IISS “Mattei” – Rosignano S. (LI)IISS “Mattei” – Rosignano S. (LI)

Laboratorio di BIOLOGIALaboratorio di BIOLOGIAclasse IV-V A LICEO TECNOLOGICOclasse IV-V A LICEO TECNOLOGICO

ProvaProva N.1 N.1slide n. slide n. 2424

ESTRAZIONE dei PIGMENTI ESTRAZIONE dei PIGMENTI FOTOSINTETICIFOTOSINTETICI

FOGLIE di SPINACIO FOGLIE di SPINACIO (SPINACIA OLERACEA L.)(SPINACIA OLERACEA L.)

N.4 barattoli di vetroN.4 barattoli di vetro (500ml) (500ml) con tappocon tappo

(camera CROMATOGRAFICA)(camera CROMATOGRAFICA)

mortaio + pestellomortaio + pestello

Materiali e StrumentiMateriali e Strumenti

matitamatita

HH22OO

forbiceforbice

stuzzicadenti stuzzicadenti per spiediniper spiedini

nastro adesivonastro adesivo

etichette di etichette di carta adesivacarta adesiva

CARTA DA CARTA DA FILTRO FILTRO

assorbenteassorbente

alcool etilico alcool etilico denaturato al denaturato al

95%95%

cucchiaicucchiaioo

FASE PRELIMINAREFASE PRELIMINARE: : etichettare il materiale occorrenteetichettare il materiale occorrente

FASE I FASE I : : estrazione dei pigmentiestrazione dei pigmenti

FASE II:FASE II: preparare la camera cromatografica e la fase preparare la camera cromatografica e la fase stazionariastazionaria

FASE III:FASE III: filtrare il miscugliofiltrare il miscuglio

FASE IV:FASE IV: separazione dei pigmentiseparazione dei pigmenti

FASE V:FASE V: osservare i risultatiosservare i risultati

FASI della PROVA di LABORATORIOFASI della PROVA di LABORATORIO

1) METODICA SEMPLICE1) METODICA SEMPLICE

foglie + alcool

camera cromatografi

ca

filtrato foglie + acqua

Fase PRELIMINARE: ETICHETTARE IL MATERIALE OCCORRENTEFase PRELIMINARE: ETICHETTARE IL MATERIALE OCCORRENTE

n.1n.1 n.3n.3 n.3n.3 n.4n.4

spezzettare le foglie di spinacio spezzettare le foglie di spinacio mettere le foglie spezzettate nel mortaio e aggiungere un mettere le foglie spezzettate nel mortaio e aggiungere un

po’ dipo’ disolvente (circa 40 ml di alcool etilico)solvente (circa 40 ml di alcool etilico) schiacciare il materiale con il pestello fino ad ottenere un schiacciare il materiale con il pestello fino ad ottenere un

omogenato e continuare finché quest’ ultimo assume una omogenato e continuare finché quest’ ultimo assume una colorazione verde scurocolorazione verde scurol’estrazione dei pigmenti si considera completa quando il l’estrazione dei pigmenti si considera completa quando il residuo nel mortaio e’ completamente biancoresiduo nel mortaio e’ completamente bianco

(l’ acetone o l’alcool etilico estrae i pigmenti dalle foglie degli (l’ acetone o l’alcool etilico estrae i pigmenti dalle foglie degli spinaci)spinaci)

inserire l’ omogenato nel barattolo n.1 e coprire con alcool inserire l’ omogenato nel barattolo n.1 e coprire con alcool etilicoetilico

mescolare e premere sulle foglie con un cucchiaio mescolare e premere sulle foglie con un cucchiaio chiudere il barattolo con il tappochiudere il barattolo con il tappo attendere circa 15-30 m. attendere circa 15-30 m.

