“Il miele come bioindicatore dell’inquinamento ambientale da

idrocarburi policiclici aromatici (IPA):

studio pilota su territorio nazionale”

Fonti di IPA negli alimenti

La principale causa di contaminazione degli alimenti, eccezion fatta per alcuni

trattamenti specifici (affumicatura, cottura con fiamma diretta, etc.), è

l’inquinamento ambientale, attraverso :

1. Deposizione di particolato atmosferico

2. Assorbimento da suolo contaminato

3. Assorbimento da acque superficiali o marine contaminate

Reg. (CE) 1881/2006

Benzo[a]pirene

Reg. UE 835/2011

Ʃ 4 IPA

• Benzo[a]pirene

• Crisene

• Benzo[a]antracene

• Benzo[b]fluorantene

Benzo[a]pirene

Il miele: bioindicatore dell’inquinamento

ambientale?

Nel biomonitoraggio, è stata valutata la

possibilità di impiegare i prodotti

dell’alveare, in particolar modo il miele,

come indicatore biologico

Un alveare è un potenziale rivelatore

naturale di contaminanti che l’ape

raccoglie dal territorio circostante

Scopo della ricerca

L’attività di ricerca svolta ha avuto come finalità:

1. verificare la capacità della matrice miele a svolgere il ruolo di

bioindicatore dell’inquinamento ambientale da IPA. Allo scopo sono stati

analizzati campioni di miele raccolti sull’intero territorio nazionale

• Antracene

• Pirene

• Benzo[a]Antracene

• Crisene

• Benzo[b]Fluorantene

• Benzo[k]Fluorantene

• Benzo[a]Pirene

• Dibenzo[a,h]Antracene

• Indeno[1,2,3-c,d]Pirene

3. sviluppare e validare una procedura analitica per la determinazione

qualitativa e quantitativa di 9 IPA nella matrice miele

capace di raggiungere maggiore sensibilità, migliore affidabilità e

praticabilità rispetto ai metodi esistenti

2. Contemporaneamente verificare la sicurezza d’uso del miele di

produzione nazionale

Analisi in HPLC-FLD

Risospensione residuo in

CH3CN

Filtrazione dell’estratto

Estrazione con DICLOROMETANO

Matrice miele

Sviluppo di un metodo analitico per la

determinazione degli IPA nel miele

Principio del metodo estrazione liquido-liquido con solvente

Procedimento

Cicli di sonicazione

Evaporazione del solvente

Condizioni strumentali HPLC-FLD

MINUTI FLUSSO CH3CN (A%) H2O (B%)

0 1.5 mL/min 50% 50%

7 1.5 mL/min 50% 50%

20 1.5 mL/min 80% 20%

25 1.5 mL/min 80% 20%

30 1.5 mL/min 95% 5%

35 1.5 mL/min 50% 50%

- eluizione in gradiente binario

- flusso FM 1,5 mL/min

- tempo di corsa 35 min

- colonna C18, 5 µm, 250 x 4,6 mm ID

- cambio delle λeccitazione/emissione

240-398 nm

300-486 nm

Validazione e rendimento del metodo

Il protocollo di validazione ha fornito le informazioni sulle

grandezze caratteristiche che definiscono le prestazioni

di un metodo

I parametri tecnici di validazione considerati:

Linearità

Recupero

Ripetibilità stretta

Ripetibilità intermedia

Limite di rivelabilità LOD

Limite di quantificazione LOQ

Curve di calibrazione

Le curve di calibrazione sono state costruite utilizzando cinque livelli di

concentrazione:

LINEARITA’ NELL’INTERVALLO

DI CONCENTRAZIONE

ESAMINATO

0,0 µg/kg

0,5 µg/kg

1,0 µg/kg

1,5 µg/kg

2,0 µg/kg

9 campioni di bianco

36 aliquote 9 campioni fortificati con mix IPA 100 µg/kg

9 campioni fortificati con mix IPA 150 µg/kg

9 campioni fortificati con mix IPA 50 µg/kg

9 campioni fortificati con mix IPA 200 µg/kg

IPA Eq. Retta di taratura R²

Antracene у = 217000х + 57854 0,9685

Pirene у = 290218х + 83338 0,9967

Benzo (a) Antracene у = 448598x - 3648 0,9629

Crisene у = 165042х + 9114 0,9832

Benzo (b) Fluorantene у = 774147х + 21875 0,9799

Benzo (k) Fluorantene у = 2506419х + 55836 0,9779

Benzo (a) Pirene у = 269607х + 3230 0,9826

DiBenzo (a,h) Antracene у = 356873х - 3986 0,9795

Indeno(1,2,3-c,d)Pirene у = 167457х - 1830 0,9640

Matrice artificiale di

miele

Metodo STD ESTERNO

ACCURATEZZA: Metodo dei recuperi

% r = area media misurata /

area media livello di fortificazione x 100

PRECISIONE: Calcolo della ripetibilità espressa in

RDS%= scarto tipo di ripetibilità /

media delle concentrazioni x 100

LOD – LOQ Calcolo rapporto segnale/rumore

Soddisfano quanto previsto dalla

normativa comunitaria

77 campioni

di miele

Applicazione del metodo a campioni di miele

Aree geografiche

differenti Tipologie areali

differenti

Concentrazione

Antracene

(µg/kg)

