HPLC

Laboratorio di Chimica Organica 2 - Prof. Cristina Cimarelli

L27 - CHIMICA - AA 2014-2015

versatilità

buone risoluzioni

alta sensibilità

non distruttiva

velocità di analisi

colonne riutilizzabili

HPLC

qualitativa & quantitativa

HPLC

colonne impaccate con particelle di piccole dimensioni

alte pressioni applicate in testa alla colonna

alta efficienza

High Pressure Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography

HPLC

LC HPLC

Lunghezza della colonna 23 cm 23 cm

Diametro della colonna 1.2 cm 1.2 cm

Quantità di campione 0.5 mL 0.5 mL

Dimensione delle particelle 100 m 10 m

Pressione 0.5 psi 400 psi

Tempo 3h 10’ 20’

Velocità di flusso 0.2 mL/min 2 mL/min

Risoluzione incompleta completa

LC HPLC

HPLC - STRUMENTAZIONE

COLLETTORE DI FRAZIONI

MISURATORE DI FLUSSO

PRE-COLONNA e/o COLONNA

INIETTORE

POMPE

RISERVA DI SOLVENTE

SISTEMA DI GRADIENTE

RIVELATORE

REGISTRATORE

DATA SYSTEM

300-7000 psi 20-480 atm

1 psi = 0.068 atm = 6.894 kPa

può contenere accessori per•riscaldare•degassare•agitare

il solvente o la miscela di solventi

HPLC - STRUMENTAZIONE

REQUISITI DELLO STRUMENTO:

•massima resistenza alla corrosione

•resistenza ad alte pressioni di testa e flussi elevati

•volumi morti minimi in connessioni, iniettore, rivelatori

•velocità di flusso costante con precisione < 0.2% tR

HPLC - STRUMENTAZIONE

POMPA: è fondamentale per ottenere una velocità di flusso costante

velocità costante riproducibilità dei tR

Le pompe a pistone sono le più utilizzate, ma producono un flusso pulsato, che

interferisce con i rivelatori. Di solito i cromatografi con pompe a pistone sono

muniti anche di uno smorzatore di flusso.

Alternativamente, per smorzare

il flusso, si mettono alcuni

pistoni in serie, con moti

sfalsati, così da mediare l’uscita

del flusso.

HPLC - STRUMENTAZIONE

GRADIENTE

eluizione

isocraticacomposizione della fase mobile

costante nel tempo

gradiente composizione della fase mobile variabile

1 pompa x ogni solvente+

camera di mescolamento

apparecchio di miscelazione+

pompa

HPLC - STRUMENTAZIONE

INIETTORE

iniezione

diretta in colonna o pre-colonna

iniezione

con valvoleautomatizzato x analisi in serie

= trasferimento del campione nel loop per portarlo alla pressione di esercizio del cromatografo

= la rotazione di una valvola devia il flusso della fase mobile nel loop e trasporta il campione in colonna

caricamento

HPLC - STRUMENTAZIONE

COLONNE

forno termostatico

ad acqua

ad aria

•la colonna•il rivelatore

proprietà dell’analita influenzate da T

contiene

Uso Diametro (cm)

Lunghezza (cm)

Quantità di campione

Microanalisi 1-2 3-7 10-50 g

Analisi 3-5 10-25 100-200 g

Separazione 10-20 25-50 1-200 mg

COLONNEfasi con particelle di forma irregolare - 20-60 m

fasi con particelle microsferiche - 3-10 m

HPLC - STRUMENTAZIONE

RIVELATORI

RIVELATORI

distruttivi

non distruttivi

UNIVERSALI

misurano variazioni delle

proprietà del’eluato dipendenti

dalla composizione

SELETTIVI (x classi di composti)

misurano proprietà chimiche e/o

fisiche del soluto

SPECIFICI

rivelano solo composti con

determinate caratteristiche

•indice di rifrazione•calore d’assorbimento•ionizzazione di fiamma

•UV•fluorescenza•elettrochimici•conduttività elettrolitica•polarografici

•radioattività•chirali

HPLC

elevata sensibilità

monitoraggio continuodell’effluente della colonna

versatilità

linearità di risposta

risposta a tutti i tipi di composti

linea di base stabile

RIVELATORE

insensibilità alle variazioni di flusso e temperatura

basso livello di rumore

HPLC

SENSIBILITA’

RIVELATORE

LINEARITA’ accuratezza del’analisi quantitativa

RUMORE perturbazione della linea di base

massima sensibilità

concentrazione minima rivelabile dell’analita

ASSOLUTAvalore minimo della grandezza misurata che determina la deflessione a fondo scala del registratore, ad un dato valore del rumore di fondo

caratteristiche costruttive

RELATIVAminima concentrazione di soluto eluito che può essere chiaramente distinta dal rumore