SUGGERIMENTI: SUGGERIMENTI: per un’estrazione dei pigmenti completa, eseguire le fasi per un’estrazione dei pigmenti completa, eseguire le fasi

descritte in precedenza un giorno, oppure immergere il descritte in precedenza un giorno, oppure immergere il barattolo, contenente le foglie di spinacio con il solvente, in barattolo, contenente le foglie di spinacio con il solvente, in

una pentola con acqua che precedentemente è stata bollita a una pentola con acqua che precedentemente è stata bollita a 100° c100° c

Fase 1: ESTRAZIONE DEI PIGMENTIFase 1: ESTRAZIONE DEI PIGMENTI

CLOROFLLA aCLOROFLLA aCC5555HH7272OO55NN44MgMg

La clorofilla rappresentata è la La clorofilla rappresentata è la clorofilla aclorofilla a, cioè il principale , cioè il principale

pigmento fotosintetico di tutti gli pigmento fotosintetico di tutti gli organismi fotosintetizzanti. organismi fotosintetizzanti.

E’ costituita da un anello E’ costituita da un anello tetrapirrolico tetrapirrolico polarepolare con al centro con al centro

un atomo di un atomo di magnesiomagnesio, che si , che si scioglie nell’alcool, a cui è legata scioglie nell’alcool, a cui è legata una catena idrocarburica apolare una catena idrocarburica apolare

di un alcool a 20 C, il di un alcool a 20 C, il FITOLOFITOLO

spezzare uno stuzzicadenti ed incastrarlo ai bordi internamente al barattolo di vetro n. 3 (camera

cromatografica)

tagliare una striscia di carta da filtro

Fase n. 2: PREPARARE LA CAMERA CROMATOGRAFICA E LA FASE STAZIONARIA

Fase n. 3: FILTRARE IL MISCUGLIO

FILTRAZIONE N.1FILTRAZIONE N.1

Filtrare l’omogenato, con l’ausilio di una garza o di un colino, Filtrare l’omogenato, con l’ausilio di una garza o di un colino, in un barattolo (n. 4) in un barattolo (n. 4)

Un ulteriore separazione può essere eseguita Un ulteriore separazione può essere eseguita trasferendo il filtrato n.1 in un imbuto di trasferendo il filtrato n.1 in un imbuto di carta da filtro assorbente, adagiato in un carta da filtro assorbente, adagiato in un

imbuto di plastica o di vetro su di un imbuto di plastica o di vetro su di un barattolo di vetro (n.5)barattolo di vetro (n.5)

Quello che si ottiene e’ il filtrato n. 2Quello che si ottiene e’ il filtrato n. 2

FILTRAZIONE N.2FILTRAZIONE N.2

la FILTRAZIONEla FILTRAZIONE

la filtrazione è la tecnica che si utilizza per separare i la filtrazione è la tecnica che si utilizza per separare i componenti solidi da miscugli liquidi o gassosicomponenti solidi da miscugli liquidi o gassosi

si utilizzano particolari filtri di carta assorbente, si utilizzano particolari filtri di carta assorbente, opportunamente piegati a forma di cono, che, inseriti in opportunamente piegati a forma di cono, che, inseriti in un apposito imbuto, permettono il passaggio della parte un apposito imbuto, permettono il passaggio della parte liquida, liquida, il filtratoil filtrato, mentre trattengono il residuo solido. , mentre trattengono il residuo solido.

il soluto viene trattenuto dal filtro in quanto le particelle il soluto viene trattenuto dal filtro in quanto le particelle con dimensioni maggiori dei pori della carta non riescono con dimensioni maggiori dei pori della carta non riescono

ad attraversarla. ad attraversarla.