Concentrazione

Pirene

(µg/kg)

Concentrazione

Benzo (A) Antracene

(µg/kg)

Concentrazione

Crisene

(µg/kg)

Concentrazione

Benzo (B) Fluorantene

(µg/kg)

Concentrazione

Benzo (K) Fluorantene

(µg/kg)

Concentrazione

Benzo (A) Pirene

(µg/kg)

Concentrazione

DiBenzo (a,h)

Antracene

(µg/kg)

Concentrazione

Indeno (1,2,3-c,d)

Pirene

(µg/kg)

MEDIA 0,17 0,26 0,18 0,40 < LOD < LOD 0,01 0,01 0,09

MEDIANA 0,07 0,12 0,09 0,08 < LOD < LOD < LOD < LOD 0,02

MIN < LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD

MAX 1,35 4,44 2,15 19,71 0,07 0,00 0,10 0,19 0,98

75° PERCENTILE 0,18 0,25 0,13 <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD 0,16

Analisi statistica

Le differenze sono

statisticamente significative:

test post hoc di Fisher (LSD)

L’F calcolato

è superiore

all’ F critico?

Analisi della varianza ad un fattore (ANOVA)

SI NO Le differenze

non sono statisticamente

significative

Individuazione dei sottogruppi

che confermano il test ANOVA

Tale indagine prende in esame i

seguenti fattori:

Ʃ 9 IPA

Ʃ 4 IPA

BaP/(BaP+ Chr)

BaA/(BaA+Chr)

0,07-0,24 ≈ 0,49 ≈ 0,73

< 0,2 0,2-0,35 > 0,35

Differenze tra:

1. Diverse provenienze regionali dei

campioni di miele

2. Diversi habitat di provenienza

3. Differenze tra campioni di miele

aggregati nei gruppi

Risultati dell’ analisi statistica tra le diverse

provenienze regionali del miele

ANALISI

VARIANZA BaP/(BaP+CHR)

Origine della

variazione SQ gdl MQ F

Valore di

significatività F crit

Tra gruppi 0,181053 5 0,0362 2,957750 0,057452456 1,740340

In gruppi 0,146911 12 0,0122

Totale 0,327964 17

BaP/(BaP+CHR) (Mean) CAMPANIA PIEMONTE

EMILIA

ROMAGNA LIGURIA LOMBARDIA LAZIO

CAMPANIA 0,0016712 ---- 0,2415241 0,278888 0,27888797 0,209165976 0,2160257

PIEMONTE 0,1797456 no ---- 0,2415241 0,24152407 0,155903114 0,1649923

EMILIA ROMAGNA 0,2972973 yes no ---- 0,27888797 0,209165976 0,2160257

LIGURIA 0,2972973 yes no no ---- 0,209165976 0,2160257

LOMBARDIA 0,3564985 yes yes no no ---- 0,1124233

LAZIO 0,3958009 yes yes no no no ----

Differenze statisticamente significative per il rapporto BaP/(BaP+CHR)

coinvolgono le regioni Campania e Piemonte.

Bassi valori dei rapporti BaP/(BaP+ CHR) per la Campania e Piemonte

Riconducibili a combustioni di biomasse

Differenze significative

Alti rapporti BaP/(BaP+CHR) per Lombardia e Lazio. Riconducibili a traffico

veicolare

Risultati dell’ analisi statistica tra i

diversi habitat di provenienza del miele

ANALISI

VARIANZA Ʃ 9 IPA pianura

Origine della

variazione SQ gdl MQ F

Valore di

significatività F crit

Tra gruppi 631,003776 9 70,111531 76,52035 5,33749E-15 1,51902

In gruppi 21,0736778 23 0,9162469

Totale 652,077454 32

∑ 9 IPA pianura (Mean) LIGURIA MARCHE SARDEGNA LOMBARDIA

EMILIA

ROMAGNA LAZIO PIEMONTE PUGLIA VENETO CAMPANIA

LIGURIA 0,2187139 ---- 2,3200618 2,3200618 1,7971121 2,00923241 1,70751 2,32006175 1,7538018 2,0092324 2,32006175

MARCHE 0,3941546 no ---- 2,3200618 1,7971121 2,00923241 1,70751 2,32006175 1,7538018 2,0092324 2,32006175