SEGNALE/RUMORE = 2

PICCO IDENTIFICABILE

HPLC

Tipo di rivelatoreSensibilità assoluta

(rumore 1%)Sensibilità relativa

Indice di rifrazione 10-5 5 x 10-7g/mL

Assorbimento UV 5 x 10-3 10-9- 5 x 10-10g/mL

Calore di adsorbimento 5 x 10-3 10-9g/s

Fluorescenza - 10-9g/mL

Conduttività 5 x 10-2 10-8g/mL

Polarografia 2 x 10-8 10-9g/mL

Ionizzazione di fiamma 10-11 10-9g/s

RIVELATORI

HPLC

Rivelatore a indice di rifrazione

•non distruttivo

•stabile

l’indice di rifrazione del solvente cambia in presenza di un soluto

•risente delle variazioni di flusso, di pressione e di temperatura

•non è utilizzabile in gradiente

•Analisi di carboidrati senza particolari cromofori non contengono ioni non danno fluorescenza

•Alcoli alifatici

•Prodotti di idrolisi degli amidi

HPLC

Rivelatore UV

•non distruttivo

•stabile

assorbimento dell’analita nella regione UV-Vis

•risente delle variazioni di flusso, di pressione e di temperatura

•non è utilizzabile in gradiente

A fissa (254 nm - lampada al mercurio - più sensibile, meno versatile)

solventi adeguati

A variabile (190-350 nm - lampada al deuterio - continuo o stopped)

A diode array (190-350 nm - lampade a deuterio o xeno

•spettro UV in continuo dell’eluato) identificazione dei soluti

• tipiche

purezza = rapporto di assorbimento a diverse

•può essere usato con flussi pulsati (gradiente)

•buona linearitàinsensibile al flusso

poco sensibile a T

HPLC

Rivelatore di fluorescenza

composti o derivati fluorescenti più sensibile, meno versatile

scelta in base allo spettro di fluorescenza dell’analita

di solito abbinato ad UV o indice di rifrazione

usato in medicina legale perché estremamente sensibile

HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI

FASE STAZIONARIASTABILITA’ TERMICA

INERZIA VERSO SOLVENTI & SOLUTI

Silice non derivatizzata

FASE DIRETTA Si

OH

isolato(più attivo)

Si

O

O

H

Si

OH

legato

Si O Si

O

silossano (idrofobico)

Si

O

O

H

Si

O

OHH

H

silanolo disattivato con acqua

•stabilità in un intervallo limitato di pH

•variazione dell’acidità da tipo a tipo ritenzione di soluti acidi e basici

•adsorbimento irreversibile di analiti polari silici funzionalizzate

•controllo stretto delle quantità di H2O per avere maggiore riproducibilità

•riequilibrio lento al cambiamento della fase mobile

HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI

Si OH

Si

Si

Si

OH

OH

OH

silice

Si

CH3

(CH2)17CH3

CH3

Cl

organosilano

Si O

Si

Si

Si

OH

OH

O

SiMe2(CH2)17CH3

SiMe2(CH2)17CH3

fase inversa

+

X3-nSiRR’n 1 ≤ n ≤ 3

R = n-alchile, fenile, cianoalchileR’ = metileX = gruppo uscente: cloro, alcossi, dialchilammino

Silice derivatizzata

HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI

= seconda funzionalizzazione con

organosilani con gruppi più piccoli (TMSCl, HMDS)

legami a idrogeno interazioni dipolo-dipolo con composti polari

perdita di risoluzione

endcapping

SVANTAGGI

2 < stabilità < pH 8

fasi polimeriche (polimeri stirene-divinilbenzene)

idrolisi deilegami silossanici a bassi pH

dissoluzione della silice a pH elevati

gruppi silanolo: debolmente acidi

HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI

meccanismo di ritenzione

Repulsione della fase acquosa mobile piuttosto che interazione con la fase fissa

IDROFOBICO

SOLVOFOBICO

Fasi mobili non polari Fasi fortiContengono una maggior proporzione di solvente organico

Fasi mobili polari Fasi deboliInducono il soluto a legarsi alla fase stazionariatempi di ritenzione lunghi

Variazioni di PhInfluiscono sui tempi di ritenzione, perché le molecole di soluto ionizzate interagiscono più fortemente con la fase mobile e vengono eluite prima.

HPLC SEPARATIVO

dipende da

cromatografia analitica

risoluzionevelocità

SCALA SEMIPREPARATIVA 100-200 mg

cromatografia preparativa

risoluzionevelocità

capacità di caricamento

SCALA PREPARATIVA 0.5-1 g 1 Kg

diametro e lunghezza della colonna

dipende da

quantità di componente isolata per unità di tempo

dimensioni della colonna velocità di flusso

SCALA ANALITICA 1-10 mg

dimensioni delle particelle

densità di impaccamento

industriale

HPLC

Diametro interno

2 mm 8 mm 23 mm

Separazione Difficile ( < 1.2) 1 mg 20 mg 100 mg

Facile ( > 1.2) 10-50 mg 200-1000 mg 1-5 g

COLONNE

HPLC SEPARATIVO

volumi iniettati troppo alticampioni poco solubili

sovraccaricamento della colonna

campioni troppo concentrati

precipitazioni in colonna

campioni solubili

campione poco solubile nella fase mobile

COSTANZA DEI VOLUMIDI RITENZIONE

DI VOLUME

DI MASSA effetti di dispersioneil soluto si distribuisce lungo la fase stazionaria la banda si allarga

sovraccaricamento della colonna