inserire un po’ inserire un po’ (circa 20- 30 ml) (circa 20- 30 ml) di filtrato nel barattolo di filtrato nel barattolo n. 3n. 3

posizionare la carta da filtro verticalmente all’ interno posizionare la carta da filtro verticalmente all’ interno del barattolo contenente il filtrato, in modo che peschi del barattolo contenente il filtrato, in modo che peschi nella soluzione stessanella soluzione stessaavvolgere la carta da filtro allo stuzzicadenti, fissandola avvolgere la carta da filtro allo stuzzicadenti, fissandola con nastro adesivo con nastro adesivo chiudere il barattolo chiudere il barattolo osservareosservare estrarre la striscia di carta prima che il solvente estrarre la striscia di carta prima che il solvente raggiunga il bordo superioreraggiunga il bordo superiore

Fase n. 4: SEPARAZIONE dei PIGMENTI

Con questa esperienza è stato possibile dimostrare che Con questa esperienza è stato possibile dimostrare che nelle foglie verdi sono presenti in realtà più sostanze nelle foglie verdi sono presenti in realtà più sostanze

colorate, anche se a prima vista sembra che ne sia colorate, anche se a prima vista sembra che ne sia presente una sola di colore verde: la clorofillapresente una sola di colore verde: la clorofilla

CONCLUSIONI

2) METODICA CLASSICA2) METODICA CLASSICA

Preparare una miscela di benzina, etere di petrolio e Preparare una miscela di benzina, etere di petrolio e acetone nel rapporto 10:2,5:2 e versarla sul fondo della acetone nel rapporto 10:2,5:2 e versarla sul fondo della

vaschetta di vetro così da riempirla per circa 1-2 cm. vaschetta di vetro così da riempirla per circa 1-2 cm.

Coprire ermeticamente e attendere che l’aria all’interno Coprire ermeticamente e attendere che l’aria all’interno si saturi di vapore. si saturi di vapore.

Durante l’attesa, tagliuzzare con le forbici alcune foglie Durante l’attesa, tagliuzzare con le forbici alcune foglie verdi, pestarle in un mortaio insieme a 30 ml di acetone verdi, pestarle in un mortaio insieme a 30 ml di acetone fin quando si forma una soluzione intensamente colorata fin quando si forma una soluzione intensamente colorata

di verdedi verde

Filtrare la soluzioneFiltrare la soluzione

Con la pipetta Pauster prelevare una piccola quantità Con la pipetta Pauster prelevare una piccola quantità della soluzione e deporne una goccia ad un’estremità della soluzione e deporne una goccia ad un’estremità

della striscia di carta, a circa 2-3 cm dal bordo. della striscia di carta, a circa 2-3 cm dal bordo.

Asciugare con il phon (non troppo vicino) o attendere Asciugare con il phon (non troppo vicino) o attendere alcuni minuti, quindi deporre un’ altra goccia nello stesso alcuni minuti, quindi deporre un’ altra goccia nello stesso

punto punto

ESTRAZIONE DEI PIGMENTI FOTOSINTETICIESTRAZIONE DEI PIGMENTI FOTOSINTETICI

Ripetere più volte questa operazione fin quando il Ripetere più volte questa operazione fin quando il miscuglio deposto non sia intensamente colorato in verdemiscuglio deposto non sia intensamente colorato in verde

Far attenzione a che la carta sia ben asciutta tra una Far attenzione a che la carta sia ben asciutta tra una deposizione e la successiva, al fine di non allargare troppo deposizione e la successiva, al fine di non allargare troppo

la zona di deposizionela zona di deposizione

Aprire la vaschetta e, nel minor tempo possibile, Aprire la vaschetta e, nel minor tempo possibile, attaccare con il nastro adesivo l’estremità della striscia, attaccare con il nastro adesivo l’estremità della striscia, in cui non è stato deposto il campione, alla parete della in cui non è stato deposto il campione, alla parete della vaschetta, in modo tale che la striscia sia parzialmente vaschetta, in modo tale che la striscia sia parzialmente

immersa nella miscela presente sul fondo. immersa nella miscela presente sul fondo.

Fare attenzione a che la zona di deposito del campione Fare attenzione a che la zona di deposito del campione non sia immersa nella miscela presente sul fondo non sia immersa nella miscela presente sul fondo

ma disti da questa 0,5-1 cm. ma disti da questa 0,5-1 cm.

