TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE: Isolamento di Geni ed ... Isolamento genico (25).pdf ·...
25
TECNICHE DI BIOLOGIA TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE: MOLECOLARE: Isolamento di Geni ed Analisi Isolamento di Geni ed Analisi dell dell’ espressione genica espressione genica c o r s formazione GenHORT
Transcript of TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE: Isolamento di Geni ed ... Isolamento genico (25).pdf ·...
TECNICHE DI BIOLOGIATECNICHE DI BIOLOGIAMOLECOLARE:MOLECOLARE:
Isolamento di Geni ed AnalisiIsolamento di Geni ed Analisidelldell’’espressione genicaespressione genica
c o r sformazione GenHORT
c o r sformazione GenHORT
c o r sformazione GenHORT
c o r sformazione GenHORT
GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSIGENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI
c o r sformazione GenHORT
stress vs controlloSensibile vs tollerante
Materiale di partenza: quesito biologico
differenti tissuti
differenti Stadi di sviluppo
Confrontare il pattern di espressione di :
tessuti, stadi di sviluppo e molti altri confronti!!
Confrontare il corredo genico di differenti specie, varietà,
c o r sformazione GenHORT
TECNICHE DI ISOLAMENTO E ANALISI DIGENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI
Differential Differential ScreeningScreening
RT-PCR
Subtractive Screening•SSH
Differential Display•DDRT-PCR•AFLP-cDNA
Microarray• cDNA• OligoArray
and MANY OTHERs (SAGE, MPSS, mRNA-SEQ, etc.)
• RT-PCR• qRT-PCR
c o r sformazione GenHORT
STRESS
ISOLAMENTO/IDENTIFICAZIONE DI GENI CANDIDATI e/oANALISI DELL’ ESPRESSIONE GENICA/TRASCRITTOMICA
RNA RNA
cDNA cDNA
Diretti
• Northern analysis• RT-PCR/qRT-PCR
•Subtractive hybridazation•In situ hybridazation
RNAfingerprinting
• DDRT-PCR
• cDNA-AFLP
•Strategie EST•SAGE (Serial analysis gene expression)
•MPSS (massively parallel signature sequencing)
•mRNA-SEQ
Indiretti
•Oligo-Chips•cDNA microarray
METODI DIANALISI
c o r sformazione GenHORT
RNA extraction
PROCEDURA GENERALE
c o r sformazione GenHORT
Ligation adapters
Gel acrilamide
DDRT-PCR cDNA-AFLP
AAAAAn AAAAAnmRNA ototal RNADNA free
mRNA ototal RNADNA free
TTTTnAAAAnNNNNNNN
1 cycle PCR
TTTTnAAAAnNNNNNNN
PCR amplification
Oligo dT+N+
arbitrarily primer
TTTTnAAAAn
Digestion
2 enzimi di restrizione
N
N
Preamplification
2 primer+N
TTTTnAAAAn
cDNA synthesis cDNA synthesis
TTTTnAAAAnOligo dT+N DNA polymerase I
NNN
NNN
Selective amplification
2 primer+NNN
c o r sformazione GenHORT
c o r sformazione GenHORT
Gel acrilamide •Dry•Esposizione su lastra autoradiografica/ scanning fluorescenza•Sviluppo/analisi
Control Test
c o r sformazione GenHORT
458
587
540
504
234
bp
DDRT-PCR cDNA-AFLP 3 basi selettive 2 basi selettive
c o r sformazione GenHORT
•PCR II round-stessi primer pcr I round-no radioattivo / fluorescenza-stesse condizioni pcr
•Corsa su gel agarosio / purificazione
Sequenziamento Analisi Northern
Disegno primer RT-PCR
Analisi banca datiConferma espressione
differenziale
Array
•Eluizione banda
c o r sformazione GenHORT
•Bioinformatica: omologia di sequenza
•Clonaggio•Trasformazione piante•Analisi dell’espressione nelle piante trasformate•Analisi della tolleranza allo stress
•Ruolo funzionale del gene => utilizzazione dicollezioni di mutanti (inserzioni nel clone/gene)=> analisi fenotipo
c o r sformazione GenHORT
Microarray
Permettono l’analisidell’espressione genicadi migliaia di genisimultaneamente
c o r sformazione GenHORT
c o r sformazione GenHORT
Images : examples
Cy3
Cy5
repressedControl > perturbedgreen
inducedControl < perturbedred
unchangedControl = perturbedyellow
Gene expressionSignal strengthSpot colour
Pseudo-colour overlay
c o r sformazione GenHORT
c o r sformazione GenHORT
Interpretazione dei risultatii microarray sono il punto di partenza per successivi studi funzionali
• Validazione dei risultati (di tutti o di una parte ottenuti con altretecniche di laboratorio)
• Ricerca bibliografica sulle possibili implicazioni funzionali einterazioni geniche dei trascritti sregolati
• Studio delle proteine associate ai trascritti identificatidifferenzialmente espressi
c o r sformazione GenHORT
Confermationof results
In silico analysis
Laborarory- basedanalysis
Information availablein the literature andin public or privateexpression database
RT-PCRNorthern blotReal-time PCRHybridization in situ
Using same RNA of microarray esp. c o r sformazione GenHORT
RT-PCR qRT-PCR
Constitutive/housekeeping gene:• rRNA• Ef1alfa• Actin
Northern blotting
• Analisi d’espressione per singolo gene• Bisogna conoscere la sequenza di DNA
c o r sformazione GenHORT
RT-PCR
cDNA Log diluition- 30 cycles-
# of PCR cycles
0 5 10 15 20 25 30 35 40
c o r sformazione GenHORT
qRT-PCR
• Rapidità
• Sensibilità
• Specificità
• Quantitativa c o r sformazione GenHORT
c o r sformazione GenHORT
