cui è possibile misurare le distanze filogenetiche

• Numero di mutazioni tanto più elevato quanto più remoto è il progenitore ancestrale

• Organismi con mutazioni concatenate appartengono allo stesso phylum

Regioni di studio

• Ideale: l’intero genoma

• Compromesso accettabile:16S rRNA• Sequenziamento • Multiallineamento• Costruzione dell’albero filogenetico

L’albero filogenetico

2 mutazioni

5 mutazioni

5 mutazioni

7 mutazioni

4 mutazioni

4 mutazioni

L’albero filogenetico

2 mutazioni

5 mutazioni

5 mutazioni

7 mutazioni

4 mutazioni

4 mutazioni

• Non sempre, alberi basati su sequenze di regioni diverse, sono compatibili

• Non sempre alberi basati sulle stesse sequenze, ma costruiti con algoritmi diversi, sono sovrapponibili

L’albero filogenetico, limiti

Conclusioni

• L’uso del sequenziamento per l’identificazione e l’antibiogramma è particolarmente vantaggioso con:• Organismi a crescita lenta• Organismi difficilmente coltivabili• Organismi non coltivabili• Organismi morti (paleomicrobiologia)

• Per l’identificazione il sequenziamento è il metodo di riferimento; NON lo è per l’antibiogramma

• Il sequenziamento è una metodica:• Rapida• Automatizzata• Economica