Richiudere e attendere 30’. Trascorso questo tempo, Richiudere e attendere 30’. Trascorso questo tempo, aprire la camera, estrarre la striscia ed osservarlaaprire la camera, estrarre la striscia ed osservarla

FRONTE DEL FRONTE DEL SOLVENTESOLVENTE

BANDA GIALLO- ARANCIONE: BANDA GIALLO- ARANCIONE:

carotenicaroteni

BANDA GIALLO- LIMONE: BANDA GIALLO- LIMONE:

xantofillexantofille

BANDA VERDE- BANDA VERDE- AZZURRO: AZZURRO:

clorofilla a clorofilla a

BANDA VERDE- GIALLO: BANDA VERDE- GIALLO:

clorofilla bclorofilla b

Zona di deposizione del campioneZona di deposizione del campione

RISULTATIRISULTATI

sulla carta appaiono, già dopo 5-10’ che è stata deposta sulla carta appaiono, già dopo 5-10’ che è stata deposta nella vaschetta, alcune bande colorate dall’alto al basso nella vaschetta, alcune bande colorate dall’alto al basso

(dalla zona più lontana al punto di deposizione):(dalla zona più lontana al punto di deposizione):

banda giallo-arancione banda giallo-arancione (più idrofoba)(più idrofoba)= caroteni = caroteni

banda giallo-limone= xantofillebanda giallo-limone= xantofille

banda verde-azzurro= clorofilla abanda verde-azzurro= clorofilla a

banda verde-giallo= clorofilla bbanda verde-giallo= clorofilla b

DISCUSSIONE RISULTATIDISCUSSIONE RISULTATI

Il termine cromatografia è usato per indicare un gruppo di Il termine cromatografia è usato per indicare un gruppo di tecniche separative che hanno alcune caratteristiche in tecniche separative che hanno alcune caratteristiche in

comune.comune.

La principale caratteristica è che in tutte si ha la La principale caratteristica è che in tutte si ha la possibilità di separare da una miscuglio omogeneo i vari possibilità di separare da una miscuglio omogeneo i vari

costituenti in base alla migrazione differenziale dei costituenti in base alla migrazione differenziale dei componenti della miscela stessa. componenti della miscela stessa.

La separazione è resa possibile dal fatto che i vari La separazione è resa possibile dal fatto che i vari componenti si distribuiscono in modo diverso tra una fase componenti si distribuiscono in modo diverso tra una fase fissa (detta fase stazionaria) ed una fase mobile (eluente) fissa (detta fase stazionaria) ed una fase mobile (eluente) che, per capillarità, trascina i componenti del miscuglio.che, per capillarità, trascina i componenti del miscuglio.

Precisamente il composto idrofobo si moverà più Precisamente il composto idrofobo si moverà più velocemente, mentre il composto idrofilo si muoverà più velocemente, mentre il composto idrofilo si muoverà più lentamente perché tenderà a legarsi alle lentamente perché tenderà a legarsi alle molecole di cellulosa che costituiscono la fase fissa. molecole di cellulosa che costituiscono la fase fissa.

Al termine di questo processo i composti risulteranno Al termine di questo processo i composti risulteranno separati, con il composto idrofobo molto più distante dal separati, con il composto idrofobo molto più distante dal punto di deposizione iniziale del miscuglio e il composto punto di deposizione iniziale del miscuglio e il composto idrofilo più prossimo invece a tale puntoidrofilo più prossimo invece a tale punto

La CROMATOGRAFIALa CROMATOGRAFIA

Nella cromatografia su carta la fase fissa idrofila è costituita dalla cellulosa delle fibre della carta e la fase mobile idrofoba è un eluente organico (un solvente puro oppure una miscela di solventi) immiscibile con l’acqua

esempio acetone o alcool etilico.