SARDEGNA 0,5017901 no no ---- 1,7971121 2,00923241 1,70751 2,32006175 1,7538018 2,0092324 2,32006175

LOMBARDIA 0,5557946 no no no ---- 1,37256704 0,87323 1,797112104 0,9605968 1,372567 1,797112104

EMILIA

ROMAGNA 0,5731205 no no no no ---- 1,25297 2,009232414 1,3153514 1,6405314 2,009232414

LAZIO 0,7925669 no no no no no ---- 1,707519215 0,7802283 1,2529766 1,707519215

PIEMONTE 1,0145109 no no no no no no ---- 1,7538018 2,0092324 2,32006175

PUGLIA 1,322936 no no no no no no no ---- 1,3153514 1,753801834

VENETO 1,4830347 no no no no no no no no ---- 2,009232414

CAMPANIA 26,30212 yes yes yes yes yes yes yes yes yes ----

Differenze statisticamente significative tra le diverse provenienze regionali dei campioni di miele nell’ambito dello stesso habitat sono riscontrate nel miele di pianura:

Ʃ 9 IPA Ʃ 4 IPA

Concentrazioni di IPA statisticamente più

elevate per la regione Campania

∑ 4 IPA pianura (Mean) MARCHE

EMILIA

ROMAGNA VENETO LAZIO LOMBARDIA SARDEGNA LIGURIA PIEMONTE PUGLIA CAMPANIA

MARCHE 0,1347989 ---- 0,9422323 0,94223 0,80074351 0,842758215 1,0879962 1,0879961 1,0879962 0,822447 1,087996178

EMILIA

ROMAGNA 0,1424222 no ---- 0,76932 0,58758509 0,643667219 0,9422323 0,9422323 0,9422323 0,616835 0,942232329

VENETO 0,1675843 no no ---- 0,58758509 0,643667219 0,9422323 0,9422323 0,9422323 0,616835 0,942232329

LAZIO 0,1919325 no no no ---- 0,409506884 0,8007435 0,8007435 0,8007435 0,365889 0,800743505

LOMBARDIA 0,1955414 no no no no ---- 0,8427582 0,8427582 0,8427582 0,450473 0,842758215

SARDEGNA 0,2002651 no no no no no ---- 1,0879961 1,0879962 0,822447 1,087996178

LIGURIA 0,2047139 no no no no no no ---- 1,0879962 0,822447 1,087996178

PIEMONTE 0,2062922 no no no no no no no ---- 0,822447 1,087996178

PUGLIA 0,595032 no no no yes no no no no ---- 0,822447804

CAMPANIA 20,711096 yes yes yes yes yes yes yes yes yes ----

ANALISI

VARIANZA

Ʃ 4 IPA

pianura

Origine della

variazione SQ gdl MQ F

Valore di

significatività F crit

Tra gruppi 405,88 9 45,0986 223,8181 3,19408E-20 1,51902

In gruppi 4,6326 23 0,20149

Totale 410,22 32

Risultati dell’ analisi statistica tra i diversi

habitat di provenienza del miele

Ʃ 4 IPA

Differenza statisticamente

significativa tra Puglia e Lazio

L’ANOVA test applicato ai campioni di miele aggregati nei gruppi a prescindere dalla provenienza regionale non ha evidenziato differenze statisticamente significative

Il presente studio ha evidenziato come il miele di produzione

nazionale non rappresenti un rischio limitatamente alla

presenza di IPA.

Reg. n. 1881/2006

B(a)P Ʃ 4 IPA

1,0 µg/kg 1,0 µg/kg

Campioni di miele

B(a)P 76 % dei casi < LOD (0,03 µg/kg)

Concentrazione max 0,1 µg/kg

Ʃ 4 IPA Mediana 0,19 µg/kg

Concentrazione max: in cinque

campioni > 1,0 µg/kg

Tenori massimi per alimenti

ritenuti sensibili a cui il miele

può essere associato

Conclusioni

Il miele ha confermato la sua validità di bioindicatore della presenza degli

IPA nell’habitat di produzione.

Fornisce indicazioni sulle sorgenti di contaminazioni ambientali da IPA ed

anche su eventuali contaminazioni puntuali e/o temporanee.

Sotto il profilo sanitario, limitatamente ad ingestione di alimenti, non sono

emerse situazioni di particolare rischio per la salute umana, nonostante la

crescente preoccupazione per alcune aree del nostro paese caratterizzate

da livelli elevati di IPA.

Il metodo analitico sviluppato durante la presente ricerca si è dimostrato

pienamente adeguato allo scopo.

Prospettive future:

Saranno presi in considerazione altri campioni di miele provenienti da

altre zone del territorio nazionale , che consentiranno una mappatura più

dettagliata del nostro paese.

Continui monitoraggi al fine di verificare variazioni nel tempo dello

stato di inquinamento da IPA.