CROMATOGRAFIA su CARTACROMATOGRAFIA su CARTA

Oltre alla cromatografia su carta esistono altri tipi di cromatografia:

1.Cromatografia su colonna

2.Gas-cromatografia

  Se però alcuni di questi tubi sono molto sottili, cioè dei Se però alcuni di questi tubi sono molto sottili, cioè dei tubi tubi capillaricapillari (della dimensione di un capello), (della dimensione di un capello), l'acqua l'acqua

raggiunge in essi un' altezza maggiore. Il livello raggiunto raggiunge in essi un' altezza maggiore. Il livello raggiunto dall' acqua è tanto più alto quanto  più il tubicino è sottile. dall' acqua è tanto più alto quanto  più il tubicino è sottile.

  si chiama capillarità il fenomeno  per cui in un si chiama capillarità il fenomeno  per cui in un tubo capillare l'acqua raggiunge un' altezza tubo capillare l'acqua raggiunge un' altezza

maggiore quanto più piccolo è il diametro del maggiore quanto più piccolo è il diametro del tubo tubo

La CAPILLARITA’La CAPILLARITA’

Considerando un insieme di tubi di vetro Considerando un insieme di tubi di vetro posti verticalmente in un recipiente posti verticalmente in un recipiente

contenente acqua, ci accorgiamo che se i contenente acqua, ci accorgiamo che se i tubi hanno un diametro interno tubi hanno un diametro interno

abbastanza grande l' acqua raggiunge in abbastanza grande l' acqua raggiunge in tutti la stessa altezza (uguale a quella tutti la stessa altezza (uguale a quella

dell' acqua nel recipiente).dell' acqua nel recipiente).

I I PLASTIDI sono organuli citoplasmatici tipici della cellula PLASTIDI sono organuli citoplasmatici tipici della cellula eucariotica vegetale.eucariotica vegetale.

Sono abbastanza grandi che possono raggiungere un Sono abbastanza grandi che possono raggiungere un diametro di 3diametro di 3÷ 6 micron e quando vengono osservati al ÷ 6 micron e quando vengono osservati al

microscopio ottico, appaiono cospicui non soltanto per le microscopio ottico, appaiono cospicui non soltanto per le loro dimensioni ma perchè contengono spesso pigmenti loro dimensioni ma perchè contengono spesso pigmenti

(sostanze colorate) (sostanze colorate)

Il microscopio elettronico mostra che i plastidi come i Il microscopio elettronico mostra che i plastidi come i mitocondri sono racchiusi da una doppia membrana. mitocondri sono racchiusi da una doppia membrana.

Si ditinguono in:Si ditinguono in:

CLOROPLASTICLOROPLASTI

CROMOPLASTICROMOPLASTI

(LEUCOPLASTI) AMILOPLASTI(LEUCOPLASTI) AMILOPLASTI

I PLASTIDII PLASTIDI

i CLOROPLASTI contengono il pigmento verde clorofilla e i CLOROPLASTI contengono il pigmento verde clorofilla e svolgono la fotosintesisvolgono la fotosintesi

I CROMOPLASTI contengono i pigmenti gialli o arancioni o rossi I CROMOPLASTI contengono i pigmenti gialli o arancioni o rossi detti carotenoidi (pigmenti liposolubili) che sono affini alla detti carotenoidi (pigmenti liposolubili) che sono affini alla

vitamina a e in realta’ ne sono la fontevitamina a e in realta’ ne sono la fonte

i cromoplasti si sviluppano dai cloroplasti invecchiati mal ridotti i cromoplasti si sviluppano dai cloroplasti invecchiati mal ridotti prima della caduta della foglia o durante la maturazione dei prima della caduta della foglia o durante la maturazione dei

frutti con un processo di modificazione che implica una perdita di frutti con un processo di modificazione che implica una perdita di clorofilla e vasti cambiamenti strutturali:. Sono presenti nei clorofilla e vasti cambiamenti strutturali:. Sono presenti nei

petali di moti fiori, nella buccia di vari frutti, nelle foglie petali di moti fiori, nella buccia di vari frutti, nelle foglie ingiallite o nelle radici di alcune piante (carota)ingiallite o nelle radici di alcune piante (carota)

GLI AMILOPLASTI sono detti anche leucoplasti, presenti nelle GLI AMILOPLASTI sono detti anche leucoplasti, presenti nelle cellule non-verdi, sono plastidi incolori che convertono lo cellule non-verdi, sono plastidi incolori che convertono lo

zucchero in granuli di amido, che vengono accumulati come zucchero in granuli di amido, che vengono accumulati come riserva di energia per le future necessità della pianta. La patata, riserva di energia per le future necessità della pianta. La patata,

per esempio, ne è molto riccaper esempio, ne è molto ricca

1.1. CLOROPLASTICLOROPLASTI

2.2. CROMOPLASTICROMOPLASTI

3.3. AMILOPLASTI AMILOPLASTI (LEUCOPLASTI)(LEUCOPLASTI)

I cloroplasti, nelle piante I cloroplasti, nelle piante superiori, sono piccoli e superiori, sono piccoli e

numerosi ed hanno numerosi ed hanno generalmente una forma generalmente una forma ovoidale con un diametro ovoidale con un diametro

massimo di 3-10 massimo di 3-10 m.m.La struttura interna di un La struttura interna di un

cloroplasto mostra cloroplasto mostra evidenti relazioni con evidenti relazioni con

quella che è la sua quella che è la sua funzione fotosinteticafunzione fotosintetica

Struttura del CLOROPLASTIStruttura del CLOROPLASTI

Se, infatti, si osserva un cloroplasto al microscopio Se, infatti, si osserva un cloroplasto al microscopio elettronico, all'interno del rivestimento esterno, costituito elettronico, all'interno del rivestimento esterno, costituito da una doppia membrana, si nota una serie di membrane da una doppia membrana, si nota una serie di membrane

sovrapposte e collegate fra loro in modo da ottenere il sovrapposte e collegate fra loro in modo da ottenere il massimo sviluppo di area superficiale: sono le membrane massimo sviluppo di area superficiale: sono le membrane

fotosintetiche, quelle in cui si trovano "ancorati" i fotosintetiche, quelle in cui si trovano "ancorati" i pigmenti destinati a catturare la luce solare.pigmenti destinati a catturare la luce solare.

CLOROPLASTCLOROPLASTO O all’interno all’interno della cellula della cellula

vegetalevegetale

Ultrastruttura del CLOROPLASTOUltrastruttura del CLOROPLASTO

Ad un ingrandimento maggiore, queste membrane si mostrano Ad un ingrandimento maggiore, queste membrane si mostrano ripiegate su se stesse a formare tante vescicole, dette ripiegate su se stesse a formare tante vescicole, dette TILACOIDITILACOIDI, ,

tutti intercomunicanti e continue tra di loro a costituire un tutti intercomunicanti e continue tra di loro a costituire un sistema di membrane chiuso. sistema di membrane chiuso.

I I TILACOIDI TILACOIDI sono immersi sono immersi in una matrice, detta in una matrice, detta

stromastroma, caratterizzata da , caratterizzata da un alto contenuto di un alto contenuto di

proteine (specialmente proteine (specialmente enzimi, tra i quali quelli enzimi, tra i quali quelli

destinati a formare i destinati a formare i carboidrati)carboidrati)

Il sistema tilacoidale, di Il sistema tilacoidale, di conseguenza, delimita due conseguenza, delimita due

ambienti plastidiali:ambienti plastidiali:1.1.ambiente extratilacoidale ambiente extratilacoidale

(stromatico) (stromatico)2.2.ambiente intratilacoidale ambiente intratilacoidale

(luminale) (luminale)